专利名称：高特异性多个运动机能相关基因检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种高特异性多个运动机能相关基因检测试剂盒及检测方法，同时检测4个运动机能相关基因，属于生物检测技术领域。
背景技术：
随着人类基因组计划的完成，后基因组计划的全面展开，以基因工程为主导的生物技术在体育运动问题领域的应用得到广泛的关注。基因遗传工程应用于运动员选材是历史必然、大势所趋，它必将从根本上引起运动选材理论和方法的革命。运用遗传学的理论和方法进行运动选材已经有了初步进展。与个体运动能力的相关多个基因位点已经被发现，遗传工程应用于运动选材的前景广阔而紧迫目前较为成熟的运动人材基因筛选的相关位点包括
I. ACE 基因目前人们普遍认为ACE(血管紧张素转化酶)水平和心血管的形态、功能密切相关。ACE基因的多态性是人耐力素质优劣的决定性因素之一，其作为一个有价值的遗传标志，有望成为科学选材的理想指标。肾素一血管紧张素系统(RAS)在心血管系统中作用显著，如调节血压、血容量、血管张力，引起血管壁增厚或心肌细胞肥大和非心肌细胞的增殖，是血压和体液、电解质平衡的主要调节因素之一。ACE是RAS酶/底物链反应体系中的关键酶，ACE的作用是催化十肽血管紧张素I (Ang I)转变为八肽的血管紧张素II (Ang II)。ACE的水平决定着RAS中Ang II的生成量。临床上认为ACE为高血压的致病因素之一。分子遗传学研究发现ACE基因位于第16内含子的一段287bp的Alu序列的插入
(I)/缺失(D)有多态性，使ACE基因有三种基因型11(插入纯合型)、ID (插入/缺失型)和DD (缺失纯合型)。I使人体血液中的ACE水平较低，形式D起相反作用。II型的人，其耐力比拥有两个D基因的人要强。I基因能增强肌肉吸收氧和营养成份的能力，助于增强人的有氧耐力。有实验证明在不同基因型的个体中，机体局部耐力机能的改善有明显的个体差异在对训练的敏感度上，II纯合子比DD纯合子大11倍。2. CKMM 基因肌酸激酶(CK)是Cr+MgATP+H——PCr+MgADP反应的关键酶。CK与磷酸肌酸组成肌酸一磷酸肌酸穿梭系统，在细胞内的作用一是，在高能量需求时作为“暂时的能量缓冲系统”保持ATP / ADP的比率；二是，作为能量转运单位，将能量从产生部位转运到利用部位。肌型肌酸激酶是一种组织特异性酶，主要在骨骼肌中表达，心肌中也有少量表达。肌肉中CKMM主要集中在M线附近，其主要功能是在肌球蛋白头部生成高浓度的ATP，为肌肉收缩及运动提供能量，CKMM也存在肌质网Ca ATP酶附近，可能影响Ca的再聚集，从而影响肌肉的工作能力。研究表明，人的CKMM基因的多态性与耐力以及耐力训练效果有关。CKMM基因多态性的三种基因型分别为AA型、GG型和杂合子AG型。研究结果显示与耐力训练前相比，训练后相通亚极限强度运动时，AA、AG型的人运动能力提高显著，但GG型训练后各种指标改变不明显。因此GG型基因为耐力训练中最不敏感，携带A等位基因的AA型、AG型人对耐力训练的敏感性显著高于和GG型。最新研究表明在高强度运动后出现的肌痛、肌酸激酶增高等横纹肌溶解症状，与ACE与CKMM基因有密切的关系。运动后与D等位基因(ACE基因)和G等位基因(CKMM基因)的个体更易出现肌酸激酶高反应。而同时具有DD基因型(ACE基因)和GG基因型(CKMM基因)的人，会出现运动后肌酸激酶异常升高，D+G基因型有相加作用。3.促红细胞生成素(EPO)基因EPO作用于红骨髓造血干细胞，促使干细胞分裂、分化，生成红细胞的过程称为“促红细胞生成”，这是机体产生新生红细胞的唯一途径。EPO对人体生理作用是这样的重要，以至于20年前就把它作为第一个造血因子来克隆用于临床治疗。
重组人促红细胞生成素(EPO)已为人们所熟知。也就是把人体红细胞生成素基因转移到动物细胞中，增加了其体内的血红细胞数量和促红细胞生成素浓度。EPO能通过增加人的最大摄氧量而增加人的有氧耐力，可见是医学技术促进了把EPO作为兴奋剂用于有氧耐力型项目。可以大大增加人体血红细胞的变异基因现在已经找到。人类在低氧环境下产生的适应性生理性变化存在明显个体差异性。有报道指出，在模拟海拔2800m低氧暴露24h血清促红细胞生成素浓度变化存在明显的不同(-41% — 400%)。部分长跑选手进行低氧训练研究发现，训练后最大摄氧量(V02max)的变化从-3. 2到18. 7ml/(min · kg)不等。EPO能促进红细胞释放进入血液，最终减轻低氧对机体的损伤，因此EPO基因序列多态性可能与不同个体间对低氧适应性具有差异性。针对位于人类EPO基因全序列第3541bp处，在EPO基因3 ‘端增强子上，一个T/G单核苷酸多态性，即SNP/T3541G的研究表明，在EPO基因T3541G位点的三种基因型TT型、TG型、GG型中，携带T等位基因的人群低氧适应能力较GG型更强。4.ACTN3 基因研究发现，ACTN3基因确与肌肉爆发力相关，能在早期对运动员的爆发力发展有准确的预测。将ACTN3基因技术应用在运动员选材领域，不仅能够提高选材的准确率，还能大大减少优秀运动员的培养成本，更重要的是实现早期训练项目定位，即能有效地提高成材率。ACTN (α -辅肌动蛋白)是肌动蛋白的结合蛋白，主要分布于肌纤维Z线附近(类似致密体)帮助定位肌原纤维肌动蛋白微丝。ACTN有ACTNl、2、3、4种存在形式，人类只有ACTN2和ACTN3。ACTN2存在于骨骼肌和心肌中，ACTN3仅存在于骨骼肌快肌纤维中。已证实，ACTN3基因16号外显子的1747核苷酸发生C — T突变而产生终止密码子，取代577R氨基酸残基的精氨酸，形成577Χ，使得ACTN3蛋白缺失，影响肌肉拉伸速度，降低爆发力，约16%的人存在此多态。ACTN3T等位基因阻止该蛋白质的完全制造。有两个T等位基因的人将不能在他们的快缩肌纤维中制造α肌动蛋白3，因而在爆发力方面处于劣势，那些CT基因型因为有一个功能性的基因，因而还能制造α肌动蛋白3。而CC基因型则由于拥有两个ACTN3基因而拥有其他人无法比拟的基因条件。ACTN3基因多态性与爆发力素质有相关性，CC纯合型速度素质优于CT、TT型，研究者认为577R可以作为爆发力相关项目运动员的基因选材指标。目前常用的基因检测方法有直接测序(direct sequencing, DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段长度多态性分析(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)> 变性高效液相色谱分析(denaturing highperformance liquid chromotography,DHPLC)、定量PCR。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。采用荧光标记技术、毛细管电泳技术、多重PCR复合扩增，通过带不同荧光标记物的多对引物同时对运动机能相关基因ACTN3、EPO、CKMM、ACE特异性的扩增，而后经毛细管电泳后分析PCR产物出峰情况，即可实现对这4个运动机能相关基因位点的同时检测。该方法灵敏度高、判读清晰准确、采样方便，并能实现一次性获得4个关键位点结果的高通量筛查流程，大大节约了人力物力和时间。
发明内容
本发明的目的是提供一种高特异性多个运动机能相关基因检测试剂盒及检测方法，该试剂盒能同时检测4个运动机能相关基因ACTN3、EPO、CKMM、ACE。本发明所述的检测试剂盒是同时检测4个运动机能相关基因的荧光检测试剂盒， 该试剂盒包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2, dNTPs的混合物，Taq酶，4组引物混合物以及超纯水；所述扩增后试剂包括内标和用于基因分型的基因分型标准物；使用所述的试剂盒进行PCR复合扩增反应的条件PCR扩增体系的pH值为
8.0-9. 0，镁离子浓度为1.5-3. 5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300 μ M，Taq酶的用量为
0.1-0. 4U/μ L，引物混合物中的单对引物终浓度为0. 2-0. 4 μ M0使用所述试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在一个复合扩增反应体系中同时扩增 ACTN3、EPO、CKMM、ACE 基因。用于ACE基因检测的引物为SEQ NO. I :5’ -CTGGAGAGCCACTCCCATCCTTTCT-3’SEQ NO. 2 :5，-TAAGGGGAGCTCAGAGAATTTCAG-3’SEQ NO. 3 :5’ -GCACTC CAG CCT GGG C-3，；用于ACTN3基因检测的引物为SEQ NO. 4 :5’ -TTT CTG TTG CCT GTG GTAAGT GG-3’ ；SEQ NO. 5 :5，-GTTAGAT GGC ACC TCG CTC TCA-3’SEQ NO. 6 :5，-GAT GGCACC TCG CTC TCG-3，；用于CKMM基因检测的引物为SEQ NO. 7 :5’ -AGG GTG TCA GGT GTG AAA GAA TCA-3’SEQ NO. 8 :5’ -GTATCCT TAC TTT CTC AAG AAC CTG CCG-3’SEQ NO. 9 :5’ -CCTTAC TTT CTC AAG AAC CTG CCA-3’ ；用于EPO基因检测的引物为SEQ NO. 10 :5，-CAT CAG CCGAAGAGACCAAAGA-3’SEQ NO. 11 :5，-GTAAGCCTAC GCT GGT CAA TAA GGT GG-3’SEQ NO. 12 :5’ -GCC TAC GCT GGT CAATAAGGT GT-3，。所述的4组引物，其中每组引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记，可以采用相同或不同的荧光染料标记；内标选用不同于上述的荧光染料标记。所述ACTN3、EPO、CKMM、ACE基因的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
采用所述试剂盒应用于运动机能相关基因检测的方法，通过荧光引物PCR及毛细管电泳特异性检测运动机能相关基因ACTN3、EPO、CKMM、ACE ;用于ACE检测的引物为SEQNO. USEQ NO. 2,SEQ NO. 3 ;用于 ACTN3 检测的引物为SEQ NO. 4,SEQ NO. 5,SEQ NO. 6 ;用于CKMM检测的引物为=SEQ NO. 7、SEQ NO. 8、SEQ NO. 9 ;用于EPO检测的引物为=SEQ NO. 10、SEQ NO. 11、SEQ NO. 12，所述各基因的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。其中所检测的人基因组DNA为使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA ;所述的来源样本为来源于人类的滤纸片血斑/ 口腔拭子样本、FTA卡血斑/ 口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液。使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行，扩增程序:94-980C l-5min ;26_32 个循环的 94-98°C 15-60s, 55-65 °C 15-60s,72°C 15_60s ；60 °C 30-60min。本发明的有益效果如下本发明提供的试剂盒是能够同时检测4个运动机能相关基因的荧光检测试剂盒，该试剂盒可在3个小时内同时检测四个运动机能相关基因中的4个热点突变。本发明以ACTN3、EPO、CKMM、ACE为检测对象，通过上述位点的扩增，毛细管电泳检测，与基因分型标准物的对比，即可进行基因分型，筛选出具有特定基因型的个体，为体育选材提供参考。在体育选材方面首次复合采用了荧光标记技术、毛细管电泳技术实现对运动机能相关基因的高灵敏度特异性同时检测，大大节约了人力物力和时间。
图I是本发明的试剂盒对71-2号样本4个不同基因型个体DNA扩增后的分型结果图；图2是本发明的试剂盒对74-2号样本4个不同基因型个体DNA扩增后的分型结果图；图3是本发明的试剂盒对73-4号样本4个不同基因型个体DNA扩增后的分型结果图；图4是本发明的试剂盒对87号样本4个不同基因型个体DNA扩增后的分型结果图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明做进一步描述。实施例I本发明的试剂盒检测4个不同个体的DNA样本。用于运动机能相关基因检测的引物采用蓝色荧光染料标记，内标采用红色荧光染料标记。I、待测样本4份，都已经使用“DNA提取-PCR扩增-测序”的技术方法对各位点进行过测序检测。其中，71-2号样本ACE、ACTN3、CKMM、EP0四个基因的分型结果依次为D/D、C/T、G/G、T/G，74-2号样本的分型结果依次为1/1、C/T、A/A、T/G，73_4号样本的分型结果依次为D/D、T/T、A/A、T/T，87号样本的分型结果依次为D/D、C/C、A/G、T/G。2、检材的基因组DNA提取Chelex提取法剪下I 3mm血斑置于I. 5mL离心管中，加入SdH2O ImL,振荡离心，弃上清液，重复步骤两次，弃上清液，将5%Chelex-100震荡悬浮后快速用剪掉的枪头吸取200 μ L加入离心管中，振荡数秒，。于56°C水浴保温30min后，振荡数秒。95°C沸水浴IOmin,轻微振荡数秒。2000rpm离心5min,上清中为提取的DNA。3、扩增和扩增产物的检测分析3. IPCR 扩增体系
体积(μυ组分说明
Reaction Mix10含 pH 为 8.3 的 2.5><PCR 缓冲液、7.5
mM 的 MgCl2、750 μM dNTP MixTaq B (5υ/μ ) OS
Primers5本发明的4组引物对(0.2uM)
模板0.2-5.0ng
SdH2O 补足至 25.0pL3. 2PCR 扩增程序
初始变性热循环终延伸950C 5min 30 个循环60°C 60min
98°C 30s, 59°C 30s, 72 °C 30s4、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物〔(0.2yL分子量内标)X (进样数)+(9. SyL去离子甲酰胺)X (进样数)〕。将IOyL上样混合物与I μ L扩增产物或等位基因分析标准物混合，避免产生气泡。95°C变性5min，冰浴5min，并尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。5、结论本发明分型完整清晰，结果如图1-4所示图I :71-2号样本ACE、ACTN3、CKMM、EP0四个基因的分型结果依次为D/D、C/T、G/G、T/G,与测序结果一致。ACE基因分型位置出现114bp峰值约2650H的单峰，检为D/D纯合；ACTN3基因分型位置出现127bp峰值约1200H、131bp峰值约1450H的双峰，检为C/T杂合；CKMM分型基因的位置出现166bp峰值约3500H的单峰，检为G/G纯合；ΕΡ0基因分型位置出现219bp峰值约900H、223bp峰值约500H的双峰，检为T/G杂合，提示该个体低氧适应能力较强。图2 74-2号样本ACE、ACTN3、CKMM、EP0四个基因的分型结果依次为I/I、C/T、A/A、T/G,与测序结果一致。ACE基因分型位置出现IlObp峰值约1500H的单峰，检为I/Ι纯合，提示该个体耐力更强；ACTN3基因分型位置出现127bp峰值约900H、131bp峰值约1100H的双峰，检为C/T杂合；CKMM分型基因的位置出现162bp峰值约2800H的单峰，检为A/A纯合，提示该个体具有较好的训练敏感性；EPO基因分型位置出现219bp峰值约2200H、223bp峰值约1600H的双峰，检为T/G杂合，提示该个体低氧适应能力较强。图3 73-4号样本ACE、ACTN3、CKMM、EP0四个基因的分型结果依次为D/D、T/T、A/A、T/T,与测序结果一致。ACE基因分型位置出现114bp峰值约2450H的单峰，检为D/D纯合；ACTN3基因分型位置出现131bp峰值约2100H的单峰，检为T/T纯合；CKMM分型基因的位置出现162bp峰值约2800H的单峰，检为A/A纯合，提示该个体具有较好的训练敏感性；EPO基因分型位置出现219bp峰值约4000H的单峰，，提示该个体低氧适应能力较强。图4 87号样本ACE、ACTN3、CKMM、EP0四个基因的分型结果依次为D/D、C/C、A/G、T/G,与测序结果一致。ACE基因分型位置出现114bp峰值约2850H的单峰，检为D/D纯合；ACTN3基因分型位置出现127bp峰值约2600H的单峰，检为C/C纯合，提示该个体具有较好的爆发力；CKMM分型基因的位置出现162bp峰值约2650H、166bp峰值约2200H的双峰 ，检为A/G杂合，提示该个体具有较好的训练敏感性；ΕΡ0基因分型位置出现219bp峰值约800H、223bp峰值约1300H的双峰，检为T/G杂合，提示该个体低氧适应能力较强。与测序方法相比较对同一来源的样本的相同基因座分型结果是一致的。以上实施例中所用的不同pH的2. 5XPCR缓冲液，用不同pH值的Tris-HCl缓冲液配制，I XPCR缓冲液中的Tris-HCl浓度为10mM，KCl浓度为50mM ;本发明中所用的Taq聚合酶以及其他试剂及材料均为市售产品。
权利要求
1.一种高特异性多个运动机能相关基因检测试剂盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其缓冲溶液、扩增各基因的引物、内标及基因分型标准物，所述运动机能相关基因为ACTN3、EPO、CKMM、ACE。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于 用于ACE基因检测的引物为SEQ NO. I :5’ -CTGGAGAGCCACTCCCATCCTTTCT-3’SEQ NO. 2 :5’ -TAAGGGGAGCTCAGAGAATTTCAG-3 SEQ NO. 3 :5’ -GCA CTC CAG CCT GGG C-3’ ； 用于ACTN3基因检测的引物为SEQ NO. 4 :5’ -TTT CTG TTG CCT GTG GTA AGT GG-3’SEQ NO. 5 :5’ -GTTAGAT GGC ACC TCG CTC TCA-3’SEQ NO. 6 :5’ -GAT GGC ACC TCG CTC TCG-3’ ； 用于CKMM基因检测的引物为SEQ NO. 7 :5’ -AGG GTG TCA GGT GTG AAA GAA TCA-3’SEQ NO. 8 :5’ -GTATCCT TAC TTT CTC AAG AAC CTG CCG-3’SEQ NO. 9 :5’ -CCT TAC TTT CTC AAG AAC CTG CCA-3’ ； 用于EPO基因检测的引物为SEQ NO. 10 :5’ -CAT CAG CCG AAG AGA CCA AAG A-3’SEQ NO. 11 :5’ -GTAAGCC TAC GCT GGT CAA TAA GGT GG-3’SEQ NO. 12 :5’ -GCC TAC GCT GGT CAA TAA GGT GT-3’。
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述用于ACTN3、EP0、CKMM、ACE基因扩增的引物，每组引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记。
4.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述ACTN3、EP0、CKMM、ACE基因检测的引物可以采用相同或不同的荧光染料标记；内标选用不同于上述的荧光染料标记。
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述ACTN3、EP0、CKMM、ACE基因的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
6.一种采用权利要求I所述试剂盒应用于运动机能相关基因检测的方法，其特征在于通过荧光引物PCR及毛细管电泳特异性检测运动机能相关基因ACTN3、EP0、CKMM、ACE ；用于ACE检测的引物为SEQ NO. I、SEQ NO. 2、SEQ NO. 3 ;用于ACTN3检测的引物为SEQNO. 4、SEQ NO. 5、SEQ NO. 6 ;用于 CKMM 检测的引物为SEQ NO. 7、SEQ NO. 8、SEQN0. 9 ;用于EPO检测的引物为=SEQ NO. 10、SEQ NO. 11、SEQ NO. 12，所述各基因的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种高特异性多个运动机能相关基因检测试剂盒及检测方法，属于生物检测技术领域。该试剂盒可在3个小时内同时检测四个运动机能相关基因中的4个热点突变，该试剂盒包括扩增前试剂和扩增后试剂以及高特异性扩增ACTN3、EPO、CKMM、ACE四个基因中4个热点突变的引物混合物。本发明以上述4个基因为检测对象，通过上述位点的扩增，毛细管电泳检测，与基因分型标准物的对比，即可进行基因分型，筛选出具有特定基因型的个体，为体育选材提供参考。在体育选材方面首次复合采用了荧光标记技术、毛细管电泳技术实现对运动机能相关基因的高灵敏度特异性同时检测，大大节约了人力物力和时间。
文档编号G01N21/64GK102864223SQ20121031681
公开日2013年1月9日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者步迅, 夏子芳 申请人:山东百福基因科技有限公司, 步迅, 夏子芳