专利名称：：石质文物表面防护用微生物材料的制备方法
技术领域：
：本发明涉及石材及石质文物的防护方法，特别涉及利用一株具有碳酸盐矿化特性的土壤细菌，利用其生命过程中的酶化作用在石质材料表面矿化沉积出连续致密的碳酸钙层，对石材及石质文物进行防护的方法。
背景技术：
：暴露于自然界中的各种石质文物古迹，长期以来由于受到物理、化学和生物等因素的影响，其基体的性能逐渐遭到破坏。对于建筑和艺术雕刻中常用的碳酸盐类石材，这种现象尤其普遍，常常会出现表面疏松，微裂缝等现象，导致其内部孔隙率增加，力学性能不断下降。而且，随着现代工业的飞速发展，由环境污染造成的对石质材料的侵蚀更加严重，因此，对石质材料进行防护和修复显得迫在眉睫。石材的修复和防护研究己经有很悠久的历史。早在公元前一世纪就开始用固体石蜡修复建筑物被风化石材，但它吸附灰尘、易泛黄，难以渗入石材内部形成耐久性保护；十九世纪前无机石材和修复材料曾广泛使用，如石灰水、锌和铝的硬脂酸盐等，然而许多应用实例表明，由于其所含盐份形成的结晶膨胀，无机防护剂的使用反而加剧了石材的风化腐蚀；现在，利用有机聚合物，如环氧树脂、丙烯酸树脂，尤其是有机硅或有机氟类聚合物防护修复石质文物发展很快，取得了很好的效果，但也存在致命的缺陷，有机高分子的长期耐候性，与基材相容性较差等都是不容忽视的问题。生物矿化作用是自然界广泛发生的一种作用，它是生物形成矿物的作用，是在生物的特定部位，在一定物理化学条件下，在生物有机物质的控制或影响下，将溶液中的离子转变为固相矿物的作用。几乎每一种生物都能合成矿物，许多类型的有机体在其细胞和组织位置形成沉积矿物，并且此过程在细胞的生命活动中不断得以精确重复，这些细胞包括了细菌、海藻、原生物、乃至骨的成骨细胞。至今人类已在生物中发现了30多种不同的生物矿物，而这其中近三分之二是钙矿，四分之一是胶体材料，碳酸盐和磷酸盐更是几乎遍及了整个生物世界。生物矿化往往能形成有序排列的、结构非常优异的天然有机——无机复合材料。
发明内容技术问题本发明的目的就是提供一种石质文物表面防护用微生物材料的制备方法，利用自然界中某些微生物在其生命活动过程中不断产生的酶化作用矿化生成生物碳酸钙，利用此生物碳酸钙对石质材料的表面进行防护和加固。技术方案本发明的石质文物表面防护用微生物材料的制备方法在于，将巴氏芽胞杆菌Bacilluspasteurii接种至新鲜培养基中，在恒温培养箱中振荡培养，当菌株生长至稳定期，获得稳定期的细菌液后，在菌液中加入Ca(N03)2和尿素，并将石质试样浸泡于此混合溶液中，液面高出试件上表面510cm，室温下静置，7天后试样表面生成连续致密坚硬的碳酸钙保护层，且与基材表面结合紧密。或获得稳定期的细菌液后，将菌液离心(500(T8000rpm，5~8min)，将所得的高浓縮菌液涂抹于试样表面，待表面风干之后，轻轻涂抹一层海藻酸钠溶液，并向海藻酸钠表面滴加以新鲜培养基为溶剂，尿素和硝酸钙为溶质配制而成的混合液，混合液中尿素和硝酸钙浓度分别为广4mol/L和0.52mol/L，多次重复滴加混合液，7d后试样表面生成连续致密坚硬的碳酸钙保护层，且与基材表面结合紧密。所述的新鲜培养基是经过高温蒸汽灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基，培养基中牛肉膏的含量为36g/L，蛋白胨的含量为5~10g/L。振荡培养的条件是3CTC，170r/min。所述的菌株生长至稳定期是指对照所测菌株生长的标准曲线，用分光光度计测定菌液混浊度OD值(混浊度与菌液浓度成正比)，当其OD值在曲线上的稳定期范围内时，认为此时的菌株处于稳定生长期。所用的Ca(N03)2和尿素混合溶液中，Ca(亂)2浓度是0.5mol/L，尿素的浓度是2mol/L。有益效果与现有技术相比，本发明具有如下优点1)耐候性好由本发明生成的保护层主要由方解石型生物碳酸f5组成，是非常稳定的无机材料，不存在有机防护剂的老化问题；2)相容性好许多石材本身由碳酸盐组成，因此利用碳酸钙作为防护层很好的相容性，即使防护层失效后，对基材造成的影响很小；3)利用自然界中微生物资源，环境友好，成本低廉，工艺非常简单。图l为微生物浸泡覆膜工艺示意图。图2为菌液浸泡后石材表面沉积物的XRD图谱(C:方解石)。图3为菌液浸泡后石材表面微生物沉积出的碳酸钙的形貌。图3a为300倍的显微图，图3b为1000倍的显微图。图4为海藻酸钠固载菌株覆膜工艺示意图。图5为海藻酸钠固载菌株法所得碳酸钙的形貌。图5a为300倍的显微图，图5b为IOOO倍的显微图。图6为菌液浸泡法所得碳酸钙层的厚度。具体实施例方式为达到上述目的本发明采用如下两种技术措施一是将菌株巴氏芽胞杆菌Bacilluspasteurii接种至经高温蒸汽灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基中，在恒温培养箱中振荡培养，待菌株生长至稳定期时，取出菌液，在菌液中加入Ca(N03)2和尿素，并将试件浸泡于其中，室温下静置。二是将如措施一中所述方法得到的稳定期的细菌液离心，得到的高浓縮菌体涂抹于试样的表面，再轻轻涂抹一层海藻酸钠溶液，30min后，在海藻酸钠表面滴加混合液(新鲜培养基，尿素和硝酸钙组成)，前12h每隔3h滴加一次，后12h每隔6h滴加一次，其后三天每隔12h滴加一次。受自然界中生物矿化现象和微生物成岩的启示，利用微生物矿化沉积出的碳酸钙对石质文物进行防护。本发明的关键是在石材表面生成一层连续致密且与基材结合紧密的碳酸钙防护层。其中涉及到的主要的生物化学过程如式(1)式(3)所示。(NH2)2C0+2H20=C032—+2NH4+(1)Cell+Ca2+=Cell-Ca2+(2)Cell-Ca2++CO/—=Cell-CaC03(3)菌株生长繁殖达到一定阶段(如稳定期)后，加入底物尿素和Ca2+，在底物尿素的诱导下，细菌产生脲酶(脲酶是一种诱导酶)，继而发生酶化反应分解尿素逐渐生成C0/—和肌+，CO/—与溶液中的Ca2+碰撞，在细菌分泌的有机质的调控下，缓慢矿化生成碳酸钙颗粒。生成的碳酸钙逐渐沉积附着于石材的表面，并且由于有机质胶粘作用使碳酸钙与基材表面粘结更紧密。结合实施例对本发明详细说明如下实施例1——菌液浸泡法将菌株巴氏芽胞杆菌Bacilluspasteurii接种至经高温蒸汽灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基中(菌种液与培养基的体积比是l:50,培养基成分见表1)，在恒温培养箱中振荡培养(3(TC，170r/min)，待菌株生长至稳定期时(约1624小时后，用分光光度计测菌液的吸光度OD值在1.21.5左右)，取出菌液，在菌液中加入Ca(N03)2和尿素，最终混合溶液中Ca(N0》2和尿素的浓度均为0.5mol/L，并将试件(3cmX3cmX3cm)浸泡于其中，液面高出试件上表面5~10cm左右，室温下静置。7d后试样表面生成一层连续致密坚硬的物质，且与基材表面结合紧密。取样经XRD分析可得，这层物质主要由方解石型碳酸钙组成(如图2所示)。在金相显微镜下观察，并利用Photoshop和ImagePrcDplus软件可以测得膜层的平均厚度为184.13um(图7)。在电子扫描显微镜下观察发现，生成的碳酸钙颗粒呈球形，直径约30um，颗粒尺寸分布较均匀(如图3所示)。表1培养基成分<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2——海藻酸钠固载菌株法菌株培养至稳定期后，50008000rpm离心58min，将菌液浓度浓縮为1(Tcell/mL左右，涂刷于试件表面。待试件表面风干后，将2%的海藻酸钠溶液轻轻涂抹于其表面固载菌株。30min后，在海藻酸钠表面滴加混合液(由新鲜培养基，尿素和硝酸钙组成)，尿素和硝酸钙浓度分别为2mol/L和0.5mol/L。前12h每隔3h滴加一次，后12h每隔6h滴加一次，其后三天每隔12h滴加一次，7d后试样表面生成连续致密坚硬的碳酸钙保护层，且与基材表面结合紧密。工艺操作如图4所示。7d后试件表面生成一层连续坚硬的白色物质，经XRD测试得出这层物质仍主要由方解石型碳酸钙组成，但是还含有少量球霰石型碳酸钙。膜层平均厚度约为144.09um。电子扫描电镜下观测所形成的碳酸钙颗粒呈两种形态:一是椭球形，粒径为612um;其它的碳酸钙颗粒以一种无定形聚集在一起，如图6所示。从图6(b)还可明显看到多孔网络状物质，此为海藻酸钙。海藻酸是天然有机高分子电介质，其一价盐(Na+、K+、NH4+)为水溶性盐，而二价以上的盐(Ca"、Al3+)为水不溶性盐，因此可形成耐热的凝胶或被膜，这是海藻酸钠经Ca2+溶液钙化后形成固定化凝胶的内在机理。海藻酸钠溶液具有良好的生物相容性和传质性，常常被用作微生物和酶的载体。本发明利用海藻酸钠固定菌株于材料表面，可以防止菌体的流失，而且海藻酸钠可以与反应混合液中的(^2+生成海藻酸钙凝胶，凝胶内部多孔网络结构有利于后续矿化反应物和营养物质的传输，因此可以为菌株后续酶解矿化沉积碳酸钙提供良好的微环境，在较长时间内保证菌株胞内酶的活性，使其在材料表面持续矿化沉积出碳酸鈣，有效地起到防护作用。此项技术可应用于文物建筑的原位修复与防护。权利要求1.一种石质文物表面防护用微生物材料的制备方法，其特征在于将巴氏芽胞杆菌Bacilluspasteurii接种至新鲜培养基中，在恒温培养箱中振荡培养，当菌株生长至稳定期，获得稳定期的细菌液后，在菌液中加入Ca(NO3)2和尿素，并将石质试样浸泡于此混合溶液中，液面高出试件上表面5～10cm，室温下静置，7天后试样表面生成连续致密坚硬的碳酸钙保护层，且与基材表面结合紧密。2.根据权利要求1中所述的石质文物表面防护用微生物材料的制备方法，其特征在于获得稳定期的细菌液后，将菌液离心，将所得的高浓縮菌液涂抹于试样表面，待表面风干之后，轻轻涂抹一层海藻酸钠溶液，并向海藻酸钠表面滴加以新鲜培养基为溶剂，尿素和硝酸钙为溶质配制而成的混合液，混合液中尿素和硝酸钙浓度分别为14mol/L和0.52mol/L，多次重复滴加混合液，7d后试样表面生成连续致密坚硬的碳酸钙保护层，且与基材表面结合紧密。3.根据权利要求1所述的石质文物表面防护用微生物材料的制备方法，其特征在于所述的新鲜培养基是经过高温蒸汽灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基，培养基中牛肉膏的含量为36g/L，蛋白胨的含量为510g/L;振荡培养的条件是30°C，170r/min。4.根据权利要求1所述的石质文物表面防护用微生物材料的制备方法，其特征在于所述的菌株生长至稳定期是指对照所测菌株生长的标准曲线，用分光光度计测定菌液混浊度OD值，当其OD值在曲线上的稳定期范围内时，认为此时的菌株处于稳定生长期。5.根据权利要求1所述的石质文物表面防护用微生物材料的制备方法，其特征在于所用的Ca(N03)2和尿素混合溶液中，Ca(N0》2浓度是0.5mol/L，尿素的浓度是2mol/L。全文摘要石质文物表面防护用微生物材料的制备方法涉及石材及石质文物的防护方法，特别涉及利用一株具有碳酸盐矿化特性的土壤细菌，利用其生命过程中的酶化作用在石质材料表面矿化沉积出连续致密的碳酸钙层，对石材及石质文物进行防护的方法，该方法将巴氏芽胞杆菌Bacilluspasteurii接种至新鲜培养基中，在恒温培养箱中振荡培养，当菌株生长至稳定期，获得稳定期的细菌液后，在菌液中加入Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>和尿素，并将石质试样浸泡于此混合溶液中，液面高出试件上表面5～10cm，室温下静置，7天后试样表面生成连续致密坚硬的碳酸钙保护层，且与基材表面结合紧密。文档编号C04B41/45GK101475401SQ20091002801公开日2009年7月8日申请日期2009年1月5日优先权日2009年1月5日发明者亮成,王剑云,王瑞兴,钱春香申请人:东南大学