一种中空容器内表面微生物的取样方法和检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种中空容器内表面微生物的取样方法和检测方法。本发明的取样方法包括如下步骤：在无菌环境下，将无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液置于所测容器中，所述的无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的体积为所测容器额定容量的30％～35％；用无菌盖将所测容器的口封住，振荡所测容器，使所测容器内水溶液充分涮洗到容器所有内表面，并充分混匀，振荡后所得溶液即为取样的样本液；所述的中空容器的口径面积为小于或等于100平方厘米。本发明的中空容器内表面微生物取样及检测方法操作简单、能全面反映整个中空容器内表面微生物污染状况、成本低廉、方法适用范围广泛、利于工业化应用。
【专利说明】-种中空容器内表面微生物的取样方法和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种中空容器内表面微生物的取样方法和检测方法。
【背景技术】
[0002] 食品包装的安全性直接影响着包装内食品的质量。针对非在线生产的用于直接灌 装的中空食品包装而言，在存储、运输过程中存在着被污染的风险，从而会影响食品的安全 性以及货架期。
[0003] 目前我国关于一次性餐饮具微生物的取样方法，基本参照《GB18006. 1-2009塑料 一次性餐饮具通用技术要求》。该标准适用于宾馆、饭店、餐厅、食堂等餐饮企业的食（饮） 具，也适用于个体摊点的食（饮）具。一次性餐饮具定义为预期用餐或类似用途的餐具，包 括一次性使用的餐盒、盘、碟、刀、叉、筷子、碗、杯、罐、壶、吸管等，也包括有外托的一次性内 衬餐具，但不包括无预期用餐目的或类似用途的食品包装物如生鲜食品托盘、酸奶杯、果冻 杯等。GB18006. 1-2009中微生物指标中的大肠菌群检验是参照GB14934-94进行的、霉菌计 数按GB/T4789. 15进行。
[0004] 对于诸如酸奶桶等中空容器内表面的微生物取样方法，由于没有相关的法律规 定，公立的第三方检测机构基本是按照《GB18006. 1-2009塑料一次性餐饮具通用技术要求》 中的发酵法进行微生物取样。该方法具体是将2. 0cmX2. 5cm灭菌滤纸片紧贴内面各10张 (总面积50cm2)，经lmin，按序取下滤纸片置入50mL灭菌水试管中，充分振荡后，制成原液。 这样的取样方法，对于中空容器来说，操作起来不方便，给取样造成困难。市场上也难以买 到现成的无菌滤纸片。工业上使用的中空容器大多是小口中空容器，取样难度非常大。而 且，发酵法仅仅对容器局部进行取样，并不能全面地反映整个容器内部的污染状况，其结果 是片面的。相对于恶劣环境的下制造、运输及保存，在空气净化级别在10万级及以上的环 境条件下，采用发酵法对中空容器进行微生物取样所带来的片面性会更加严重。
[0005] 同样，一些企业会使用膜过滤法进行样品微生物取样和检测。膜过滤法是用体积 为样品容量1/3的无菌水涮洗容器内表面，振荡后取得样本液，经过抽真空阀，通过孔径为 0. 45 μ m的滤膜，将水分抽掉，使微生物保留在滤膜上，并对滤膜片进行培养，查看菌落数量 的方法。膜过滤法虽然精确，但该方法更适用于10万级洁净度及以上的环境条件下运输、 存储的产品，对污染严重的样品，菌落过多，会将滤膜堵塞，导致无法读数，且其检测所需的 设备、耗材等，价格都比较昂贵，不适合于工厂大规模的长期检测。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于，为了克服现有的中空容器内表面微生物取样和 检测方法操作困难、不能全面反映整个容器内表面微生物污染状况以及成本较高、方法适 用范围有限、不利于工业化应用的缺陷，而提供了一种中空容器内表面微生物的取样方法 和检测方法。本发明的中空容器内表面微生物取样及检测方法操作简单、能全面反映整个 中空容器内表面微生物污染状况、成本低廉、方法适用范围广泛、利于工业化应用。
[0007] 本发明提供了一种中空容器内表面微生物的取样方法，其包括如下步骤：在无菌 环境下，将无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液置于所测容器中，所述的无菌生理盐水或磷酸盐 缓冲液的体积为所测容器额定容量的30%?35% ;用无菌盖将所测容器的口封住，振荡所 测容器，使所测容器内水溶液充分涮洗到容器所有内表面，并充分混匀，振荡后所得溶液即 为取样的样本液；所述的中空容器的口径面积为小于或等于1〇〇平方厘米。
[0008] 所述的无菌环境一般为无菌室中。
[0009] 所述的振荡的方法可为本领域常规各种方法，可依据容器大小和重量选择不同的 振荡方法，优选人工振荡和机械振荡。所述的机械振荡优选用摇床振荡。
[0010] 所述的中空容器的口径面积优选小于或等于90平方厘米，更优选小于或等于50 平方厘米，最优选小于或等于20平方厘米。
[0011] 所述的中空容器的材质优选为塑料、玻璃、金属或陶瓷，更优选为塑料或玻璃。所 述的塑料优选为聚乙烯、聚丙烯或聚对苯二甲酸乙二醇酯塑。
[0012] 所述的无菌生理盐水优选为0. 85%的无菌氯化钠水溶液，百分比为氯化钠质量相 对于水溶液中水的质量的质量百分比。所述的无菌生理盐水更优选为按照《GB4789. 2-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中无菌生理盐水的配制方法进行配制 所得的水溶液，所述的配制方法的步骤为：称量8. 5g氯化钠和1000mL蒸馏水，然后将两者 混合溶解后于121°C高压灭菌15min。
[0013] 所述的磷酸盐缓冲液优选为6. 8%的磷酸二氢钾水溶液，且pH值为7. 2,百分比为 磷酸二氢钾质量相对于水溶液中水的质量的质量百分比。所述的磷酸盐缓冲液更优选为按 照《GB4789. 2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》中磷酸盐缓冲液 的配制方法进行配制所得的水溶液，所述的配制方法的步骤为：称量34. 0g磷酸二氢钾和 500mL蒸馏水，将两者混合溶解后，用大约175mL的lmol/L氢氧化钠水溶液调节pH至7. 2， 用蒸馈水稀释至l〇〇〇mL后，取其中1.25mL，用蒸馈水稀释至1000mL，121°C高压灭菌lmin。
[0014] 所述的取样方法在进行前优选进行以下预处理：当所述的所测容器的外包装有二 层以上时，在进入所述的无菌环境之前，除去第一层外包装；当所述的所测容器的外包装仅 为一层时，先用75%酒精消毒这层外包装，然后在进入所述的无菌环境之前，除去这层外包 装。
[0015] 本发明还提供了一种中空容器内表面微生物的检测方法，其包括如下步骤：
[0016] (1)、按照所述的中空容器内表面微生物取样方法进行取样，得样本液；
[0017] (2)、用无菌吸管吸取步骤（1)中混匀的样本液中的一部分或全部，放入培养皿中 进行微生物培养，然后测定培养后的液体中微生物含量。
[0018] 所述的微生物培养的方法可为本领域常规的微生物培养的方法，一般可按照食品 安全国家标准GB4789中各种微生物培养方法进行培养，优选按照《GB4789. 2-2010食品安 全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》、《GB4789. 3-2010食品安全国家标准食品微 生物学检验大肠菌群计数》中的第二法大肠菌群平板计数法或《GB4789. 15-2010食品安全 国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》进行培养。
[0019] 所述的测定的方法可为本领域常规的微生物测定的方法，一般可按照食品安全国 家标准GB4789中各种微生物测定方法进行测定，优选按照《GB4789. 2-2010食品安全国家 标准食品微生物学检验菌落总数测定》、《GB4789. 3-2010食品安全国家标准食品微生物学 检验大肠菌群计数》中的第二法大肠菌群平板计数法或《GB4789. 15-2010食品安全国家标 准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》进行测定。
[0020] 所述的一部分的体积量优选为lmL。
[0021] 所述的微生物含量的计量单位的换算可按照本领域常规方法进行，一般按照以下 步骤进行：先计算所述的样本液中的一部分或全部在样本液总量中所占的体积百分比，然 后用所述的微生物含量除以该体积百分比的数值，得出的数值再除以所测容器内表面积的 数值，即可得到所测容器的单位面积的微生物含量。
[0022] 所述的内表面积的数值可按照本领域常规方法获得，一般由所测容器的生产厂商 提供。
[0023] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0024] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0025] 本发明的取样方法和检测方法适用于无在线杀菌设施、非在线吹灌一体机以及从 成型到灌装需经过运输的条件下所制造、存储和使用的一次性食品包装类中空容器的内表 面微生物取样和检测。本发明的取样方法和检测方法普适性好，取样和检测对象既可以为 洁净度不高的恶劣环境下的中空容器，也可以是洁净度高的环境下的中空容器。
[0026] 本发明的积极进步效果在于：本发明的中空容器内表面微生物取样及检测方法操 作简单、能全面反映整个中空容器内表面微生物污染状况、成本低廉、方法适用范围广泛、 利于工业化应用。
【具体实施方式】
[0027] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0028] 以下各实施例和对比实施例中，0. 85%无菌生理盐水的配制方法为：称取8. 5g氯 化钠溶于l〇〇〇mL蒸馈水中，121°C高压灭菌15min。
[0029] 以下各实施例和对比实施例中，板计数琼脂培养基的原料包括：5. 0g胰蛋白胨、 2. 5g酵母浸膏、1. 0g葡萄糖、15. 0g琼脂和1000mL蒸馈水，其配制方法为：将上述原料混 合，煮沸溶解，调节pH至7. 0±0. 2,分装于试管或锥形瓶中，121°C高压灭菌15min。
[0030] 以下各实施例和对比实施例中，结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA)的原料包括：7. 0g 蛋白胨、3. 0g酵母膏、10. 0g乳糖、5. 0g氯化钠、1. 5g胆盐或3号胆盐、0. 03g中性红、0. 002g 结晶紫、15?18g琼脂和1000mL蒸馏水，其配制方法为：将上述成分混合并溶解，静置几分 钟，充分搅拌，调节pH至7. 4±0. 1，煮沸2min，将培养基冷却至45°C?50°C倾注平板，使用 前临时制备，不得超过3h。
[0031] 以下各实施例和对比实施例中，煌绿乳糖胆盐（BGLB)肉汤的原料包括：10. 0g蛋 白胨、10. 0g乳糖、200mL牛胆粉（oxgall或oxbile)溶液、13. 3mL0. 1%煌绿水溶液和800mL 蒸馏水，其配制方法为：将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL(将 20. 0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节pH至7. 0?7. 5)，用蒸馏水稀释到975mL，调 节pH至7. 2±0. 1，再加入0. 1%煌绿水溶液13. 3mL，用蒸馏水补足到lOOOmL，用棉花过滤 后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL，12rC高压灭菌15min。
[0032] 以下各实施例和对比实施例中，马铃薯-葡萄糖-琼脂的原料包括：300g马铃薯 (去皮切块）、20. 0g葡萄糖、20. 0g琼脂、0. lg氯霉素和1000mL蒸馏水，其配制方法为：将马 铃薯去皮切块，加 l〇〇〇mL蒸馈水，煮沸lOmin?20min，用纱布过滤，补加蒸馈水至lOOOmL， 加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装后，121°C灭菌20min，倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉 素加入培养基中。
[0033] 以下各实施例和对比实施例中，用到的膜过滤装置，其生产商为Sartorius AG，型 号为 PL5832-NF300,功率为 166MPa。
[0034] 以下各实施例和对比实施例中，用到的微孔滤膜，其孔径为0.45 μ m，直径为 50mm，其供应商为上海半岛实业有限公司净化器材厂。
[0035] 以下各实施例和对比实施例中，针对每个样本液或固体样本，菌落总数的测定按 照以下步骤进行：若样本为样本液的，从样本液中取2个lmL分别加入到2个无菌培养皿 内，若样本为固体样本的，直接将该固体样本放入无菌培养皿内；同时，吸取2个lmLO. 85% 无菌生理盐水分别加入到2个无菌培养皿内作空白对照；及时将15mL?20mL冷却至46°C 的平板计数琼脂培养基（可放置于46°C ±1°C恒温水浴箱中保温）倾注于上述各培养皿 中，并转动培养皿使其混合均匀；待琼脂凝固后，将平板翻转，36°C ± 1°C培养48h±2h，如 果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄 层琼脂培养基（约4mL)，凝固后翻转平板，然后36°C ±1°C培养48h±2h ;最后对培养后的 菌落计数：可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录菌落数量，并计算出2个非 空白对照的培养皿内菌落数量的平均值，若任一空白对照培养皿上有菌落生长，则此次检 测结果无效；
[0036] 以下各实施例和对比实施例中，针对每个样本液或固体样本，大肠菌群的测定按 照以下步骤进行：若样本为样本液的，从样本液中取2个lmL分别加入到2个无菌培养皿 内，若样本为固体样本的，直接将该固体样本放入无菌培养皿内；同时，吸取2个lmLO. 85% 无菌生理盐水分别加入到2个无菌培养皿内作空白对照；及时将15mL?20mL冷至46°C的 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA)倾注于上述培养皿中，小心旋转培养皿，将培养基与样本液 充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL?4mLVRBA覆盖平板表层，翻转平板，置于36°C ± 1°C培 养18h?24h ;选取菌落数在15CFU?150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可 疑大肠菌群菌落，两者之和记为每个培养皿上的原始平板菌落数，典型菌落为紫红色，菌落 周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为〇. 5_或更大；从VRBA平板上挑取10个不同类型的 典型和可疑菌落，分别移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB)肉汤管内，36°C ±1°C培养24h?48h， 观察产气情况，凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性；经证实为大肠菌群阳性的 试管比例（比如，若这10个试管中，有6个证实为阳性，则该比例为6/10)乘以每个培养皿 上的原始平板菌落数，即为该培养皿所对应的该lmL样本液的大肠菌群数，并计算出2个非 空白对照的培养皿内大肠菌群数的平均值，若任一空白对照培养皿上有大肠菌群生长，则 此次检测结果无效；
[0037] 以下各实施例和对比实施例中，针对每个样本液或固体样本，霉菌和酵母的测定 按照以下步骤进行：若样本为样本液的，从样本液中取2个lmL分别加入到2个无菌培养皿 内，若样本为固体样本的，直接将该固体样本放入无菌培养皿内；同时，吸取2个lmLO. 85 % 无菌生理盐水分别加入到2个无菌培养皿内作空白对照；及时将15mL?20mL冷却至46°C 的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基（可放置于46°C ±1°C恒温水浴箱中保温）倾 注于上述培养皿内，并转动培养皿使其混合均匀，待琼脂凝固后，将平板倒置，28°C ± 1°C培 养5d ;最后对培养后的菌落计数：可用肉眼观察，必要时用放大镜，记录菌落数量，根据菌 落形态分别计数霉菌和酵母数，并计算出2个非空白对照的培养皿内菌落数量的平均值， 若任一空白对照培养皿上有菌落生长，则此次检测结果无效；
[0038] 效果实施例1和2中的样品瓶，其外带生产外包装，总数为50个，为外观、形状、大 小和材质均相同的容器，均由浙江金石包装有限公司生产和提供。样品瓶的材料为聚乙烯， 容量为1500mL，瓶口直径32mm，且内表面积为656cm 2,容量为1500mL的不规则形状的塑料 瓶，其内表面积的数据由浙江金石包装有限公司提供，其外包装的材料为食品级塑料薄膜 (主要为PP和PE)。样品瓶在检测前不撕毁生产外包装，存放于常温室内。
[0039] 实施例1
[0040] 实验步骤：
[0041] 1)、样品瓶预处理：将10个带有外包装的样品瓶整包取，并除去第一层外包装（仅 一层外包装的不用除去外包装且用75%酒精消毒外包），再进入到无菌室检测（这样可以 避免外包装上面的异物污染无菌室），进入无菌室后，除去样品瓶的所有外包装；
[0042] 2)、样品内表面微生物取样：
[0043] 在无菌室内，将步骤1)中的每个样品瓶分别进行以下操作：将样品瓶中倾注体积 为500ml的0.85%无菌生理盐水，用无菌盖将样品瓶的口封住，用手振荡样品瓶，使样品 瓶内水溶液充分涮洗到样品瓶所有内表面，并充分混匀，振荡后所得溶液即为取样的样本 液；
[0044] 3)、样本液中微生物培养和测定：将步骤2)中的10个样本液进行三种微生物培养 和测定，分别为：菌落总数的测定、大肠菌群的测定以及霉菌和酵母的测定，每个样本液的 每种测定均得到一个平均值；
[0045] 4)、将步骤3)中得到的每个平均值乘以其所对应的步骤2)中的样本液原始体积 (单位为mL)的数值后，除以样品容器的内表面积的数值（单位为cm 2)，所得数值填入表1 的"检出值"栏中，并求算表1中每行"检出值"的平均值，检测结果见表1。
[0046] 实施例2
[0047] 实验步骤：
[0048] 1)、样品瓶预处理：将10个带有外包装的样品瓶整包取，并除去第一层外包装（仅 一层外包装的不用除去外包装且用75%酒精消毒外包），再进入到无菌室检测（这样可以 避免外包装上面的异物污染无菌室），进入无菌室后，除去样品瓶的所有外包装；然后将未 经过杀菌处理的生鲜牛奶倒入样品瓶中，振荡使牛奶充分接触到样品瓶所有内表面，以此 来对样品瓶进行人为污染，达到模拟洁净度不高的恶劣环境下的样品瓶的目的；然后将这 些牛奶从样品瓶中倒出；
[0049] 2)、样品内表面微生物取样：
[0050] 在无菌室内，将步骤1)中的每个样品瓶分别进行以下操作：将样品瓶中倾注体积 为500ml的0.85%无菌生理盐水，用无菌盖将样品瓶的口封住，用手振荡样品瓶，使样品 瓶内水溶液充分涮洗到样品瓶所有内表面，并充分混匀，振荡后所得溶液即为取样的样本 液；
[0051] 3)、样本液中微生物培养和测定：将步骤2)中的10个样本液进行三种微生物培养 和测定，分别为：菌落总数的测定、大肠菌群的测定以及霉菌和酵母的测定，每个样本液的 每种测定均得到一个平均值；
[0052] 4)、将步骤3)中得到的每个平均值乘以其所对应的步骤2)中的样本液原始体积 (单位为mL)的数值后，除以样品容器的内表面积的数值（单位为cm 2)，所得数值填入表1 的"检出值"栏中，并求算表1中每行"检出值"的平均值，检测结果见表1。
[0053] 对比实施例1发酵法
[0054] 发酵法的实验步骤：
[0055] 1)、样品瓶预处理：将10个带有外包装的样品瓶整包取，并除去第一层外包装（仅 一层外包装的不用除去外包装且用75%酒精消毒外包），再进入到无菌室检测（这样可以 避免外包装上面的异物污染无菌室），进入无菌室后，除去样品瓶的所有外包装
[0056] 2)、样品内表面微生物取样：
[0057] 在无菌室内，将步骤1)中的每个样品瓶分别进行以下操作：将10个 2. 0cmX2. 5cm灭菌滤纸片紧贴样品瓶内表面（每个样品瓶贴10个，即总面积50cm2)，经 lmin，按序取下滤纸片置入50mL0. 85%无菌生理盐水试管中，用手充分振荡并混匀后，即得 样本液；
[0058] 3)、样本液中微生物培养和测定：将步骤2)中的10个样本液进行三种微生物培养 和测定，分别为：菌落总数的测定、大肠菌群的测定以及霉菌和酵母的测定，每个样本液的 每种测定均得到一个平均值；
[0059] 4)、将步骤3)中得到的每个平均值乘以其所对应的步骤2)中的样本液原始体积 (单位为mL)的数值后，除以样品容器的内表面积的数值（单位为cm 2)，所得数值填入表2 的"检出值"栏中，并求算表2中每行"检出值"的平均值，检测结果见表2。
[0060] 对比实施例2膜过滤法
[0061] 膜过滤法的实验步骤：
[0062] 1)、样品瓶预处理：将10个带有外包装的样品瓶整包取，并除去第一层外包装（仅 一层外包装的不用除去外包装且用75%酒精消毒外包），再进入到无菌室检测（这样可以 避免外包装上面的异物污染无菌室），进入无菌室后，除去样品瓶的所有外包装；
[0063] 2)、样品内表面微生物取样：
[0064] 在无菌室内，将步骤1)中的每个样品瓶分别进行以下操作：将样品瓶中倾注体积 为500mL的0. 85%无菌生理盐水，用无菌盖将样品瓶的口封住，用手振荡样品瓶，使样品瓶 内水溶液充分涮洗到样品瓶所有内表面，并充分混匀；打开抽滤真空泵，用火焰将膜过滤装 置的抽滤口灭菌，并用0. 85 %无菌生理盐水冷却；将孔径为0. 45 μ m的微孔滤膜平整地覆 盖满抽滤口，将样本液倒入抽滤口，使样本液全部通过微孔滤膜；用无菌镊子将微孔滤膜取 下，即为固体样本取样完成；
[0065] 3)、样本液中微生物培养和测定：将步骤2)中的10个固体样本进行三种微生物培 养和测定，分别为：菌落总数的测定、大肠菌群的测定以及霉菌和酵母的测定，每个样本液 的每种测定均得到一个平均值；
[0066] 4)、将步骤3)中得到的每个平均值除以样品容器的内表面积的数值（单位为 cm2)，所得数值填入表3的"检出值"栏中，并求算表3中每行"检出值"的平均值，检测结果 见表3。
[0067] 对比实施例3膜过滤法
[0068] 膜过滤法的实验步骤：
[0069] 1)、样品瓶预处理：将10个带有外包装的样品瓶整包取，并除去第一层外包装（仅 一层外包装的不用除去外包装且用75%酒精消毒外包），再进入到无菌室检测（这样可以 避免外包装上面的异物污染无菌室），进入无菌室后，除去样品瓶的所有外包装；然后将未 经过杀菌处理的生鲜牛奶倒入样品瓶中，振荡使牛奶充分接触到样品瓶所有内表面，以此 来对样品瓶进行人为污染，达到模拟洁净度不高的恶劣环境下的样品瓶的目的；然后将这 些牛奶从样品瓶中倒出；
[0070] 2)、样品内表面微生物取样：
[0071] 在无菌室内，将步骤1)中的每个样品瓶分别进行以下操作：将样品瓶中倾注体积 为500mL的0. 85%无菌生理盐水，用无菌盖将样品瓶的口封住，用手振荡样品瓶，使样品瓶 内水溶液充分涮洗到样品瓶所有内表面，并充分混匀；打开抽滤真空泵，用火焰将膜过滤装 置的抽滤口灭菌，并用0. 85 %无菌生理盐水冷却；将孔径为0. 45 μ m的微孔滤膜平整地覆 盖满抽滤口，将样本液倒入抽滤口，使样本液全部通过微孔滤膜；用无菌镊子将微孔滤膜取 下，即为固体样本取样完成；
[0072] 3)、样本液中微生物培养和测定：将步骤2)中的10个固体样本进行三种微生物培 养和测定，分别为：菌落总数的测定、大肠菌群的测定以及霉菌和酵母的测定，每个样本液 的每种测定均得到一个平均值；
[0073] 4)、将步骤3)中得到的每个平均值除以样品容器的内表面积的数值（单位为 cm2)，所得数值填入表3的"检出值"栏中，并求算表3中每行"检出值"的平均值，检测结果 见表3。
[0074] 效果实施例1
[0075] 按照实施例1的方法进行样品瓶内表面微生物取样和检测的结果见表1。按照对 比实施例1的方法进行样品瓶内表面微生物取样和检测的结果见表2。按照对比实施例2 的方法进行样品瓶内表面微生物取样和检测的结果见表3。
[0076] 表1、按照实施例1的方法进行样品瓶内表面微生物取样和检测的结果
[0077]
【权利要求】
1. 一种中空容器内表面微生物的取样方法，其特征在于，包括如下步骤：在无菌环境 下，将无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液置于所测容器中，所述的无菌生理盐水或磷酸盐缓冲 液的体积为所测容器额定容量的30%?35% ;用无菌盖将所测容器的口封住，振荡所测容 器，使所测容器内水溶液充分涮洗到容器所有内表面，并充分混匀，振荡后所得溶液即为取 样的样本液；所述的中空容器的口径面积为小于或等于100平方厘米。
2. 如权利要求1所述的取样方法，其特征在于，所述的振荡的方法为人工振荡和机械 振荡； 和/或，所述的中空容器的口径面积为小于或等于90平方厘米； 和/或，所述的中空容器的材质为塑料、玻璃、金属或陶瓷； 和/或，所述的取样方法在进行前进行以下预处理：当所述的所测容器的外包装有二 层以上时，在进入所述的无菌环境之前，除去第一层外包装；当所述的所测容器的外包装仅 为一层时，先用75%酒精消毒这层外包装，然后在进入所述的无菌环境之前，除去这层外包 装。
3. 如权利要求2所述的取样方法，其特征在于，所述的机械振荡为用摇床振荡； 和/或，所述的中空容器的口径面积为小于或等于50平方厘米； 和/或，所述的中空容器的材质为塑料或玻璃。
4. 如权利要求3所述的取样方法，其特征在于，所述的中空容器的口径面积为小于或 等于20平方厘米； 和/或，所述的塑料为聚乙烯、聚丙烯或聚对苯二甲酸乙二醇酯。
5. 如权利要求1?4中任一项所述的取样方法，其特征在于，所述的无菌生理盐水为 0. 85%的无菌氯化钠水溶液，百分比为氯化钠质量相对于水溶液中水的质量的质量百分 比。
6. 如权利要求5所述的取样方法，其特征在于，所述的无菌生理盐水的配制方法的步 骤为：称量8. 5g氯化钠和1000mL蒸馏水，然后将两者混合溶解后于121°C高压灭菌15min。
7. 如权利要求1?4中任一项所述的取样方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液为 6. 8%的磷酸二氢钾水溶液，且pH值为7. 2,百分比为磷酸二氢钾质量相对于水溶液中水的 质量的质量百分比。
8. 如权利要求7所述的取样方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液的配制方法的步 骤为：称量34. 0g磷酸二氢钾和500mL蒸馏水，将两者混合溶解后，用大约175mL的lmol/L 氢氧化钠水溶液调节pH至7. 2,用蒸馏水稀释至1000mL后，取其中1. 25mL，用蒸馏水稀释 至 1000mL，121°C 高压灭菌 15min。
9. 一种中空容器内表面微生物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 、按照如权利要求1?8中任一项所述的中空容器内表面微生物取样方法进行取 样，得样本液； (2) 、用无菌吸管吸取步骤（1)中混匀的样本液中的一部分或全部，放入培养皿中进行 微生物培养，然后测定培养后的液体中微生物含量。
10. 如权利要求9中所述的检测方法，其特征在于，所述的微生物培养的方法按照 《GB4789. 2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》、《GB4789. 3-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中的第二法大肠菌群平板计数法或 《GB4789. 15-2010食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》进行培养； 和/或，所述的测定的方法按照《GB4789. 2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定》、《GB4789. 3-2010食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中的 第二法大肠菌群平板计数法或《GB4789. 15-2010食品安全国家标准食品微生物学检验霉 菌和酵母计数》进行测定； 和/或，所述的一部分的体积量为lmL。
【文档编号】C12Q1/04GK104059962SQ201410336455
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】张薇蓉, 高圣君, 刘向红 申请人:光明乳业股份有限公司