一组用于口腔中幽门螺杆菌的实时荧光定量pcr检测的特异性引物和探针的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物检测方法技术领域，具体涉及一组用于口腔中幽门螺杆菌的实 时荧光定量PCR检测的特异性引物和探针。
【背景技术】
[0002] 1983年，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，简称Hp)被澳大利亚的Warren和 Warshail发现，引起了大量学者的关注。Krajden于1989年首次从胃炎患者牙菌斑中分 离培养出Hp，幽门螺杆菌感染与慢性胃炎、胃溃疡、胃腺癌、胃粘膜相关性淋巴瘤有着密切 的联系。大量学者研究发现患有消化性疾病患者口腔Hp与其胃粘膜内的形态学和生物学 特征相似，具有同源性。
[0003]以前大量的研究都集中在胃部的幽门螺杆菌。但是唾液、口腔溃疡、舌背、口腔肿 瘤中也存在大量的Hp，口腔是Hp胃外重要的储存场所，口腔有可能是胃内Hp感染和复发的 来源。因此研究口腔中Hp的感染情况具有重要的临床意义。Song等认为，Hp作为条件致 病菌，可存在于健康人和消化道疾病患者的口腔内，当环境改变时会导致疾病的发生。同时 我们可以推测，如果口腔内Hp可以根除、口腔健康可以很好改善，胃内Hp感染可能更容 易预防、彻底根除。
[0004]流行病学调查显示，Hp感染在世界各地均较为常见，具有很高的发病率，因此迫切 需要一种快速、特异的检测方法。目前诊断Hp感染的方法很多，包括尿素酶检测、细菌培 养、组织学染色、血清Hp抗体检测等，而针对口腔Hp的诊断检测方法并不多。Hp可产生大 量的尿素酶，利用尿素酶试验可检测口腔内Hp，口腔内有多种细菌尿素酶阳性，如唾液链球 菌等，容易产生假阳性，特异性低，因此此种方法的应用难以让人信服。细菌的分离培养是 检测Hp的金标准，且可进行药敏试验，指导临床用药，但是口腔内Hp的数量较少且口腔菌 群复杂，微生物种类多，检测敏感性低，阳性检出率低。PCR技术作为一种分子生物学工具， 可以选择性体外扩增DNA或RNA片段，特异性强、敏感性高，用于牙菌斑、唾液Hp的检测，不 受菌量少、是否为活菌的因素影响，已广泛应用于临床和科研。近年来发展起来的实时荧光 定量PCR(Fluorescence quantitativePCR)技术从常规PCR定性检测迈上量化的台阶， 实现了PCR技术从定性到定量的飞跃，避免了传统PCR定量鉴定中交叉污染的问题，它相对 于常规PCR技术先进、操作简便，实现了实时监测、绝对定量和快速检测的目的，同时具有 灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于设计一组用于定量测定口腔中幽门螺杆菌含量的特异性引物和 探针序列，建立一种能广泛应用于幽门螺杆菌检测的快速、灵敏、特异性好的荧光定量PCR 检测的方法。本发明采用基因克隆技术，将幽门螺杆菌16S核糖体RNA基因（16srRNA)片 段插入到载体PMD18-T中，获得含有16srRNA基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根 据幽门螺杆菌16s rRNA的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化 PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进 行评估。
[0006] 本发明提供一组用于口腔中幽门螺杆菌的实时荧光定量PCR检测的特异性引物 和探针，所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1)_(3)中的一种： (1) 、上游引物：5'_ TGGCGCACGGGTGAGT-3' ； 下游引物：5' -CCAATGGCTATCCCAAACTAAGA-3'； 探针：5' - ACGCATAGGTCATGTGC-3' ； 所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No. 2; (2) 、与（1)所述序列互补的序列； (3) 、将（1)中所述序列向5'端和3'端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得 到的序列。
[0007] 经实验验证，将（1)中所述序列向5'端和3'端方向延伸一至数个碱基或删减一 至数个碱基得到的序列也能很好的扩增上述目标核苷酸序列。
[0008] 优选地，所述探针的5'端荧光报告基团是FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3'端标记的 是荧光淬灭基团TAMRA、DABCYL或BHQ。
[0009] 本发明还提供口腔中幽门螺杆菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包 括权利要求1所述的引物和探针。
[0010] 本发明的第三个目的是提供上述特异性引物和探针、试剂盒在定量检测口腔中幽 门螺杆菌含量中的应用。
[0011] 本发明的第四个目的是提供口腔中幽门螺杆菌的实时荧光定量PCR检测方法，步 骤如下： (1)制备标准品：将幽门螺杆菌16S rRNA保守基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含 有幽门螺杆菌16S rRNA保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述幽门螺杆菌16S rRNA保守基因片段参见序列表中SEQ ID No. 1的第6-353位核苷酸序列； (2 )标准曲线绘制； (3) 使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体 系进行实时荧光PCR扩增； (4) 通过标准曲线和待测样品的Ct值进行干酪乳杆菌的快速定量检测。
[0012] 优选地，所述幽门螺杆菌16S rRNA保守基因片段是通过以下引物扩增得到的： 上游引物为 5'- TGGCGGCGTGCCTAATACA-3' ； 下游引物为 5' - GTTGCTGCTTCAGGGITT-3'。
[0013] 优选地，步骤（3)中所述引物和探针的用量均为1.6 iil。
[0014] 优选地，步骤（3)中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94°C预变性2分钟， 94°C 15秒、60°C 40s并收集荧光信号，40个循环。
[0015] 本发明提供用于对幽门螺杆菌进行定性、定量检测的引物和探针，通过提取待检 测样品的RNA反转录得到的cDNA，也可以通过提取幽门螺杆菌的基因组DNA，结合实时荧光 定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中幽门螺杆菌含量的目的。本发明所提供的 引物和探针可对口腔中的幽门螺杆菌含量进行定性、定量分析，对判断口腔中幽门螺杆菌 活性菌的含量以至于后续研究胃内Hp感染具有重要意义，本发明将在微生物临床检测领 域发挥重要作用。应用本发明的引物和探针能够快速、准确、灵敏、特异性好的定量检测待 测标本中幽门螺杆菌的含量。
【附图说明】
[0016] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。下面结合附图以及具体实施方案对 本发明做更详细阐述。在附图中： 图1为引物和探针体系优化实验结果；其中，a代表引物为1. 6 y 1，探针为1. 6 y 1 ;b 代表引物为l.〇y 1，探针为1.6y 1 ;c代表引物为l.Oy 1，探针为0. 8y 1 ;d代表引物为 2. 0 y 1，探针为0. 8 y 1 ;e代表引物为1. 6 y 1，探针为0. 8 y 1 ;f代表引物为2. 0 y 1，探针为 1. 〇 y 1 ;g代表引物为1. 〇 y 1，探针为〇. 8 y 1 ;h代表引物为1. 0 y 1，探针为1. 0 y 1 ;i代表 引物为2. 0 y 1，探针为1. 6 y 1 ; 图2为灵敏度实验结果；其中，a代表质粒浓度分别为1. 00X 108coPies/ml、b代表 质粒浓度为l.〇〇X107copies/ml、c代表质粒浓度为1.00X 106copies/ml、d代表质粒浓 度为1.00X 105COpies/ml、e代表质粒浓度为1.00X 104COpies/ml、f代表质粒浓度为 1. 00X 103copies/ml、g代表质粒浓度为1. 00X 102copies/ml和阴性对照； 图3为特异性实验结果；其中出现标准扩增曲线的为幽门螺杆菌质粒，未出现标准扩 增曲线的大肠埃希菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、金黄色葡 萄球菌、粪肠球菌、乙型溶血性链球菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、福氏志贺菌、脑膜炎 奈瑟菌、阴性对照； 图4为幽门螺杆菌标准曲线。
【具体实施方式】
[0017] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用引物、探针和所用序列测定工作均由生工生物工 程(上海）股份有限公司合成和完成。
[0018] 实施例1 16s rRNA基因标准品的制备 要建立实时荧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含 高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。16S rRNA基因广泛存在于原核生物中， 具有很高的保守性。本发明采用幽门螺杆菌16S rRNA基因作为靶序列。本实施例主要 采用PCR技术扩增幽门螺杆菌的16S rRNA基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体 PMD18-T中，构建出重组质粒pMD18-T-HP16S，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定 量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。
[0019] -、模板DNA的制备 提取幽门螺杆菌(标准菌株）基因组DNA，用作16S rRNA基因PCR扩增的模板： (1) 取lml菌悬液，8000r/min离心5分钟，弃上清液； (2) 加入10%蔗糖的TE缓冲液400 y 1悬浮菌液沉淀，混匀后加入20mg/ml的溶菌酶 20 y 1，37°C作用 45min ; (3) 加入30yl 10%SDS和 3yl lOmg/ml 蛋白酶 K，55°C 水浴 lh; (4) 加入500 y 1的酸/氯仿/异戊醇(体积比25:24:1)混勾，12000r/min离心10min ; (5) 取上清，加入500 y 1的氯仿/异戊醇(体积比24:1)混勾，12000r/min离心10min ; (6) 取上清，加入50 y 1 3M NaAc和800 y 1的无水乙醇，-20°C静置30min，离心去上 清； (7) 沉淀用70%的乙醇洗涤，干燥； (8) 溶于50 y 1双蒸水中，-20°C保存。
[0020] 二、16S rRNA基因片段的PCR扩增 1、引物的设计与合成 本发明通过对NCBI数据库中幽门螺杆菌16S rRNA基因全序列进行生物信息学比对分 析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列(序列表SEQ ID No. 1中第6-353位核苷酸序 列）为革G目标，应用P