特异性结合dock8基因片段的探针、检测dock8突变情况的试剂盒及方法

特异性结合dock8基因片段的探针、检测dock8突变情况的试剂盒及方法
【专利摘要】本发明涉及基因片段突变检测领域，特别涉及特异性结合DOCK8基因片段的探针、检测DOCK8突变情况的试剂盒及方法。该特异性结合DOCK8基因片段的探针的序列如SEQ?ID?NO：1所示。本发明提供的特异性结合DOCK8基因片段的探针能够特异性结合DOCK8基因片段；本发明提供的检测方法能够准确检测DOCK8基因有无突变情况，并对突变进行准确定位。该方法不仅能筛查点突变，还能准确检测大片段缺失突变，操作简单，耗时短，外显子捕获率可达100％。
【专利说明】特异性结合D0CK8基因片段的探针、检测D0CK8突变情况的 试剂盒及方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因片段突变检测领域，特别涉及特异性结合D0CK8基因片段的探 针、检测D0CK8突变情况的试剂盒及方法。

【背景技术】
[0002] 高IgE综合征（HIES ;或Job's综合征）是一类以反复的皮肤和肺部感染、湿疹、 血清IgE水平显著升高和嗜酸性粒细胞增多为特征的原发性联合免疫缺陷病。根据遗传 方式的不同，HIES分为两类，包括常染色体显性遗传 HIES(AD-HIES)和常染色体隐性遗传 HIES (AR-HIES)。
[0003] AD-HIES患者的临床表现复杂多样，但其临床表现均有以下4个共性：①出生时或 生后不久即开始出现顽固性湿疹样皮炎；②血清IgE水平显著增高；③外周血嗜酸性粒细 胞增高；④反复发作的皮肤或肺脓肿。HIES的感染主要在皮肤和肺，皮肤脓肿因无通常所 见的红、肿、痛，因而又称之为"冷脓肿"，主要致病菌为金黄色葡萄球菌，也可为肺炎球菌、 流感嗜血杆菌及假单胞菌等。反复肺部感染可导致肺组织破坏而形成肺膨出、肺囊肿和支 气管扩张等病症。肺实质的损害导致患者易患慢性和机会性感染，包括曲霉菌属、绿脓杆 菌、卡氏肺囊虫以及非典型分枝杆菌感染等。曲霉菌属与绿脓杆菌反复感染是HIES患者死 亡的主要病因，故应引起足够重视。患儿一般无其他过敏表现，如过敏性鼻炎、荨麻疹、哮 喘。AD-HIES患者还可有免疫系统外的表现：特殊面容（前额突出、宽鼻梁、面部不对称、眼 窝深陷及双侧外眦眼距增宽）、易骨折（微小创伤即可引起）、脊柱侧弯、关节过伸、乳牙脱 落延迟及血小板增高等。目前研究认为，AD-HIES多为信号转导与转录活化因子3 (signal transducers and activators of transcription, STAT3)基因突变所致。STAT3 是一种转录 因子，可被多种细胞因子和生长因子激活，包括IL-6、IL-10、IL-22、IL-23及巨噬细胞集落 刺激因子。AD-HIES中STAT3突变干扰以上细胞因子激活的信号转导途径，从而导致免疫反 应的改变。
[0004] AR-HIES患者可与AD-HIES患者有相似的表现，如严重的特应性皮炎样皮疹，特 应性皮炎样皮疹通常为首发表现，几乎所有HIES患者在婴幼儿时期均可发生；反复细菌感 染，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等；血嗜酸性粒细胞计数及血清IgE增高。患者通常伴有 严重的过敏性疾病，如哮喘以及对食物和环境过敏原过敏等。由于AR-HIES可合并联合免 疫缺陷，因此患者可反复发生顽固的病毒感染，并可能早期并发恶性肿瘤。严重慢性皮肤 病毒感染是AR-HIES的显著特征，累及约90% AR-HIES患者。较常见的病毒为单纯疱疹病 毒（herpes simplex virus，HSV)、人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV)、巨细胞病 毒（molluscum contagiosum virus, MCV)及水痘带状疱疫病毒（varicella-zostervirus, VZV)。此外，约半数的患者发生皮肤黏膜念珠菌感染；少数患者因感染或血管病变发生 严重的中枢神经系统病变，如偏瘫、缺血性梗死等。此型HIES仅累及免疫系统，而不出现 骨骼、牙齿及结缔组织病变。多数AR-HIES患者为胞质分裂专一物8蛋白（dedicator of cytokinesis 8 protein，DOCKS)基因突变，AR-HIES患者中DOCKS缺失可引起T淋巴细胞 和Β淋巴细胞联合免疫缺陷，从而导致患者对病毒感染的抵抗力大大减弱。
[0005] D0CK8 (Dedicator of cytokinesis 8)基因定位于 9ρ24· 3,信使 RNA(mRNA)有 3 种 异构体，包括46-48个外显子，超过250kb的基因序列，编码1999-2099个氨基酸约239kDa 的D0CK8蛋白。拷贝数变异（Copy Number Variations, CNV)在D0CK8基因中广泛存在，研 究发现，D0CK8基因突变不仅有点突变，还有大片段缺失突变，且发生频率较高，导致D0CK8 蛋白微量表达或不表达，从而罹患高IgE综合征。另外，还有报道称在D0CK8基因发生大片 段缺失时患者可能会出现精神发育迟滞及发育障碍。因此，对于D0CK8基因的检测具有重 要的临床意义。目前，检测基因缺失突变的方法主要包括sanger测序法、高分辨率寡核苷 酸微矩阵比较基因组杂交法。
[0006] sanger测序法的检测原理为：提取DNA或RNA样本进行PCR扩增，产物使用一代 测序仪进行测序，得到峰图进行比对。具体步骤为：提取DNA后，利用一种DNA聚合酶来延 伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一 套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP)，并混入限量的 一种不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-0H基团，使延长 的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一 种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产 物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳 分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。聚 合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3'-0H末端，使引物延伸，合成出新的互补 DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP)，因它在脱氧核糖的3'位置 缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。如存在ddCTP、dCTP和三种其他的 dNTP (其中一种为α-32Ρ标记）的情况下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成 一种全部具有相同的5' -引物端和以ddC残基为3'端结尾的一系列长短不一片段的混合 物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度 的DNA链中C的分布提供准确信息，从而将全部C的位置确定下来。类似的方法，在ddATP、 ddGTP和ddTTP存在的条件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3 '端结尾的三组 长短不一的片段。将制得的四组混合物平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电 泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，制得相应的放射性自显影图谱。从 所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。但sanger测序法只能用于筛查点突变，无法检测 大片段缺失突变，而且由于D0CK8基因序列较长，筛查点突变非常耗时，且不够准确。
[0007] 高分辨率寡核苷酸微矩阵比较基因组杂交法的检测原理为：采用高分辨率全基因 组微阵列比较基因组杂交芯片进行检测后扫描分析杂交结果，对检测出的基因组拷贝数变 化用FISH、定量PCR或MLPA进行验证；鉴定并记录相关的基因组拷贝数变化。具体步骤为： 样本制备：使用Rsal和Alul限制性内切酶（Promega)处理基因组DNA(2-3y g)制备待检 样本DNA ;标记：随机运用cyanine-5-dUTP或青蓝3-dUTP对处理过的DNA进行标记，再使 用安捷伦的标签设备设标；纯化：Vivaspin500进行纯化（Sartorius Stedim);杂交：使用 安捷伦aCGH杂交工具包。样本于65°C涡旋40小时。在室温用0. 5父33(：(20\33(：含3皿氯 化钠，0· 3M 柠檬酸钠的 pH 值 7. 0)和(λ 005% Triton x-102(Sigma-Aldrich)清洗 5 分钟， 然后用0· 1XSSC和0.005% Triton X- 102于37°C清洗5分钟；使用Agilent扫描，数据提 取和分析均使用Agilent软件，即安捷伦的特有分析仪10. 1. 1. 1和DNA分析4. 0软件包。 缺失采用基因组Variants Build36的数据库进行分析。虽然高分辨率寡核苷酸微矩阵比较 基因组杂交法可以检测大片段缺失，但费用较高，耗时较长。
[0008] 由于采用Sanger测序法和高分辨率寡核苷酸微矩阵比较基因组杂交法检测 D0CK8大片段缺失突变情况均存在一定的缺陷，因此提供一种可准确检测D0CK8大片段缺 失突变情况的方法，具有重要的现实意义。


【发明内容】

[0009] 有鉴于此，本发明提供了特异性结合D0CK8基因片段的探针、检测D0CK8突变情况 的试剂盒及方法。该检测方法能够准备检测D0CK8突变位置，操作简单，耗时短，外显子捕 犹率超过90 *%，最商可达100 。
[0010] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0011] 本发明提供了一种特异性结合D0CK8基因片段的探针，探针的序列如SEQ ID N0 :1 所示。
[0012] 本发明还提供了一种检测D0CK8突变情况的试剂盒，包括特异性结合D0CK8基因 片段的探针和亲和素标记的磁珠；该特异性结合D0CK8基因片段的探针的序列如SEQ ID NO :1所示。
[0013] 亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组 成，对生物素有非常高的亲和力。生物素很易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合。
[0014] 在本发明提供的一些实施例中，特异性结合D0CK8基因片段的探针采用生物素标 记。
[0015] 在本发明提供的一些实施例中，亲和素为链霉亲和素。
[0016] 在本发明提供的一些实施例中，本发明提供的试剂盒还包括D0CK8基因未突变的 血液。
[0017] 作为优选，D0CK8基因未突变的血液为健康人的血液。
[0018] 本发明还提供了一种非诊断目的检测D0CK8突变情况的方法，包括如下步骤：
[0019] 取待测样本，提取全基因组DNA，富集D0CK8基因片段；
[0020] 对D0CK8基因片段测序，形成BAM文件；
[0021] 对BAM文件进行数据分析，排除SNP(单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphism)，分析插入与缺失情况，检测待测样本的D0CK8突变情况；
[0022] 所述待测样本的D0CK8基因大片段的测序深度减少至50%，所述待测样本的 D0CK8突变情况为大片段杂合缺失；
[0023] 所述待测样本的D0CK8基因大片段的测序深度减少至0 %?1 %，所述待测样本的 D0CK8突变情况为大片段纯合缺失；
[0024] 所述待测样本的D0CK8单个碱基的测序深度减少至50%，所述待测样本的D0CK8 突变情况为单个碱基杂合缺失；
[0025] 所述待测样本的D0CK8单个碱基的测序深度减少至0%?1%，所述待测样本的 D0CK8突变情况为单个碱基纯合缺失；
[0026] 所述待测样本的D0CK8单个碱基发生改变，该单个碱基的测序深度减少至50% (改变了的碱基测序深度达50% )，所述待测样本的D0CK8突变情况为单个碱基杂合突变；
[0027] 所述待测样本的D0CK8单个碱基发生改变，该单个碱基的测序深度减少至0%? 1% (改变了的碱基测序深度达99%?100% )，所述待测样本的D0CK8突变情况为单个碱 基纯合突变。
[0028] 在本发明提供的一些实施例中，富集D0CK8基因片段具体为：取特异性结合D0CK8 基因片段的探针与全基因组DNA杂交，再与亲和素标记的磁珠结合，经洗提、扩增；
[0029] 特异性结合D0CK8基因片段的探针的序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0030] 在本发明提供的一些实施例中，富集D0CK8基因片段过程具体为：
[0031] DNA与生物素化探针混合，进行PCR，PCR程序为：95°C，7min，65°C，2min ;
[0032] 加入杂交缓冲液，60°C?70°C加热20?24小时；
[0033] 作为优选，65°C加热22小时；
[0034] 1 X binding缓冲液清洗MyOne磁珠，将清洗后的磁珠加入到上述混合物混匀，孵 育10?15分钟；
[0035] 使用磁铁分离生物素化的DNA，WB1缓冲液室温清洗15分钟，WB3缓冲液在65°C清 洗三次，每次15分钟，然后对洗脱下来的DNA进行扩增。
[0036] 在富集D0CK8基因片段过程中，扩增的程序具体为：①98°C预变性30s ;②98°C变 性25s，65°C退火30s，72°C延伸30s ;循环15次；③72°C延伸5min。
[0037] 本发明的检测原理为：首先富集DOCKS基因片段，然后采用测序技术获得BAM文 件，获取生物学信息，排除SNP，分析插入与缺失情况，获得D0CK8基因突变情况。
[0038] 其中，富集D0CK8基因片段具体为：特异性结合D0CK8基因片段的探针与全基因组 DNA杂交，获得目标基因组DNA-探针杂交复合物，探针采用生物素标记，通过生物素与亲和 素之间的相互作用，目标基因组DNA-生物素化探针杂交复合物再与亲和素磁珠结合，获得 目标基因组DNA-生物素化探针-亲和素磁珠复合物，经洗提、扩增，获得D0CK8基因片段。
[0039] 排除SNP流程为：获取原始短序列；去除测序数据中的接头和低质量数据等；把短 序列定位到人类基因组数据相应的位置上，统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖 大小、平均测序深度等；在目标区域找出位点的基因型，过滤低质量值（质量值> =20)和 低覆盖度（深度> =10)的SNP ;利用（XDS (-致序列）、人类基因组数据库（NCBI36. 3)、 dbSNP(vl30)信息对SNP进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改 变、SNP功能、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等；根据疾病样品和正常样品信息，选出疾 病样品所共有的而在正常组中不存在的SNP作为候选的SNPs，在候选的SNPs中去除掉在 dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的SNP。同时，过滤掉SIFT预 测对蛋白功能无影响的SNPs作为最后疾病相关的候选SNPs。
[0040] 在本发明提供的一些实施例中，排除SNP具体为：获取原始短序列；去除测序数 据中的接头和低质量数据等；把短序列用SOAPaligner软件定位到人类基因组数据相应 的位置上，所用到参数：soap2. 20-a-b-t-v3-142-s63-ml00-x400,统计测序结果信息，短 序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；SOAPsnp用于在目标区域找出位点的基因 型，所用到参数：soapsnp-i_d-〇-r0· 00005-e0. 0001-M-t-u-L-s_2T，过滤低质量值（质量 值> =20)和低覆盖度（深度> =10)的SNP ;利用CCDS、人类基因组数据库（NCBI36. 3)、 dbSNP(vl30)信息对SNP进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改 变、SNP功能（错义突变/无义突变/可变剪切位点）、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等； 根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的SNP作为候 选的SNPs，在候选的SNPs中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项 目中出现的SNP。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的SNPs作为最后疾病相关的候 选 SNPs。
[0041] 分析插入与缺失情况流程为：把去除接头序列和低质量的测序数据比对到人类基 因组上；找出序列中所含有的插入/缺失（InDel)的信息；利用(XDS、人类基因组数据库 (NCBI36. 3)、dbSNP(vl30)信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位 点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能。
[0042] 在本发明提供的一些实施例中，分析插入与缺失情况分析流程具体为：把去除接 头序列和低质量的测序数据用Burrows-Wheeler Aligner (BWA)比对到人类基因组上，所 用到参数：bwa aln-L-131-il〇-k2-t7-e40 ;用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失 (InDel)的信息；利用CCDS、人类基因组数据库（NCBI36. 3)、dbSNP(vl30)信息对InDel进 行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影 响、InDel功能（氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变）。
[0043] 在本发明提供的一些实施例中，杂交的温度为60?70°C，所述杂交的时间为20? 24小时。
[0044] 作为优选，杂交的温度为65°C，杂交的时间为22小时。
[0045] 作为优选，测序采用的方法为二代测序技术。
[0046] 在本发明提供的一些实施例中，特异性结合D0CK8基因片段的探针采用生物素标 记。
[0047] 在本发明提供的一些实施例中，亲和素为链霉亲和素。
[0048] 在本发明提供的一些实施例中，本发明提供的检测方法还包括：取D0CK8基因未 突变的血液作为阳性对照，按照上述方法形成BAM文件，并对其进行数据分析。
[0049] 取D0CK8基因未突变的血液作为阳性对照，按照上述方法形成BAM文件，并对其 进行数据分析，具体为：取D0CK8基因未突变的血液，提取全基因组DNA，富集D0CK8基因片 段；对D0CK8基因片段测序，形成BAM文件；对BAM文件进行数据分析，排除SNP。
[0050] 设置D0CK8基因未突变的血液作为阳性对照的目的为：（1)检测血液样本是否为 D0CK8基因突变血液；（2)检测鉴定方法的准确性；（3)检测目标区域捕获的效率。
[0051] 本发明提供了特异性结合D0CK8基因片段的探针、检测D0CK8突变情况的试剂盒 及方法。该特异性结合D0CK8基因片段的探针的序列如SEQ ID N0 :1所示。本发明提供的 探针能够特异性结合D0CK8基因片段；本发明提供的检测方法能够准确检测D0CK8基因有 无突变情况，并对突变进行准确定位。该方法不仅能筛查点突变，还能准确检测大片段缺失 突变，操作简单，耗时短，外显子捕获率超过90 %，最高可达100 %。

【专利附图】

【附图说明】
[0052] 图1示实施例1中D0CK8大片段缺失突变患者血液的分析结果图；其中，横坐标表 示1至48个外显子；纵坐标表示测序深度；
[0053] 图2示实施例2中健康者血液的分析结果图；其中，横坐标表示1至48个外显子； 纵坐标表示测序深度。

【具体实施方式】
[0054] 本发明公开了特异性结合D0CK8基因片段的探针、检测D0CK8突变情况的试剂盒 及方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发 明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发 明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应 用本发明技术。
[0055] 说明书和权利要求书中所使用的缩写具体含义如下：
[0056] 缩写及英文 含义 CCDS 氨基酸数据库 dbSNP SNP数据库 HAPMAP 基因组单体型图 AW1 A型洗涤剂1号 AW2 A型洗涤剂2号 WB1 洗涤剂1号 WB3 洗涤剂2号
[0057] 本发明提供的特异性结合D0CK8基因片段的探针、检测D0CK8突变情况的试剂 盒及方法中所用试剂、磁珠等均可由市场购得。其中，DNA提取试剂盒（QIAamp DNABlood Midi Kit)购自qiagen公司，货号51185 ;液相捕获试剂购自美国生命技术公司（Life Technologies),其中包括试剂：
[0058] Binding and washing (B&ff) Buffer (2 X) ： lOmM Tris-HCl (pH7. 5), ImM EDTA, 2M NaCl (结合剂和洗涤剂（B&W)缓冲液（2X) :10mM Tris-盐酸（pH7. 5)，ImM乙二胺四乙酸， 2Mol/L氯化钠）；
[0059] Solution A :DEPC-treated0. 1M NaOH，DEPC-treatedO. 05M NaCl (试剂 A :DEPC-含 〇· 1M氢氧化钠，DEPC-含0· 05M氯化钠）；
[0060] Solution B :DEPC-treated0. 1M NaCl (试剂 B :DEPC-含 0· 1M 氯化钠）；
[0061] PBS buffer ρΗ7· 4 (PBS 缓冲液 ρΗ7· 4);
[0062] PBS/BSA(PBS，ρΗ7· 4containing0. 01% [w/v]BSA) (PBS/BSA(PBS，ρΗ7· 4 含 0· 01%
[w/v]牛血清白蛋白））；
[0063] PBST (PBS ρΗ7· 4containing0. 01 % [v/v] Tween-20 (PBST (PBS ρΗ7· 4 含 0· 01 % [v/ v] Tween-20)〇
[0064] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0065] 实施例1特异性结合D0CK8基因片段的探针的制备
[0066] 采用常规方法合成特异性结合D0CK8基因片段的探针，其序列如SEQ ID NO :1所 示，采用生物素进行标记。
[0067] 实施例2检测D0CK8突变情况的试剂盒的制备
[0068] 取实施例1制得的特异性结合D0CK8基因片段的探针，与链霉亲和素标记的磁珠 (MyOne磁珠）、购自美国生命技术公司的液相捕获试剂组装成检测D0CK8突变情况的试剂 盒。
[0069] 实施例3检测D0CK8突变情况的试剂盒的制备
[0070] 取实施例1制得的特异性结合D0CK8基因片段的探针，与链霉亲和素标记的磁珠、 购自美国生命技术公司的液相捕获试剂以及D0CK8基因未突变的血液（健康人的血液）组 装成检测D0CK8突变情况的试剂盒。
[0071] 实施例4 D0CK8突变情况的检测
[0072] 采用高分辨率寡核苷酸微矩阵比较基因组杂交法检测临床血液样本，筛选出 D0CK8大片段缺失突变患者的血液，该D0CK8大片段缺失突变患者的血液的检测结果为：11 号外显子纯和缺失，12-33号外显子杂合缺失。
[0073] 取上述筛选出的D0CK8大片段缺失突变患者的血液，使用DNA提取试剂盒提取 全基因组DNA，具体操作流程为：吸取200 μ L protease (蛋白酶）于15mL离心管内；加入 l-2mL全血，混匀；加入2. 4mL Buffer AL，充分混匀；70°C水浴10分钟；加入2mL无水乙醇， 混匀；将所得液体移入试剂盒提供的离心管离心柱中，3000rpm，3分钟；弃滤液后加入2mL AW1，5000rpm，1分钟；加入2mL AW2, 5000rpm，15min ;将离心柱移入干净的15mL离心管中加 入300 μ L Buffer AE，室温放5分钟，5000rpm，2分钟。将离心所得液体-20°C保存，即得全 基因组DNA文库。
[0074] 根据核酸分子中的嘌呤环和嘧啶环在λ = 260nm处有最大吸收值，采用紫外分光 光度法测定核酸的含量。1 μ g/mL的DNA溶液的A260nm吸收值为0. 020,1 μ g/mL的RNA溶 液的A260nm吸收值为0. 022,以此为标准，可测得溶液中的核酸含量。经检测，D0CK8大片段 缺失突变患者的血液和健康者的血液的全基因组DNA文库的核酸含量均为为10?40 μ g。
[0075] 取上述制得的全基因组DNA文库，采用实施例2制得的试剂盒捕获DOCKS基因片 段，具体操作方法为：取上述制得的全基因组DNA文库（DNA库）与生物素化的探针（序列 如SEQ ID N0 :1所示）混合，进行PCR，具体程序为：95°C，7min ;65°C，2min。加入杂交缓冲 液[Binding and washing(B&W)Buffer (2X)]，60 ?70°C加热 20 ?24 小时。1 Xbinding 缓冲液清洗MyOne磁珠，将磁珠加入上述混合物混匀，进行孵育10-15分钟。使用磁铁分离 生物素化的DNA，WB1缓冲液室温清洗15分钟，WB3缓冲液在65°C清洗三次，每次15分钟， 然后将洗脱下来的DNA进行扩增，具体程序为：①98°C预变性30s ;②98°C变性25s，65°C退 火30s，72°C延伸30s ;循环15次；③72°C延伸5min。即可获得目标基因片段D0CK8基因， 外显子捕获率为100%。
[0076] 采用二代测序技术对获得的目标基因片段D0CK8基因进行测序，形成BAM文件，形 成生物学信息，排除SNP，分析插入与缺失（InDel)等突变情况，最终确定突变位点。SNP分 析流程和InDel分析流程具体如下：
[0077] SNP分析流程具体为：获取原始短序列；去除测序数据中的接头和低质量数据等； 把短序列用SOAPaligner软件定位到人类基因组数据相应的位置上，所用到参数 ：S〇ap2. 20-a-b-t-v3-142-s63-ml00-x400,统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平 均测序深度等；SOAPsnp用于在目标区域找出位点的基因型，所用到参数：S〇apsnp-i-d-〇-rO. 00005-e0. 0001-M-t-u-L-s-2T，过滤低质量值（质量值> =20)和低覆盖度（深度> = 10)的SNP ;利用CCDS、人类基因组数据库（NCBI36. 3)、dbSNP(vl30)信息对SNP进行注释， 确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、SNP功能（错义突变/无义突变/ 可变剪切位点）、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等；根据疾病样品和正常样品信息，选出 疾病样品所共有的而在正常组中不存在的SNP作为候选的SNPs，在候选的SNPs中去除掉在 dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的SNP。同时，过滤掉SIFT预 测对蛋白功能无影响的SNPs作为最后疾病相关的候选SNPs。
[0078] InDel分析流程具体为：把去除接头序列和低质量的测序数据 用Burrows-Wheeler Aligner (BWA)比对到人类基因组上，所用到参数：bwa aln-L-131-il〇-k2-t7-e40 ;用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失（InDel)的信息； 利用（XDS、人类基因组数据库（NCBI36. 3)、dbSNP(vl30)信息对InDel进行注释，确定突变 位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能（氨 基酸插入/氨基酸缺失/移码突变）。
[0079] 试验结果如图1所示。
[0080] 由图1可知，D0CK8大片段缺失突变患者的检测结果显示在11号外显子处（在9 号染色体上位置：334225-334384)测序深度出现下降至0,为大片段纯和缺失，12号至33 号外显子处（在9号染色体上位置：336582-422135)测序深度出现下降，下降50%，为大片 段杂合缺失。另外，还检测到1个可疑突变位点，见表1。此检测结果与高分辨率寡核苷酸 微矩阵比较基因组杂交法的检测结果一致。
[0081] 表1可疑突变位点信息
[0082]

【权利要求】
1. 一种特异性结合D0CK8基因片段的探针，其特征在于，所述特异性结合D0CK8基因片 段的探针的序列如SEQ ID NO :1所示。
2. -种检测DOCKS突变情况的试剂盒，其特征在于，包括亲和素标记的磁珠和如权利 要求1所述的特异性结合DOCKS基因片段的探针。
3. 根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述特异性结合DOCKS基因片段的探针采 用生物素标记。
4. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述亲和素为链霉亲和素。
5. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括DOCKS基因未突变的血液。
6. -种非诊断目的检测DOCKS突变情况的方法，其特征在于，包括如下步骤： 取待测样本，提取全基因组DNA，富集D0CK8基因片段； 对所述DOCKS基因片段测序，形成BAM文件； 对所述BAM文件进行数据分析，排除SNP，分析插入与缺失情况，检测所述待测样本的 D0CK8突变情况； 所述待测样本的D0CK8基因大片段的测序深度减少至50%，所述待测样本的D0CK8突 变情况为大片段杂合缺失； 所述待测样本的DOCKS基因大片段的测序深度减少至0%?1%，所述待测样本的 D0CK8突变情况为大片段纯合缺失； 所述待测样本的D0CK8单个碱基的测序深度减少至50%，所述待测样本的D0CK8突变 情况为单个碱基杂合缺失； 所述待测样本的D0CK8单个碱基的测序深度减少至0%?1%，所述待测样本的D0CK8 突变情况为单个碱基纯合缺失； 所述待测样本的D0CK8单个碱基发生改变，所述单个碱基的测序深度减少至50 %，所 述待测样本的D0CK8突变情况为单个碱基杂合突变； 所述待测样本的D0CK8单个碱基发生改变，所述单个碱基的测序深度减少至0 %? 1 %，所述待测样本的D0CK8突变情况为单个碱基纯合突变。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述富集DOCKS基因片段具体为：取特异 性结合DOCKS基因片段的探针与所述全基因组DNA杂交，再与亲和素标记的磁珠结合，经洗 提、扩增； 所述特异性结合D0CK8基因片段的探针如SEQ ID NO :1所示。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述杂交的温度为60?70°C，所述杂交 的时间为20?24小时。
9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述测序采用的方法为二代测序技术。
10. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述特异性结合DOCKS基因片段的探针 采用生物素标记。
11. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述亲和素为链霉亲和素。
12. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：取DOCKS基因未突变 的血液作为阳性对照，按照权利要求6所述的方法形成BAM文件，并对所述BAM文件进行数 据分析，排除SNP。
【文档编号】C12N15/11GK104059993SQ201410336687
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】赵晓东, 秦涛 申请人:重庆医科大学附属儿童医院