专利名称：一种提取质粒的试剂和方法
技术领域：
本发明涉及分子生物医学领域的质粒提取，尤其涉及在质粒提取中去除内毒素的试剂和方法。
背景技术：
质粒DNA是基因工程最常见的运载体，它可以把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达。因此质粒提取的质量对后续的分子生物学实验的成功与否起着关键的作用。目前许多国内外公司都研发和提供了质粒提取试剂盒，但这些试剂盒提取质粒时，需要经过繁琐的步骤，耗时长。且试剂盒中采用许多有毒化学物质，即污染环境又会威胁到操作者的健康。内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，是一种脂多糖，在化学结构上主要包括两部分，即多糖和类脂A。其中类脂A是活性中心，也是毒性的基础，主要有氨基葡萄糖、磷酸10、18碳的长脂肪酸组成，在生理条件下具有疏水性和电负性。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来。内毒素是热源物质，一旦含有内毒素的物质注入动物体内可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等毒性作用。内毒素在高温、强酸、强碱条件下都非常稳定。当前的医学规定每毫克质粒中内毒素含量小于100EU时可用于人体。在分子生物学实验中，内毒素的存在会降低质粒转化效率和细胞表达的效率。因此在质粒提取过程中，降低内毒素的含量是质粒提取的重要步骤之一。在传统的碱裂解法提取质粒的方法中，所得到`的质粒中含有大量的内毒素，会影响到后期的一系列实验。在传统的质粒提取方法中，需要有冰浴的步骤。这个步骤不仅增加了质粒提取的复杂程度、增加了额外的设备，同时也延长了质粒提取的时间。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的目的之一是:一种提取质粒DNA的试剂，包括:细胞悬浮液、细胞裂解液、缓冲液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、质粒结合液和内毒素去除颗粒溶液，其中:细胞悬浮液包括2mmol/L KH2PO4,1OmmoI/L Na2HPO4.12H20，137mmol/L NaCl，2.7mmol/LKCl, I % Tween20, pH6.0-8.0，使用前加入 RNase A 并混合均匀，4°C贮存，以超纯水为溶剂；细胞裂解液包括0.1-2.5mol/L NaOH，质量体积百分比为0.05% -1%的SDS’以超纯水为溶剂，室温密闭贮存；缓冲液包括0.1-0.5mol/L(NH4)2HPO4 -NH4H2PO470.5_3mol/L KCl，pH3_5，以超纯水为溶剂，室温密闭贮存；洗涤液I包括2-8M GuHCl,200m mol/L Tris，2M EDTA, 1.5mol/L NaCl，pH6.8_7.0，以超纯水为溶剂，室温密闭贮存；洗涤液2包括50-100%乙醇；洗脱液为dH20 ;内毒素去除颗粒溶液包括IOmg/ml能与内毒素特异性结合的复合颗粒，含有0.02%叠氮钠的20mM Tris-HCl，pH为7.5 ;质粒结合液包括2-8M GuHCl, 10-50mM HEPES, pH6.8-8.2，以超纯水为溶剂。进一步的，复合颗粒包括能与内毒素特异性结合的特异性结合物和用于承载该特异性结合物的载体。
更进一步的，特异性结合物选自以下的至少一种:(1)能特异性结合内毒素的多肽；2)能特异性结合内毒素的多克隆抗体、或单克隆抗体、或多克隆抗体和单克隆抗体的混合物。
内毒素去除颗粒溶液可以包括多肽和载体的复合颗粒，或抗体和载体的复合颗粒，或多肽和载体的复合颗粒与抗体和载体的复合颗的混合物。进一步的，所述能特异性结合内毒素的多肽选自以下序列的至少一种:序列 I keegldhsnrkn fklnrkliif fegrrikgnk序列 2 gkpsegqpse sqpsesgdsg qsspskdeng kqpektp。进一步的，载体选自琼脂糖凝胶颗粒、磁珠颗粒、乳胶颗粒或胶体金颗粒。更进一步的，特异性结合物和载体之间以1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳二亚胺或N-羟基琥珀酼亚胺作为偶联剂。在一优选的方案中，提取质粒DNA的试剂还包括内毒素去除液，所述内毒去除溶液包括 2-85mM Tris,0.5-10% TritonX-114, ρΗ8.0,以超纯水为溶剂。本发明的目的之二是:提取质粒DNA的方法，包括以下步骤:(I)取2_4ml在培养基中培养8-16小时的菌液，12，OOOXg离心I分钟，弃尽上清；(2)加250 μ I细胞悬浮液以悬浮步骤I中的细菌，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；(3)向步骤2的细胞悬浮液中加入250 μ I细胞裂解液，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，步骤3操作时间不超过5分钟；(4)向步骤3中的透亮溶液中加350 μ I缓冲液，温和并充分地上下翻转混合6_8次，12，000 Xg离心10分钟；(5)吸取步骤4中的离心上清并转移到质粒提取制备管，12，OOOXg离心I分钟，弃滤液；(6)将制备管置回离心管，加500 μ I洗涤液I，12，000 Xg离心I分钟，弃滤液；(7)将制备管置回离心管，加700 μ I洗涤液2，12，OOOXg离心I分钟，弃滤液；再次加入700 μ I洗涤液2洗涤一次，12，000 X g离心I分钟，弃滤液；(8)将制备管置回2ml离心管中，12，000 X g离心I分钟；(9)将制备管移入新的1.5ml离心管中，在制备管中央加150 μ I洗脱液，室温静置I分钟，12，OOOXg离心I分钟；(10)弃制备管，加入内毒素去除颗粒溶液50 μ 1，颠倒混匀5分钟，I, OOOxg离心20秒；(11)小心吸取上清液150 μ I至一干净离心管中，加入质粒结合液300 μ 1，混合均匀；(12)将步骤11的混合液加入至一无内毒素制备管中，12，OOOXg离心I分钟；(13)将制备管置回离心管，加700 μ I洗涤液2，12，000 Xg离心I分钟，弃滤液；再次加入700 μ I洗涤液2洗涤一次，12，000 X g离心I分钟，弃滤液；(14)将制备管置回2ml离心管中，12，000 X g离心I分钟；(15)将制备管置于一干净的新离心管中；
(16)在制备管中加入60 μ I洗脱液以溶解质粒DNA，室温静置I分钟，12，OOOXg离心I分钟，得质粒。优选的方案中，在步骤11加入质粒结合液前，还包括以下步骤:在加入内毒素去除颗粒溶液并混匀后，加入内毒素去除液，剧烈混合I分钟；将离心管置于42°C I分钟后，12，OOOxg离心2分钟，溶液分为无色上相和蓝色下相；小心吸取无色上相于一干净离心管中，加入质粒结合液；所述内毒素去除溶液包括2-85mM Tris,0.5-10% TritonX-114,pH8.0，以超纯水为溶剂。本发明的有益效果是:利用本发明所述的含有内毒素去除颗粒溶液的试剂和方法可以特异性地结合质粒中的内毒素，并通过后续的步骤将其去除。其操作步骤简单、耗时短。利用内毒素去除颗粒能特异性结合内毒素的特点，实现快速分离和去除内毒素的效果。所获得的质粒DNA产量高、纯度好，所得的质粒每毫克中内毒素含量低于0.1EU/ μ g以下，符合临床标准，可以用于内毒素敏感细胞系，如Huh-7等的转染操作。利用本发明所述的内毒素去除液能将内毒素溶解在有机相中，而质粒溶解在水相中，这样通过分相就可以进一步地将有机相中的内毒素与水相中的质粒分开，回收的质粒纯度高、浓度高，每毫克质粒中内毒素含量低于50EU，可以运用于显微注射或者基因疫苗。利用本发明所述的含有 去除内毒素试剂的质粒提取试剂和方法，提取得到的质粒纯度高，提取步骤简单，操作条件温和，没有极端的例如冰浴的步骤。
图1是采用本发明所述方法提取质粒和采用现有技术所提取的质粒的电泳对照图。
具体实施例方式下面结合具体附图对本发明进行详细的说明。这些具体的实施例仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案。实施例1去除质粒中内毒素的试剂及其配制方法去除质粒中内毒素的试剂包括内毒素去除颗粒溶液，所述溶液中包括能与内毒素特异性结合的复合颗粒。该复合颗粒包括能与内毒素特异性结合的特异性结合物和用于承载该特异性结合物的载体。所述特异性结合物选自以下的至少一种:(I)能特异性结合内毒素的多肽；2)能特异性结合内毒素的抗体。所述能特异性结合内毒素的多肽序列选自以下序列的至少一种:序列 I keegldhsnrkn fklnrkliif fegrrikgnk ；序列 2 gkpsegqpse sqpsesgdsg qsspskdeng kqpektp。所述的抗体包括但不限于多克隆抗体、或单克隆抗体或它们的混合物，例如兔多克隆抗体、鼠单抗等。所述载体包括但不限于琼脂糖凝胶颗粒、磁珠颗粒、乳胶颗粒或胶体金颗粒。
内毒素去除颗粒溶液包括多肽和载体的复合颗粒，或抗体和载体的复合颗粒，或多肽和载体的复合颗粒与抗体和载体的复合颗的混合物制备包含能特异性结合内毒素的多肽和磁珠复合颗粒的方法包括:以1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳二亚胺(EDC)作为偶联剂，将能特异性结合内毒素的多肽(序列I)偶联于包被了羧基的磁珠上，其中每I毫克磁珠中含有10微克多肽。所得复合颗粒的结合能力为Iyg内毒素/mg磁珠，即Img磁珠上含有的10微克多肽能够结合I微克的内毒素。将结合了多肽的复合磁珠保存在含有0.02%叠氮钠的20mM Tris-HCl, pH为7.5的溶液中，并且所述复合磁珠在该溶液中的浓度为10mg/ml。制备包含能特异性结合内毒素的多肽和琼脂糖复合颗粒的方法包括:直接将能特异性结合内毒素的多肽(序列2)偶联于N-羟基琥珀酼亚胺活化的琼脂糖表面，例如琼脂糖选用商品名NHS -ACTS印harose，货号90-1004-00的琼脂糖。其中每I克琼脂糖中含有30毫克多肽，其结合能力为3mg内毒素/g琼脂糖，即I克琼脂糖上含有的30毫克多肽能够结合3毫克的内毒素。将结合了多肽的复合琼脂糖保存在含有0.02%叠氮钠的20mMTris-HCl, pH为7.5的溶液中，并且所述复合琼脂糖在该溶液中的浓度为10mg/ml。制备包含能特异性结合内毒素的多克隆兔抗体和磁珠复合颗粒的方法包括:以1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)作为偶联剂，将能结合内毒素的多克隆兔抗体偶联于包被了氨基的磁珠上，其中每I毫克磁珠中含有0.1毫克多抗，其结合能力为2 μ g内毒素/mg磁珠。将结合了多抗的复合磁珠保存在含0.02%叠氮钠、0.1 % BSA的20mMTris-HCl, pH7.5的溶液。复合磁珠溶液终浓度为10mg/ml。制备包含能特异性结合内毒素的多克隆兔抗体和琼脂糖复合颗粒的方法包括:直接将能结合内毒素的多克隆兔抗体偶联于N-羟基琥珀酼亚胺活化的琼脂糖表面。例如琼脂糖选用商品名NHS-ACTS印harose，货号90-1004-00的琼脂糖。其中每I克琼脂糖中含有300毫克多抗，其结合能力为2mg内毒素/g复合琼脂糖。将结合了多抗的复合琼脂糖保存在含0.02%叠氮钠、0.1% BSA的20mM Tris-HCl, pH7.5的溶液。复合琼脂糖溶液终浓度为 10mg/mlo在优选的方案中去除质粒中内毒素的试剂中还包括内毒素去除液。所述内毒素去除液包括2mM Tris, 0.5% TritonX-114, pH8.0，以超纯水为溶剂。在另一个方案中内毒素去除液包括85mM Tris, 10% TritonX-114, pH8.0,以超纯水为溶剂。实施例2质粒提取试剂及其制备方法本实施例所述的用于提取质粒的试剂包括:细胞悬浮液；细胞裂解液；缓冲液；洗涤液I ;洗涤液2 ;洗脱液；内毒素去除颗粒溶液；质粒结合液。其中:细胞悬浮液包括2mmol/L KH2PO4,1OmmoI/L Na2HPO4.12H20，137mmol/L NaCl,
2.7mmol/L KC1,1% Tween20, pH6.0-8.0 ;使用前往上述混合液中加入RNase A，混合均匀，4°C贮存。以超纯水为溶剂。细胞裂解液包括0.lmol/L NaOH, 0.05% SDS (质量体积百分比)，以超纯水为溶
齐U。室温密闭贮存。缓冲液包括0.1moVL(NH4)2HPO4.NH4H2PO4,0.5mol/L KCl，pH 为 3，以超纯水为溶
齐U。室温密闭贮存。洗涤液I 包括 2M GuHCl，200m mol/L Tri s’ 2M EDTA, 1.5mol/LNaCl，pH6.8，以超纯水为溶剂，室温密闭贮存。洗涤液2包括50 %乙醇。洗脱液为dH20。内毒素去除颗粒溶液为实施例1中所述的溶液。质粒结合液包括2M GuHCl, IOmM HEPES, pH6.8，以超纯水为溶剂，室温密闭贮存。实施例3添加了内毒素去除液的质粒提取试剂及其制备方法本实施例所述的提取质粒的试剂包括:细胞悬浮液；细胞裂解液；缓冲液；洗涤液I ;洗涤液2 ;洗脱液；内毒素去除颗粒溶液；质粒结合液；内毒素去除液。细胞悬浮液包括2mmol/L KH2PO4,1OmmoI/L Na2HPO4.12H20，137mmol/L NaCl,
2.7mmol/L KC1,1% Tween20, pH6.0-8.0 ;使用前往上述混合液中加入RNase A，混合均匀，4°C贮存。以超纯水为溶剂。细胞裂解液包括2.5mol/L NaOH, I %的SDS (质量体积百分比)，以超纯水为溶剂。室温密闭贮存。
缓冲液包括0.5moI/L (NH4)2HPO4.NH4H2PO4, 3mol/L KCl，pH 为 53，以超纯水为溶
齐U。室温密闭贮存。洗涤液I 包括 8M GuHCl,200m mol/L Tris,2M EDTA,1.5mol/LNaCl,3mol/LGuHCl, pH7.0，以超纯水为溶剂，室温密闭贮存。洗涤液2包括100%乙醇。洗脱液为dH20。内毒素去除颗粒溶液为实施例1中所述的溶液。质粒结合液包括8M GuHCl, 50mM HEPES, pH8.2，以超纯水为溶剂，室温密闭贮存。内毒素去除液为实施例1中所述的溶液。实施例4利用实施例2所述试剂提取质粒的方法提取方法包括以下步骤:(I)取2-4ml在培养基中培养过夜(8-16小时)的菌液，12，OOOXg离心I分钟，
弃尽上清；(2)加本发明所述250μ I细胞悬浮液悬浮步骤I中的细菌，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；(3)向步骤2的细胞悬浮液中加入250 μ I细胞裂解液，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5分钟；(4)向步骤3中的透亮溶液中加本发明所述350 μ I缓冲液，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12，000 X g离心10分钟；(5)吸取步骤4中的离心上清并转移到质粒提取制备管，12，OOOXg离心I分钟，弃滤液；(6)将制备管置回离心管，加本发明所述500μ I洗涤液1，12，OOOXg离心I分钟，
弃滤液；(7)将制备管置回离心管，加本发明所述700 μ I洗涤液2，12，000 Xg离心I分钟，弃滤液；以同样的方法再用700 μ I洗涤液2洗涤一次，弃滤液；(8)将制备管置回2ml离心管中，12，000 X g离心I分钟；
(9)将制备管移入新的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加本发明所述150μ I洗脱液，室温静置1分钟，12，000 X g离心I分钟；(10)弃制备管，加入本发明所述内毒素去除颗粒溶液50 μ 1，颠倒混匀5分钟，1, OOOxg 离心 20 秒；(11)小心吸取上清液150 μ 1至一干净离心管中，加入本发明所述质粒结合液300 μ 1，混合均匀；(12)将步骤11的混合液加入至一无内毒素制备管中，12，OOOXg离心1分钟；(13)将制备管置回离心管，加本发明所述700μ 1洗涤液2，12，OOOXg离心1分钟，弃滤液；以同样的方法再用700 μ I洗涤液2洗涤一次，弃滤液；(14)将制备管置回2ml离心管中，12，000 X g离心1分钟；(15)将制备管置于一干净的新离心管中；(16)在制备管中加入本发明所述60 μ 1洗脱液溶解质粒DNA，室温静置1分钟，12，OOOXg离心1分钟，得质粒DNA。实施例5利用实施例3所述试剂提取质粒的方法提取方法包括以下步骤:(1)取2ml在培养基中培养过夜(8-16小时)的菌液，12，OOOXg离心1分钟，弃
尽上清；(2)加本发明所述250μ 1细胞悬浮液悬浮步骤I中的细菌，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；(3)向步骤2的细胞悬浮液中加入本发明所述250 μ I细胞裂解液，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5分钟；(4)向步骤3中的透亮溶液中加本发明所述350 μ 1缓冲液，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12，000 X g离心10分钟；(5)吸取步骤4中的离心上清并转移到质粒提取制备管，12，OOOXg离心1分钟，弃滤液；(6)将制备管置回离心管，加本发明所述500μ I洗涤液1，12，OOOXg离心I分钟，
弃滤液；(7)将制备管置回离心管，加本发明所述700 μ 1洗涤液2，12，000 Xg离心I分钟，弃滤液；以同样的方法再用700 μ 1洗涤液2洗涤一次，弃滤液；(8)将制备管置回2ml离心管中，12，OOOXg离心I分钟；(9)将制备管移入新的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加本发明所述150μ I洗脱液，室温静置1分钟，12，000 X g离心I分钟；(10)弃制备管，加入本发明所述内毒素去除颗粒溶液50 μ 1，颠倒混匀5分钟，
I,OOOxg 离心 20 秒；(11)小心吸取上清液150 μ 1至一干净离心管中，加入本发明所述150 μ 1内毒素去除液，剧烈混合1分钟；(12)将离心管置于42°C 1分钟后，12，OOOxg离心2分钟,溶液分为无色水上相和蓝色有机下相；(13)小心吸取无色上相于一干净离心管中，加入本发明所述质粒结合液300μ 1，混合均勻；(14)将步骤13的混合液加入至一无内毒素的制备管中，12，OOOXg离心I分钟；(15)将制备管置回离心管，加本发明所述700μ I洗涤液2，12，OOOXg离心I分钟，弃滤液；以同样的方法再用700 μ I洗涤液2洗涤一次，弃滤液；(16)将制备管置回2ml离心管中，12，000 X g离心I分钟；(17)将制备管置于一干净的新离心管中；(15)在制备管中加入本发明所述60μ I洗脱液溶解质粒DNA，室温静置I分钟。12，000Xg离心I分钟。实施例6比较实验I
分别利用实施例4所述的方法和杭州百迈生物技术有限公司的KBM MagPUre质粒提取试剂盒(该试剂盒不含内毒素去除试剂)提取TB培养基中培养过夜(8-16小时)的菌液中的质粒。经测定，利用本发明含有内毒素去除颗粒溶液的质粒提取试剂所提取的质粒中内毒素的含量为0.035EU/ug，低于0.1EU/μ g质粒。而利用KMB试剂盒所提取的质粒中，内毒素含量高达102.6EU/ug。实验结果表明，利用本发明所述的试剂和提取方法能有效降低质粒中内毒素的含量，可以直接转染内毒素敏感细胞系，如Huh-7。实施例7比较实验2方案1:利用杭州百迈生物技术有限公司的KBM MagPure质粒提取试剂盒(不含内毒素去除试剂)，提取TB培养基中培养过夜(8-16小时)的菌液中的质粒DNA。测定所提取质粒中的内毒素含量。方案2:利用实施例4所述的方法，提取TB培养基中培养过夜(8-16小时)的菌液中的质粒DNA。测定所提取质粒中的内毒素含量。方案3:利用实施例5所述的方法，提取TB培养基中培养过夜(8-16小时)的菌液中的质粒DNA。测定所提取质粒中的内毒素含量。经测定，依照方案I所提取的质粒中，内毒素的含量为107.8EU/ug。依照方案2所提取的质粒中，内毒素的含量降至0.052EU/ug。依照方案3所提取的质粒中，内毒素含量仅为0.0WEU/yg质粒，低于0.lEU/yg质粒。实验结果表明，利用本发明的含有内毒素去除颗粒溶液的质粒提取试剂所提质粒中的内毒素含量低。而当同时使用了内毒素去除液后，所提取的质粒中的内毒素含量又进一步降低，所获得的质粒可以直接用于动物实验的DNA疫苗显微注射。
实施例8分别利用实施例5所述的方法和杭州百迈生物技术有限公司的KBM MagPure质粒提取试剂盒提取YT培养基中培养过夜(8-16小时)的菌液中的质粒。如图1所示的质粒DNA电泳图谱，M为DL1000分子量，I为利用KMB试剂盒所提取的质粒图谱。2是利用本发明所述质粒提取试剂和方法提取的质粒图谱。图中清晰地表明，两种提取方法所提取的质粒在纯度和产量上有明显区别。本发明所述试剂和方法提取的质粒远优于传统的质粒提取方法。通过测定，本发明所述的无内毒素质粒提取试剂盒提取的质粒含量为40 μ g，远高于目前市场所售产品的提取率，并且内毒素含量仅为0.021EU/u g°
实施例9利用包被二氧化硅的磁珠颗粒代替制备管提取大肠杆菌中的质粒的提取方法，包括以下步骤:(I)取2ml在TB培养基中培养过夜(8-16小时)的菌液，12，000 X g离心I分钟，
弃尽上清；(2)加本发明所述250μ I细胞悬浮液悬浮步骤I中的细菌，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；(3)向步骤2的细胞悬浮液中加入本发明所述250 μ I细胞裂解液，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5分钟；(4)向步骤3中的透亮溶液中加本发明所述350 μ I中和液，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12，000 X g离心10分钟；(5)吸取步骤4中的离心上清并转移到干净离心管中，加入IOOul 10mg/ml 二氧化硅包被的磁珠颗粒和300ul异丙醇，颠倒混匀；(6)将离心管置于磁力架上，静置I分钟吸附磁珠，将上清吸弃。(7)移除磁力架，加500 μ I洗涤液I，颠倒混匀5次。(8)将离心管置于磁力架上，静置I分钟吸附磁珠，将上清吸弃。(9)移除磁力架，加700 μ I洗涤液2，颠倒混匀5次；(10)将离心管置于磁力架上，静置I分钟吸附磁珠，将上清吸弃；(11)重复步骤 9-10;(12)将离心管在空气中干燥10分钟；(13)移除磁力架，加本发明所述150μ I洗脱液，颠倒混匀5次，室温静置I分钟；(14)将上清转移至一干净离心管中，加入本发明所述内毒素去除颗粒溶液50 μ I,颠倒混匀5分钟；(15)加入本发明所述200μ I内毒素去除液，用力颠倒混匀；(16)将离心管置于42°C I分钟后，12，OOOxg离心2分钟，溶液至上而下分为无色水上相、蓝色有机下相和磁珠层；(17)小心吸取无色上相于一干净离心管中，加入质粒结合液300μ 1，再加入IOOul 10mg/ml 二氧化硅包被的磁珠颗粒和200 μ I异丙醇，混合均匀；(18)将离心管置于磁力架上，静置I分钟吸附磁珠，将上清吸弃；(19)移除磁力架，加700 μ I洗涤液2，颠倒混匀5次；(20)将离心管置于磁力架上，静置I分钟吸附磁珠，将上清吸弃；(21)将离 心管在空气中干燥10分钟；(22)移除磁力架，加本发明所述60 μ I洗脱液，颠倒混匀5次，室温静置I分钟。所得质粒中内毒素含量很低，符合医学使用标准。提取的操作步骤简单。
、序列表
<110>杭州百迈生物技术有限公司
<120一种提取质粒的试剂和方法 <130>
<!60>2
<170>Patentln version 3.5
<210>I
<211>32 <212> PRT <213>人工序列
400 I
Lys Gln Glu Gly Leu Asp His Ser Asn Arg Lys Asn Phe Lys Leu Asn 151015
Arg Lys Leo He He Phe Phe Glu Gly Arg Arg He Lys Gly Asn Lys202530
<210> 2 <211> 37 <212> PRT <213〉人工序列
2
Gly Lys Pro Ser Glu Gly Gln Pro Ser Glu Ser Gln Pro Ser Glu Ser
I51015
Gly Asp Ser Gly GIn Ser Ser Pro Ser Lys Asp Glu Asn Gly Lys Gln202530
Fro Glu Lys Thr Pm 3权利要求
1.一种提取质粒DNA的试剂，其特征在于包括: 细胞悬浮液、细胞裂解液、缓冲液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、质粒结合液和内毒素去除颗粒溶液，其中:细胞悬浮液包括 2mmol/L KH2PO4,1OmmoI/L Na2HPO4.12H20,137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KC1,1% Tween20, pH6.0-8.0，使用前加入RNase A并混合均匀，4°C贮存，以超纯水为溶剂； 细胞裂解液包括0.1-2.5mol/L NaOH，质量体积百分比为0.05% -1%的SDS，以超纯水为溶剂，室温密闭贮存；缓冲液包括 0.1-0.5moI/L (NH4)2HPO4.NH4H2PO4,0.5_3mol/L KCl，pH3_5，以超纯水为溶齐U，室温密闭贮存；洗涤液 I 包括 2-8M GuHCl, 200m mol/L Tris,2M EDTA, 1.5mol/LNaCl, ρΗ6.8-7.0，以超纯水为溶剂，室温密闭贮存； 洗涤液2包括50-100%乙醇； 洗脱液为dH20 ； 内毒素去除颗粒溶液包括10mg/ml能与内毒素特异性结合的复合颗粒，含有0.02%叠氮钠的 20mM Tris-HCl，pH 为 7.5 ; 质粒结合液包括2-8M GuHCl, 10-50mM HEPES, pH6.8-8.2，以超纯水为溶剂。
2.根据权利要求 1所述的试剂，其特征在于，复合颗粒包括能与内毒素特异性结合的特异性结合物和用于承载该特异性结合物的载体。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，特异性结合物选自以下的至少一种:(I)能特异性结合内毒素的多肽；2)能特异性结合内毒素的多克隆抗体、或单克隆抗体、或多克隆抗体和单克隆抗体的混合物。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，内毒素去除颗粒溶液包括多肽和载体的复合颗粒，或抗体和载体的复合颗粒，或多肽和载体的复合颗粒与抗体和载体的复合颗的混合物。
5.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述能特异性结合内毒素的多肽选自以下序列的至少一种:序列 lkeegldhsnrkn fklnrkliif fegrrikgnk序列 2gkpsegqpse sqpsesgdsg qsspskdeng kqpektp。
6.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，载体选自琼脂糖凝胶颗粒、磁珠颗粒、乳胶颗粒或胶体金颗粒。
7.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，特异性结合物和载体之间以1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳二亚胺或N-羟基琥珀酼亚胺作为偶联剂。
8.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，还包括内毒素去除液，所述内毒去除溶液包括 2-85mM Tris,0.5-10% TritonX-114, ρΗ8.0,以超纯水为溶剂。
9.一种利用权利要求1至8之一所述的试剂提取质粒DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)取2-4ml在培养基中培养8-16小时的菌液，12，OOOXg离心I分钟，弃尽上清； (2)加250μI细胞悬浮液以悬浮步骤I中的细菌，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；(3)向步骤2的细胞悬浮液中加入250μ I细胞裂解液，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，操作时间不超过5分钟； (4)向步骤3中的透亮溶液中加350μ I缓冲液，温和并充分地上下翻转混合6-8次，,12，OOOXg离心10分钟； (5)吸取步骤4中的离心上清并转移到质粒提取制备管，12，000Xg离心I分钟，弃滤液； (6)将制备管置回离心管，加500μ I洗涤液1，12，OOOXg离心I分钟，弃滤液； (7)将制备管置回离心管，加700μ I洗涤液2，12，OOOXg离心I分钟，弃滤液；再次加Λ 700 μ I洗涤液2洗涤一次，12，000 X g离心I分钟，弃滤液； (8)将制备管置回2ml离心管中，12，000Xg离心I分钟； (9)将制备管移入新的1.5ml离心管中，在制备管中央加150 μ I洗脱液，室温静置I分钟，12，000 Xg离心I分钟； (10)弃制备管,往离心管中加入内毒素去除颗粒溶液50μ I,颠倒混匀5分钟，I, OOOxg离心20秒； (11)小心吸取上清液150μ I至一干净离心管中，加入质粒结合液300 μ 1，混合均匀； (12)将步骤11的混合液加入至一无内毒素制备管中，12，OOOXg离心I分钟； (13)将制备管置回离心管，加700μ I洗涤液2，12，000 Xg离心I分钟，弃滤液；再次加入700 μ I洗涤液2洗涤一次，12，OOOXg离心I分钟，弃滤液； (14)将制备管置回2ml离心管中，12，000Xg离心I分钟； (15)将制备管置于一干净的新离心管中； (16)在制备管中加入60μ I洗脱液以溶解质粒DNA，室温静置I分钟，12，000 X g离心I分钟，得质粒。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，加入内毒素去除颗粒溶液并混匀后，力口入内毒素去除液，剧烈混合I分钟；将离心管置于42°c I分钟后，12，OOOxg离心2分钟,溶液分为无色上相和蓝色下相；小心吸取无色上相于一干净离心管中，加入质粒结合液；所述内毒素去除溶液包括2-85mM Tris,0.5-10% Trito nX-114, pH8.0,以超纯水为溶剂。
全文摘要
本发明提供了一种提取质粒的试剂和方法，它包括细菌裂解液、内毒素去除颗粒溶液、内毒素去除液、质粒结合液、洗涤液和洗脱液等试剂。利用本发明所述试剂和方法提取质粒，其操作步骤简单，提取所消耗的时间短，能有效降低所提取质粒中的内毒素含量，所提取的质粒中内毒素的含量可降至0.1EU/μg以下，符合临床标准，获得的质粒DNA产量高，纯度好。
文档编号C12N15/10GK103173438SQ20131012508
公开日2013年6月26日 申请日期2013年4月10日 优先权日2013年4月10日
发明者林源吉, 吕航 申请人:杭州百迈生物技术有限公司