用于检测肉制品中羊源性成分的荧光定量pcr特异性引物、探针及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品检验和生物学检测技术领域，具体涉及一种检测肉制品中羊源性 成分的荧光定量PCR引物、探针及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 羊肉具有天然的滋补功效，长期以来都受到广大消费者的青睐。随着市场流通的 日益发达，羊肉经过冷冻、加工后再销售已成为现代市场营销的主要手段，但是羊肉一般经 过冷冻，特别是经过加工后的熟羊肉通过感官检查已很难区分真伪，因而一些不法商贩在 高额利润的驱使下，在肉制品的生产与销售中使用鸡肉、鸭肉、猪肉等以假充真、以次充好， 引起了广大消费者的强烈愤慨。这不仅仅涉及到了经济、营养等问题，更直接影响着消费者 的健康，尤其是对某些事物过敏的消费者。
[0003] 目前，采用免疫学方法可以对不同的生鲜肉进行鉴定，但是对于热加工处理的肉 类制品，由于其中的蛋白质成分或免疫原性成分遭破坏而无法对其来源进行准确鉴定。因 此，建立一种对肉类制品准确、特异和灵敏度高的鉴别方法，对食品监管部门而言已迫在眉 睫。随着研究技术的发展，食品中肉类成分的鉴别与分析已逐步形成了分别以蛋白质和核 酸检测为基础的方法体系，其鉴别精度可达属或亚属水平，灵敏度也达到了纳克级，其中以 PCR技术为基础的种属检测技术最为突出。
[0004] Cytb基因是编码线粒体内膜上细胞色素b氧化酶的基因的一个亚基，由mtDNAH 链所编码。几乎所有的真核生物和许多原核生物的细胞中都存在细胞色素b，它不但在属 间、种间存在多样性，而且在品种间、品种内个体间都存在多样性，因此，它对阐明生物间的 亲缘关系以及在物种鉴定方面都具有极其重要的意义。在进化的过程中，Cytb基因序列 变异率相对较高，种间差异较大，因此，Cytb基因是研究种间进化关系最佳的基因，可以将 Cytb基因检测作为物种鉴定的一种重要的手段。本申请根据羊特异性线粒体Cytb基因，设 计一种特异性的荧光定量PCR引物、探针及其试剂盒，利用特异性引物和探针建立一种运 用荧光定量PCR技术鉴定真假羊肉的方法。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于检测肉制品中羊源性 成分的特异性引物、探针；本发明的另一目的是提供一种检测肉制品中羊源性成分的荧光 定量PCR检测试剂盒。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] 本发明提供了一种用于检测肉制品中羊源性成分的荧光定量PCR特异性引物，所 述特异性引物的核苷酸序列为：
[0008] 上游引物：5' -GCATAATATTCCGMCCAATCAG-3'（SEQIDNO. 1);
[0009] 下游引物：5'-AGITGTCCAATAATRATGTAGGG-3'（SEQIDNO. 2);其中，M和R为简并 碱基，M = A或C，R = A或G。
[0010] 本发明还提供了一种与上述引物配合使用的荧光探针，所述荧光探针的核苷酸序 为荧光淬灭基团，M为简并碱基，M = A或C。
[0011] 优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
[0012] 本发明所述的引物和探针是通过核酸比对软件DNAMAN对GenBank中公布的羊 线粒体Cytb基因进行序列比对，筛选出羊Cytb基因保守序列，其核苷酸序列如SEQID NO. 4 (其中，Y、R和M为简并碱基，Y=C或T，R=A或G，M=A或〇,并利用Primer5. 0 设计特异性引物。所有引物和探针均由上海辉睿生物科技有限公司合成。
[0013] 本发明还提供了一种用于检测肉制品中羊源性成分的方法：以样品总DNA为模 板，利用本发明上述提供的引物和荧光探针进行实时荧光定量PCR，同时设立无模板对照和 阳性对照，根据扩增曲线判定结果。
[0014] 本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为25 y L反应体系时，其优选配置见 表1。
[0015] 表1荧光定量PCR反应体系
[0016]
[0017] 优选地，本发明的实时荧光定量PCR
的反应程序为：95°C预变性5min，l个循环； 95°C变性10s，58°C退火45s，40个循环。
[0018] 本发明每次检测标本时须设立阴性对照和阳性对照，在检测中两种对照为有效扩 增时，样本结果判断标准如下：
[0019] Ct值< 37时样品结果为阳性；
[0020] Ct值彡40时样品结果为阴性；
[0021] Ct值在37~40之间时，样品需要重复，重复试验如Ct值依然低于37判定为阳性 扩增，高于40判定为阴性扩增。
[0022] 本发明还提供了一种用于检测肉制品中羊源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括上 述特异性引物和与上述特异性引物配合使用的探针，其中，所述特异性引物的核苷酸序列 为：
[0023] 上游引物：5 ' -GCATAATATTCCGMCCAATCAG-3 ' ；
[0024] 下游引物：5 ' -AGITGTCCAATAATRATGTAGGG-3 ' ；其中，M 和R为简并碱基，M =A或 C，R=A或G〇
[0025] 所述探针的核苷酸序列为：
[0026] 5' -F-TCACATGAATTGGAGGMCAGCCAG-Q-3' ；其中，F为荧光报告基团，Q为荧光淬灭 基团，M为简并碱基，M=A或C。
[0027] 优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
[0028]优选地，本发明提供的试剂盒还包括：2 XPremix Ex Taq (Probe qPCR)、R0X Reference Dye(50X)、阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为 羊肉基因组 DNA，其中 2XPremix Ex Taq(Probe qPCR)和 ROX Reference Dye(50X)从 TaKaRa购买得到。
[0029] 本发明中，优选地，用于检测肉制品中羊源性成分的试剂盒的工作反应体系见表 1 ;其工作程序为95°C预变性5min，1个循环；95°C变性10s，58°C退火45s，40个循环。
[0030] 上述的试剂盒在检测肉制品中羊源性成分中的应用。
[0031 ] 本发明的积极有益效果：
[0032] (1)本发明提供了用于检测肉制品中羊源性成分的荧光定量PCR特异性引物和与 该引物配合使用的荧光探针，该引物具有很高的检测灵敏度，对羊源性成分的检测下限为 6pg/yL，远远低于现有检测技术的检测限；而且检测特异性强，重复性好，因此，可以实现 对肉及肉制品中羊源性成分精确的物种鉴定。
[0033] (2)本发明提供的检测试剂盒，其反应体系包含了上述引物、探针和阴性、阳性对 照，利用该试剂盒检测肉制品中羊源性成分，操作简单，大大缩短检测周期，该试剂盒有助 于对肉制品的生产与销售中使用鸡肉、鸭肉、猪肉等以假充真、以次充好现象的监测，适合 推广应用，为监管部门提供有利的科学依据。
【附图说明】
[0034] 图1为本发明所述用于检测肉制品中羊源性成分的荧光定量PCR方法的特异性检 测图：其中，1代表阳性对照（羊肉DNA提取物为模板），2代表猪肉DNA提取物为模板，3代 表牛肉DNA提取物为模板，4代表鸡肉DNA提取物为模板，5代表鸭肉DNA提取物为模板，6 代表鹅肉DNA提取物为模板，7代表貂肉DNA提取物为模板，8代表狐狸肉DNA提取物为模 板，9代表小麦DNA提取物为模板，10代表玉米DNA提取物为模板，11代表水稻DNA提取物 为模板，12代表阴性对照（H 20为模板）。
[0035] 图2为本发明所述用于检测肉制品中羊源性成分的荧光定量PCR方法的敏感性检 测图：1-6分别为600ng/ y L羊肉DNA提取物做10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5、10 6稀释后为模板 的荧光定量PCR扩增曲线，7为阴性对照（H20为模板）。
【具体实施方式】
[0036] 以下结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限 制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明的范围。
[0037] 除非特别说明，本发明采用的除引物、探针之外的试剂、方法和设备为本领域常规 试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明使用的试剂和试剂盒均为市购。
[0038] 主要仪器设备：ABI 7500实时荧光定量PCR仪购自美国应用生物系统中国公司； HermLe Z36HK高速冷冻离心机购自HERMLE;DT500电子天平购自江苏常熟长青仪器厂；岛 津BioSpec-nano紫外可见分光光度计购自日本。
[0039] 主要试剂：组织裂解液（lmol/L Tris-HCL、0.5mol/L EDTA、10% SDS)、氯仿 / 异 戊醇（24:1)、3M醋酸钠、1XTE缓冲液（自配试剂）；20mg/mL蛋白酶K(TAKARA)Tris平 衡酸（索莱宝生物科技有限公司）；2XPremix Ex Taq(Probe qPCR)和ROX Reference Dye(50X)(从TaKaRa购买得到）；引物和探针均由上海辉睿生物科技有限公司合成。
[0040] 实施例1 :引物和探针的设计与合成
[0041 ] 通过核酸比对软件DNAMAN对GenBank中公布的10个羊线粒体Cytb基因（GenBank 中的登录号分别为 DQ459341、JX567831. 1、JX567772. 1、DQ903215. 1、DQ097410. 1、 DQ514544、EU130780. 1、AB736131. 1、JX010746. 1、AB044308. 1)进行序列比对，筛选出羊 Cytb基因保守序列，其核苷酸序