一种用于特异性检测肠杆菌科细菌的引物、探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种特异性检测肠杆菌科细菌的引 物、探针及其应用，并进一步公开了一种特异性检测肠杆菌科细菌的方法。
【背景技术】
[0002] 肠杆菌科细菌隶属于细菌界，肠杆菌科包括无芽孢、周身鞭毛或无鞭毛的革兰氏 染色阴性直杆菌，具有分布广的特点，其寄主范围大，人、动物、植物都有寄生或共生、附生、 腐生，也可在土壤或水中生存，与人类关系密切。肠杆菌科细菌易于培养，繁殖快（在适宜 条件下每20~30分钟可增殖一代）。
[0003] 肠杆菌科细菌具有化能有机营养，兼营呼吸代谢和发酵代谢；可通过氧化多种简 单有机化合物或发酵糖、有机酸或多元醇来获取能量；大部分能在含有一种碳源的无机氮 培养基上生长；有些种生长时需要某种氨基酸或水溶性维生素；除个别血清型外，接触酶 均为阳性，氧化酶阴性；除欧文氏菌属中的少数种外，均还原硝酸盐为亚硝酸盐；DNA(脱氧 核糖核酸）中的G+C(鸟嘌呤和胞嘧啶）克分子含量为39~59 %。
[0004] 而阪崎肠杆菌，属于肠杆菌科，是寄生在人和动物肠道内的革兰氏阴性菌，无芽 孢，周生鞭毛，能运动，其包括埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏 菌属、变形杆菌属、耶尔森氏菌属等属的菌体。阪崎肠杆菌可导致婴儿及早产儿脑膜炎、败 血症和坏死性结肠炎，死亡率高达50%，已引起世界多国相关部门的重视。国家食源性疾病 监测网自2007年起把阪崎肠杆菌列为婴儿配方食品重点监测病原菌。
[0005] 目前大多数中国企业采用培养基筛选法检测婴儿配方食品中的阪崎肠杆菌，具体 操作参照国标478940-2010,操作步骤如下：
[0006] (1)前增菌和增菌
[0007] 取检样100g(mL)加入已预热至44°C装有900mL缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，用手 缓缓地摇动至充分溶解，36°C±1°C培养18h±2h。移取ImL转种于IOmLmLST-Vm肉汤， 44°C±0. 5°C培养 24h±2h。
[0008] (2)分离
[0009] 2. 1轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌培养物1环，分别划线接种于两个阪 崎肠杆菌显色培养基平板，36°C±1°C培养24h±2h。
[0010] 2. 2挑取1个~5个可疑菌落，划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA)平板。 25°C±1°C培养 48h±4h。
[0011] ⑶鉴定
[0012] 自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。可选择生化鉴定试剂盒或 全自动微生物生化鉴定系统。
[0013] 上述培养基筛选法的缺点如下：
[0014] 1、总的检测时间需5天左右，且需要接种大量不同的培养皿，费时费力。
[0015] 2、需要大量培养基原材料，耗材等。
[0016] 3、需要大量的空间放置这些培养皿以及需要大量的人力清洗培养皿。
[0017] 除培养基筛选法以外还有荧光PCR方法的检测技术（中华人民共和国出入境检验 检疫行业标准SN/T1632. 3-2005)。PCR全称是聚合酶链式反应。使用两段（20-24个核苷 酸）寡核苷酸作为反应的引物，这两段寡核苷酸引物的序列不发生互补作用。但它们可以 和成为模板的待测DNA两条链上的位点分别发生互补。反应液由包括含有镁离子的反应缓 冲液，DNA聚合酶，4种单核苷酸（dNTP)，模板DNA以及引物组成。通过温度的变化（变性， 退火，延伸）合成两个互补位点之间的DNA片段。这样的反应反复进行，使DNA片段得以扩 增。经30左右个循环，扩增倍数达106。
[0018] 而荧光PCR是在普通PCR基础上加入一条特异的寡核苷酸荧光探针，该探针5'端 标记了FAM荧光素，3'端标记了TAMRA荧光素，此时FAM的荧光被TAMRA猝灭，仪器检测不 到荧光。PCR延伸阶段，DNA聚合酶发挥其5' -3'外切核酸酶功能，将探针切割，与此同时 标记在探针上的FAM游离出来，其所发出的荧光不再被TAMRA所猝灭而被仪器检测到。PCR 过程中，每对目的片段进行一次有效的扩增，同时对探针进行了一次切割以及对FAM进行 了一次检测。仪器检测到FAM的增量，可以间接的反映目的片段的扩增量。具体操作步骤 如下：
[0019] (1)、取ImL增菌后的样品加到I. 5mL无菌离心管中；
[0020] (2)、8000r/min离心5min，尽量去除上清液；
[0021 ] (3)、加50yLDNA提取液，充分混匀；
[0022] (4)、沸水浴 5min;
[0023] (5)、12000r/min离心5min。上清液即可作为模板DNA进行荧光PCR扩增；
[0024] (6)、反应体系总体积为25yL。其中含：10倍缓冲液2. 5yL，引物对（10ymol/L) 各IyL，dNTP(lOmmol/L)IyL，DNA聚合酶（5U/yL) 0? 5yL，水 17yL，模板DNA2yL;
[0025](7)、反应程序为：1. 37°C5min，95°C预变性 3min;2. 95°C变性 5s，60°C退火延伸 40s，40个循环，同时收集FAM荧光；
[0026] (8)、再次，杂交需要配备专用杂交炉，占用空间多，控制条件复杂，很难实现高通 量。
[0027] 上述荧光PCR法检测技术的缺点如下：
[0028] 1、特异性较低：由于引物和探针设计的问题，对于食品中条件致病菌的检测，几乎 仅局限于检验一种致病菌，很少实现一步实验的同时检验，不能完全包括阪崎肠杆菌和肠 杆菌的所有菌种。
[0029] 2、假阳性率高：死亡的阪崎肠杆菌是无害的，但仍能检测出来。由于死细胞的累积 显示出了失活的肠杆菌细胞的高本底，以及在实验操作过程中游离的DNA片段形成的气溶 胶都会导致实验结果的假阳性，从而会因为继续后续实验而徒增工作量。
[0030] 3、假阴性率高：不能排除由于PCR抑制剂的存在而出现的假阴性现象。
[0031] 4、结果较难判定：单纯以Ct值判定结果，不够严谨准确。
[0032] 可见，现有常规的检测方法对于肠杆菌科细菌尤其是阪崎肠杆菌的检测均有其弊 端，亟需开发一种可以快速、准确的特异性检测肠杆菌科细菌尤其是阪崎肠杆菌的方法。
【发明内容】
[0033] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种可以特异性检测肠杆菌科细菌的引物、 探针及其应用，并进一步公开了一种特异性检测肠杆菌科细菌的方法；
[0034] 本发明解决的第二个技术问题在于提供一种可以同时检测肠杆菌科细菌及阪崎 肠杆菌的引物、探针及其应用，并进一步公开了一种同时检测肠杆菌科细菌及阪崎肠杆菌 的方法。
[0035] 为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性检测肠杆菌科细菌的引物，所述引 物的序列结构如下：
[0036] 肠杆菌科-F:5，-CTGAAAGCATCTAAGCACGAAACTTG-3，；
[0037] 肠杆菌科-R:5' -GTCGTCTTCAACGITCCTTCAGG-3';
[0038] 内部阳性对照-F :5'-TGTGAAATACCGCACAGATG-3' ；
[0039] 内部阳性对照（IAC)-R:5' -AGCTGGCGTAATAGCGAAG-3'。
[0040] 本发明还提供了一种用于特异性检测阪崎肠杆菌的探针，所述探针的序列结构如 下：
[0041] 肠杆菌科细菌探针：
[0042] 5， -HEX-AGAGTAGTAGTTGTAGAGGCCGTGCTTCCGAAAG-BHQ-1-3';
[0043] 内部阳性对照探针：
[0044] 5' -R0X-TAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCC-BHQ-2-3'。
[0045] 本发明还提供了一种用于特异性检测肠杆菌科细菌的试剂盒，包括所述的引物及 所述的探针，以及光敏感性物质。
[0046] 所述光敏感性物质包括可与DNA的碱基形成共价键的溴化乙锭单叠氮溴（EMA)， 其浓度为125yg/mL。
[0047] 进一步的，所述试剂盒还包括：
[0048] 内部阳性对照物，所述内部阳性对照物包括pUC19质粒DNA;
[0049] DNA聚合酶和尿嘧啶-DNA糖基化酶的混合物；
[0050] 肠杆菌科细菌的DNA为阳性对照、PCR级水为阴性对照；
[0051] 缓冲蛋白胨水和DNA提取液；
[0052] 并选择性的添加可视化的黄色染料。
[0053] 本发明还公开了一种特异性检测肠杆菌科细菌的方法，即采用所述的试剂盒，该 检测方法包括以下的步骤：
[0054] (I)DNA的提取：
[0055] 取待检样品进行增殖培养、富集，向100y1富集液中加入300y1溴化乙锭单叠氮 溴，然后室温暗室培养5min，之后在500W光下曝光5min，离心、除去上清液，再加入DNA提 取液，充分混匀、培养、离心，取上清液作为模板DNA;
[0056] (2)PCR反应体系：
[0057] 25yL的反应体系包括18yL所述引物和探针；IyL的所述DNA聚合酶和尿嘧 啶-DNA糖基化酶的混合物；IyL内部阳性对照物；5yL模板DNA或阳性对照物或阴性对照 物；
[0058] (3)PCR反应程序：
[0059] 在37°C下4min，95°C预变性5min;95°C变性10s，65°C退火延伸70s，40个循环，同 时收集FAM，HEX和ROX荧光信号；
[0060] (4)结合扩增曲线图判定实验结果。
[0061] 本发明还提供了一种用于特异性检测肠杆菌科及阪崎肠杆菌的试剂盒，包括：
[0062] 阪崎肠杆菌-F:5，-AGGGGATATTGTCCCCTGAAACAG-3，；
[00