主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片的制备和使用方法

主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片的制备和使用方法
【专利摘要】本发明涉及基于化学发光技术平台的主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片的制备和使用方法。本发明的基因芯片可以用于检测蚊媒传播的病毒12种、寄生虫7种。包含检测蚊媒病毒的14条特异性引物和13条特异性寡核苷酸探针；检测蚊媒寄生虫的6条特异性引物和8条特异性寡核苷酸探针。病毒和寄生虫探针分别分布在载体上。本发明包括了基因芯片的制备方法：1.引物探针设计合成芯片的制备。本发明还包括了基因芯片的使用方法：1.蚊媒病毒RNA和寄生虫质粒的提取；2.多重RT-PCR/PCR扩增；3.芯片杂交；4.杂交后清洗；5.标记；6.芯片扫描；7.数据分析。本发明具有快速、高通量、高灵敏度、高特异性的特点。
【专利说明】主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片的制备和使用方 法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片的制备和使用方法，属 生物芯片领域。

【背景技术】
[0002] 蚊媒病毒是一类通过节肢动物蚊类传播给恒温脊椎动物的病毒。各种病毒有着不 同的蚊类传播载体。当这类节肢动物叮咬感染了该类病毒的宿主时，其本身就可能携带该 类病毒，并通过叮咬方式传播给下一个病毒宿主。蚊类之间也可以通过交尾或繁殖而水平 或垂直传播。蚊媒病毒主要分为三个科，分别是：披膜病毒科、黄病毒科、布尼亚病毒科。而 其中在全球范围内影响最大的几种病毒包括：黄病毒属登革热病毒（DENV)、日本脑炎病毒 (JEV)、黄热病病毒（YFV)、西尼罗河病毒（WNV)、甲病毒属基孔贡亚热病毒（CHIKV)等。在 我国，蚊媒病原体是高温、草地、丛林等战区尤其是边境地区重要的传染病病原体，其引起 的多种传染病严重影响部队作战能力和人民日常生活。
[0003] 目前已确定的黄病毒属病毒超过70种。黄病毒属的病毒均为小型的有包膜病毒， 病毒基因组大小约为Ilkb长的单股正链RNA。黄病毒基因组只有一个开放的读码框用来编 石马 3 种结构蛋白（capsid protein、premembrane/membrane protein、envelope protein) 和7种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。这些多聚蛋白是在共同翻译 后由宿主的蛋白酶和病毒的丝氨酸蛋白酶经过翻译后切割而形成独立蛋白。三种结构蛋 白中衣壳蛋白（capsid protein)形成病毒RNA的核衣壳；病毒的外壳则由前膜/膜蛋白 (premembrane/membrane protein)和夕卜膜蛋白(envelope protein)共同形成。夕卜膜蛋白 为黄病毒属抗原蛋白，与病毒侵入和攻击宿主细胞有关。前膜蛋白（premembrane protein) 是使外膜蛋白折叠为适当结构的关键蛋白，病毒在宿主细胞中成熟前由成对碱性氨基酸蛋 白酶切割而形成膜蛋白（membrane protein)。
[0004] 甲病毒属病毒属于披膜病毒科家族，包含28种病毒。甲病毒属病毒为单股正链 RNA病毒，基因组长度约为11. 5kb，包含两个开放读码框编码4种非结构蛋白和5种结构蛋 白。上游的开放读码框编码4种非结构蛋白（nspl-4)，而下游的开发读码框编码病毒结构 蛋白（capsid)和糖蛋白（E3、E2、6K、E1)。非结构蛋白由正链基因组RNA翻译，发挥转录全 长负链RNA的作用。翻译的nspl-3多聚蛋白由位于nsp3和nsp4之间的终止子终止；当翻 译通过nsp3和nsp4连接位置时产生nspl-4多聚蛋白。值得注意的是，甲病毒属的一些病 毒如西门利克森林病毒、Sindbis等的终止子由正链的密码子替代。负链RNA对于26S亚 基因组mRNA等附加的基因组RNA来说是一种临时的状态。26S启动子位于负链RNA两个开 放读码框之间由非结构蛋白识别并转录为亚基因组mRNA，随后由这些亚基因组mRNA翻译 成结构蛋白的多聚蛋白。26S mRNA的产量为基因组的10倍。随后，多聚的结构蛋白经过翻 译后切割形成capsid protein和2种成熟的envelope糖蛋白（El和E2)。
[0005] 随着气候变暖、人口流动性增加、城市化等因素的影响，经常导致蚊媒病毒流行范 围的扩大和突然爆发。1999年美国纽约爆发的WNV导致大量的乌鸦等鸟类的死亡。2012 年美国德克萨斯爆发的WNV造成1868人感染病例，其中89人死亡，共带来4700万美元的 经济损失。2010年，中国广东东莞爆发CHIKV，导致173人感染 [15]。2005-2006年间，印度 共有130万人感染CHIKV。WHO每年记录的DENV感染病例数约90万人。而据估计，每年实 际感染DENV的病例高达3. 9亿人，而其中约9600万感染患者出现或接近出现DENV感染临 床症状，每年超过2万人因严重的DENV感染而死亡。
[0006] 除了传播上述这些常见的病毒外，蚊类携带和传播的疟原虫和淋巴系统丝虫也是 目前全球范围内最为重要的寄生虫疾病。由于广泛的流行和危害，疟疾和淋巴系统丝虫病 被列为全球最优先控制和消除的疾病。在许多热带地区，这两种疾病可以共用相同的传 播宿主也可能共同感染人体。痕原虫（malaria parasite)是痕疾（malaria)的病原体， 属于顶端复合物门，痕原虫科（Plasmodiidae) _原虫属（Plasmodium)。痕原虫的生活史 的特点包括：宿主交替（脊椎动物与吸血昆虫）与世代交替（无性生殖与有性生殖）。在 人体和其他脊椎动物的内脏组织细胞和红细胞内进行无性生殖（裂体增殖）；在吸血昆虫 体内进行有性的配子生殖和无性的孢子增殖。蚊类传播导致人疟疾的疟原虫有四种，分别 是：间日痕原虫（Plasmodium vivax)、三日痕原虫（Plasmodium malariae)、恶性痕原虫 (Plasmodium falciparum)和卵形痕原虫（Plasmodium ovale)。痕疾在非洲、亚洲和拉丁 美洲的109个国家肆虐。据报道，全球一半的人口生活在有疟疾感染风险的地区，每年有大 约2. 5亿人感染。疟疾感染每年大约导致1百万人死亡，特别是5岁以下儿童和妊娠期妇 女。丝虫属于线形动物门丝虫总科（Filarioidea)，成虫寄生于人或动物的淋巴系统、皮下 组织、体腔或心血管等部位。蚊类传播的导致淋巴系统丝虫病的丝虫有3种，分别是：班氏 丝虫（Wuchereria bancrofti)、马来丝虫（Brugia malayi)、帝汉丝虫（Brugia timori)。 全球大约有13亿人生活在有感染淋巴系统丝虫病风险的地区。仅次于疟疾，淋巴系统丝虫 病为全球范围内影响第二大的节肢动物传播疾病，每年约导致亚洲、非洲、西太平洋、部分 美洲等地区超过78个国家的1. 28亿人感染。
[0007] 蚊媒病原体这种具有从其存在地区突然传播入新地区的能力使得持续监测这类 病毒具有重要的意义。"诊"、"防"、"治"三个关键环节构成了完整的疾病预防控制链，其中 "诊"不仅是疾控链中不可缺少的关键一环，而且也是有效防治的前提，只有快速、准确的诊 断，才能有效的预防和治疗。因此，准确有效检测蚊媒病原体是控制蚊媒传染病的关键。很 多基因诊断的方法，如real-time PCR、等温扩增、基因芯片、基因测序等技术都曾经被用于 蚊媒病毒和寄生虫的检测。上述的几种方法都有着各自的优点，但是这些方法要么只能检 测少数1-2种病原体，检测范围有限；要么步骤繁琐、成本高，不利于推广应用。此外，可以 同时检测常见的蚊媒病毒和寄生虫的基因芯片方法也没有被报道过。
[0008] 基因芯片又称DNA微阵列（DNA microarray)，是最早出现的生物芯片技术。基因 芯片是基于核酸互补杂交原理建立起来的，将cDNA或寡核苷酸分子固定于载体表面。最早 的"cDNA芯片"是由斯坦福大学的Patrick Brown实验室发明的，他们利用机械臂把经过 纯化的cDNA克隆点制在玻璃载体上。芯片与荧光标记的RNA样品杂交，通过样本中被标记 的RNA与玻片上的eDNA特异性的结合，可以判断相应的基因表达水平。点制在芯片上的 DNA片段通常称为探针（Probe)，被标记并检测的RNA混合物被称为靶基因。基因芯片技术 具有快速、高通量、可靠性高、检测效率高、低成本等特点被广泛应用于表达谱分析[62]，单 核苷酸多态性分析（SNP)，疾病诊断，病原微生物检测等方面。本文目的为研发主要蚊媒病 毒和寄生虫甄别检测基因芯片试剂盒。基于化学发光检测方法，用于检测蚊媒传播的病毒 12种：登革热病毒1-4 (DENV1-4)、日本脑炎病毒（JEV)、黄热病病毒（YFV)、圣路易士脑炎病 毒（SLEV)、西尼罗河病毒（WNV)、东方马脑炎病毒（EEEV)、西方马脑炎病毒（WEEV)、委内瑞 拉马脑炎病毒（VEEV)、基孔贡亚热病毒（CHIKV);寄生虫7种：间日疟原虫（P.V)、三日疟原 虫（P. M)、恶性疟原虫（P. F)、卵形疟原虫（P. 0)、班氏丝虫（W. B)、马来丝虫（B. M)、帝汶丝虫 (B. T)。


【发明内容】

[0009] 本文目的为研发一种主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片。用于检测蚊媒 传播的病毒12种：登革热病毒1-4 (DENV1-4)、日本脑炎病毒（JEV)、黄热病病毒（YFV)、圣 路易士脑炎病毒（SLEV)、西尼罗河病毒（WNV)、东方马脑炎病毒（EEEV)、西方马脑炎病毒 (WEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV)、基孔贡亚热病毒（CHIKV);寄生虫7种：间日疟原虫 (P. V)、三日疟原虫（P. M)、恶性疟原虫（P. F)、卵形疟原虫（P. 0)、班氏丝虫（W. B)、马来丝虫 ?^、帝汶丝虫?.!')。
[0010] 本发明采用了以下技术方案：一种主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片，包 含对蚊媒病毒检测的13条特异性寡核苷酸探针（表1)、对蚊媒寄生虫检测的8条特异性寡 核苷酸探针（表2)、一条质控探针（表3)和载体，蚊媒病毒探针和寄生虫探针分别分布在 载体上。此外，在靶基因上下游保守位置设计用于蚊媒病毒和蚊媒寄生虫靶基因序列扩增 的特异性引物20条（表4、表5)。
[0011] 表1对蚊媒病毒检测的特异性寡核苷酸探针序列
[0012]

【权利要求】
1. 一种主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片，本发明的基因芯片可以用于检测蚊 媒传播的病毒12种（登革热病毒1-4、日本脑炎病毒、黄热病病毒、圣路易士脑炎病毒、西尼 罗河病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、基孔贡亚热病毒）、寄 生虫7种（间日疟原虫、三日疟原虫、恶性疟原虫、卵形疟原虫、班氏丝虫、马来丝虫、帝汶丝 虫）。其特征是包含检测蚊媒病毒的14条特异性引物和13条特异性寡核苷酸探针；检测 蚊媒寄生虫的6条特异性引物和8条特异性寡核苷酸探针；1条质控探针和载体。蚊媒病 毒探针和寄生虫探针分别分布在载体上。 对蚊媒病毒检测的特异性寡核苷酸探针序列
对蚊媒寄生虫检测的特异性寡核苷酸探针序列
质控探针
蚊媒病毒靶基因特异引物

蚊媒寄生虫靶基因特异引物
2. 根据权利1所述的主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片，其特征是所述的载体 为醛基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙稀基片、尼龙基片。
3. -种主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片的制备方法，包括以下步骤： 步骤一，探针的设计：首先从NCBI基因数据库中下载相应的病原体基因序列，由于黄 病毒属和甲病毒属病原体的基因组长度约为ll-12kb，因此下载了黄病毒属和甲病毒属病 毒的全基因组序列进行比对分析，而疟原虫属和丝虫属的7种寄生虫则分别下载了 4种疟 原虫的18s rRNA基因、班氏丝虫特有Ssp I基因、马来丝虫和帝汶丝虫特有Hha I基因进行 比对分析。序列下载完成后，使用Vector NTI AdvancelO(invitrogen)软件包中的AlignX 程序按照默认的参数设置对各病原体基因序列进行全局比对。根据比对结果在基因序列的 保守位置设计特异性寡核苷酸探针、1条片基质控探针、特异性引物。 步骤二，探针的合成，每条探针的3'端加入12个碱基T且3'末端T氨基修饰作为连 接臂，以使其能固定在醛基化修饰玻璃基片上；质控探针除3'末端T进行氨基修饰外，5'端 同时标记生物素标记； 步骤三，芯片的制备：将合成后的探针用去离子水稀释成100 U M，分别取10 y L探针溶 液，和10 U L体积芯片点样液混匀，使探针点样终浓度为50 i! M，装于384孔板，将芯片表面 贴上10样品孔阵列膜，用pixsys5000芯片制备仪（Cartesian Technologies)，采用接触式 点样方式，将探针点制在载体上，点样过程中保持一定湿度，点样完成后将芯片置于干燥器 中避光常温静置48h，使探针和芯片表面醛基脱去1分子水后共价结合，点制好的芯片常温 干燥保存。
4. 根据权利要求3所述的主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片的制备方法，其特 征是步骤一中21条特异性寡核苷酸探针以及1条片基质控探针，探针长度在18-45nt。
5. 根据权利要求3所述的主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片的制备方法，其特 征是步骤三种所述的载体为醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。
6. -种主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片的使用方法，其特征是包括以下步 骤： 步骤一，蚊媒病原体核酸的提取，使用市售商品化病毒基因组RNA提取试剂盒和寄生 在基因组DNA提取试剂盒提取病毒RNA和寄生虫DNA ; 步骤二，RT-PCR/PCR扩增：蚊媒病毒扩增使用TaKaRa的一步法RT-PCR试剂，以两组多 重RT-PCR扩增体系分别扩增蚊媒黄病毒属和甲病毒属靶基因，使用引物见表4 ;RT-PCR按 以下循环参数进行扩增：50°C反转录30min，94°C预变性2min，45个循环为94°C变性20S、 55°C退火20S、72°C延伸20S，最后72°C延伸反应5min，4°C保存或进行下一步实验。蚊媒寄 生虫扩增使用TaKaRa的PCR试剂，以一组多重PCR体系扩增蚊媒寄生虫靶基因，使用引物 见表5。PCR按以下循环参数进行扩增：95°C预变性2min，45个循环为94°C变性20S、55°C 退火20S、72°C延伸20S，最后72°C延伸反应5min，4°C保存或进行下一步实验。 步骤三，芯片杂交：将基因芯片分别置0. 2% SDS和去离子水中分别清洗30S，离心干 燥；将步骤二得到的RT-PCR产物/PCR产物在95°C变性5min后立即置于冰浴中5min，分别 取同一蚊媒病毒模版RT-PCR扩增体系一和扩增体系二产物各2. 5 ii L与5 ii L杂交液混匀， 使用加样器加于芯片加样孔使其均匀覆盖于阵列表面，将基因芯片放入杂交盒内在45°C杂 交lh。蚊媒寄生虫PCR扩增产物取5 ii L与5 ii L杂交液混匀，操作步骤同蚊媒病毒。 步骤四，杂交后清洗基因芯片：基因芯片杂交完成后，从杂交盒中取出芯片，并立即依 次在洗液1XSSC+0. 2% SDS、0. 2XSSC和0. IXSSC中各清洗30S，最后将基因芯片表明液 体离心干燥。 步骤五，样品标记：向芯片加入15 y 1标记液，用移液器涂勾后将芯片放回杂受盒中直 37°C水浴中反应30min，取出芯片以PBST清洗10s，离心干燥。 步骤六，扫描：向芯片反应区加入刚刚I : 1混合的发光液A和B的混合溶液，用移液器 涂匀后立即置化学发光成像仪中扫描，成像模式为触发模式，曝光参数511，增益参数300， 曝光时间10s，触发次数1次。 步骤六，数据分析：成像结束后使用化学发光分析软件进行芯片探针信号分析。每条 探针的信号取其三个重复点的平均值，根据探针Cutoff值，探针信号值>该探针Cutoff?值 的判读为该探针信号阳性。本发明使用方法的步骤二中RT-PCR使用的反向引物修饰分子 为生物素。本发明使用方法步骤三中使用的杂交液组分为8XSSC，0. 6% SDS，10%甲酰胺， 10XDenhardt。
7. 根据权利要求6所述的主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片的使用方法，其特 征是步骤二中使用的用于扩增蚊媒病毒和寄生虫靶基因的反相引物5'端进行修饰。
8. 根据权利要求7所述的反向引物5'端修饰分子可以是CY3、CY5、生物素。
9. 根据权利要求6所述的主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片的使用方法，其特 征是步骤三中使用的杂交液组分为8 X SSC，0. 6 % SDS，10 %甲酰胺，10 X Denhardt。
10. 根据权利要求6所述的主要蚊媒病毒和寄生虫甄别检测基因芯片的使用方法，其 特征是步骤六中使用的扫描方法，根据权利要求8中反向引物修饰分子的不同，扫描方法 包括荧光扫描，可视化扫描，化学发光扫描。
【文档编号】C12Q1/68GK104212913SQ201410336755
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】王升启, 张英杰, 刘琪琦, 陈苏红 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所