一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学【技术领域】，提供了一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法，包括：对α–变形细菌的标样，需要进行以下步骤：α–变形细菌标样的复苏；大肠埃希氏菌感受态细胞的制备；α–变形细菌标样转化入感受态细菌；α–变形细菌标样的挑菌培养；α–变形细菌标样质粒的提取；α-变形细菌定量双链DNA含量的测定；待测生物膜样品的预处理；实时荧光定量PCR检测。本发明具有分析速度快、制约因素少、准确性高、减少主观因素影响的优点，为研究饮用水系统的微生物稳定性提供支撑，为给水管网的水质净化提供更加科学的依据。
【专利说明】-种生物膜Ct-变形细菌的定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学【技术领域】，特别涉及一种能够满足对微生物群落结构变化 进行动态监测的要求、定量检测的数据更加准确、全面、灵敏的生物膜α -变形细菌的定量 检测方法。
【背景技术】
[0002] 变形菌门是细菌中最大的一门，包括很多病原菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、孤菌、螺 杆菌等，变形细菌均为革兰氏阴性菌。根据rRNA的不同，变形菌通常分为5类，分别用希腊 字母α、β、 Υ、δ和ε命名。无论作为共生体还是病原体，变形细菌均与真核生物有着 密切的交互作用。在城市给水系统中，变形细菌占有主导性，α-变形菌除包括光合的种类 夕卜，还具有代谢C1化合物的种类、植物共生的细菌，例如：根瘤菌属、动物共生的细菌和一 类危险的致病菌立克次体目。
[0003] 目前，国内对水处理工艺及管网生物膜生长和结构的研究较少，并且方法大多停 留在细菌学指标阶段，较多采用传统纯培养技术来检测分析微生物，对于大多数微生物的 样本，微生物形态学仅能提供极少的线索。再者，基于培养的微生物检测技术由于存在高度 的选择性和费时、费力等缺点，不能满足分析微生物群落的结构与功能关系的需要。除此之 夕卜，许多有机体是不可培养的，生态系统中微生物多样性难以被确定；传统的分离计数技术 也难以满足对微生物群落结构变化进行动态监测的要求。
[0004] 因此，分子生物学【技术领域】迫切需要一种针对α -变形细菌的定量检测分析更为 准确、全面、灵敏的生物膜α -变形细菌的定量检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法，技术方案如下：
[0006] -种生物膜α -变形细菌的定量检测方法，其中，包括如下步骤：
[0007] 步骤一，对α -变形细菌的标样进行预处理，得到新鲜活化的标样菌液，具体操 作如下；
[0008] 将在低温下保存的α -变形细菌标样取出，将其溶解至室温，并且充分混匀；
[0009] 进一步地，取混匀后的液态α -变形细菌标样加入灭菌的LB液体培养基中；
[0010] 进一步地，将其置于恒温摇床中进行培养，培养后得到新鲜活化的标样菌液；
[0011] 步骤二，大肠埃希氏菌感受态细胞的制备，具体操作如下：
[0012] Α.选用大肠埃希氏菌菌株，并且从LB固体平板上挑取单菌落置于灭菌的LB液体 培养基中；
[0013] 进一步地，将其置于恒温摇床中进行培养，培养后得到新鲜大肠杆菌菌液；
[0014] Β.将Α中新鲜培养的大肠杆菌菌液充分混匀，取此大肠杆菌菌液放入灭菌的LB液 体培养基中；
[0015] 进一步地，将其置于适当温度下进行培养；
[0016] C.取B中培养后得到的大肠杆菌菌液；
[0017] 进一步地，将其放在离心机中预冷，使其降温；
[0018] 进一步地，将其放在离心机中进行高速离心，并缓慢去除上清液；
[0019] D.向C中已经去除上清液的大肠杆菌菌液中加入预冷的灭菌CaCl2，充分混匀；混 匀后，继续加入预冷的灭菌CaCl 2 ;
[0020] E.将装有D中菌液的离心管放在散冰中静置；
[0021] 进一步地，将静置后的离心管放在离心机中高速离心，并缓慢去除上清液；
[0022] 进一步地，向此离心管中继续加入预冷的灭菌CaCl2，在散冰上轻柔地摇匀，得到 大肠埃希氏菌感受态细胞；
[0023] 步骤三，将步骤一中经过预处理的α -变形细菌标样转化入步骤二中的大肠埃 希氏菌感受态细菌菌液中，为考察感受态效果，选用阳性质粒进行转化试验，具体操作如 下：
[0024] Α.分别从步骤二中制得的大肠埃希氏菌感受态细菌菌液中提取等量的液体放入 2个离心管中；
[0025] 进一步地，一个不加入任何其他试剂，作为阴性对照；
[0026] 进一步地，向另一个离心管中加入阳性质粒，作为阳性对照；
[0027] 进一步地，将2个离心管都置于冰水混合物中，进行冰水浴；
[0028] Β.将Α中冰水浴后的2个离心管分别放入水浴中进行热激；
[0029] 进一步地，迅速将热激后的2个离心管再次放置于冰水浴中冷却；
[0030] C.向B中冰水浴后的2个离心管中分别加入灭菌的LB液体培养基，混匀后将2个 离心管都置于恒温摇床中进行培养、复苏；
[0031] 进一步地，将复苏后的2个离心管都放在离心机中高速离心，并缓慢去除上清液；
[0032] 进一步地，将去除上清液的2个离心管充分混匀，混匀后将2个离心管内的菌液分 别涂布到含氨苄青霉素的2块LB固体平板上；
[0033] 进一步地，分别倒置2块LB固体平板，并且将其都放在适当温度下进行培养；
[0034] D.培养后，观察2块LB固体平板，若阴性平板无菌落，阳性平板菌落较多，则证明 大肠埃希氏菌感受态菌液制作效果良好，将步骤一中制得的α-变形细菌复苏活化后的新 鲜菌液与步骤二中制得的大肠埃希氏菌感受态菌液相连接，具体操作为：
[0035] 首先，分别从步骤二中制得的大肠埃希氏菌感受态菌液中提取等量的液体放入多 个离心管中；
[0036] 进一步地，一个不加入任何其他试剂，作为阴性对照，标记为空白样；
[0037] 进一步地，向其它离心管中分别加入α -变形细菌复苏活化后的新鲜菌液，对应 标记为α-变形细菌；
[0038] 进一步地，将所有离心管都置于冰水混合物中进行冰水浴，并重复本步骤三中的 步骤B-C ;
[0039] 进一步地，培养后的多块LB固体平板为α -变形细菌转化入大肠杆菌后的新鲜变 形细菌菌落产物；
[0040] 步骤四，对步骤三中制得的α -变形细菌转化入大肠杆菌后的新鲜变形细菌菌落 产物的挑菌培养，具体操作如下：
[0041] 首先，在灭菌的LB液体培养基中加入氨苄青霉素；
[0042] 进一步地，向灭菌后的离心管中，加入从步骤三中制得的α -变形细菌转化入大 肠杆菌的LB固体平板中挑出的单个菌，再加入上述含有氨苄的LB液体培养基；
[0043] 进一步地，将上述离心管置于恒温摇床中进行培养；
[0044] 步骤五，采用质粒抽提试剂盒对步骤四中培养后的挑菌进行质粒提取，提取方法 按试剂盒说明所述进行；
[0045] 步骤六，采用超微量核酸蛋白测定仪对步骤五中α -变形细菌提取的质粒进行定 量双链DNA含量的测定；
[0046] 步骤七，进行待测生物膜的预处理，具体操作为：
[0047] 首先，从水处理工艺或管道内壁采集生物膜样品；
[0048] 进一步地，向采集的生物膜样品中加入适量的灭菌生理盐水，并进行超声预处 理；
[0049] 进一步地，采用提取DNA试剂盒进行DNA的提取；
[0050] 进一步地，DNA提取完毕后，采用琼脂糖凝胶电泳或通过PCR扩增再电泳对提取的 DNA进行定量测量；
[0051] 步骤八，对步骤五、七中的标准α-变形细菌、生物膜样品分别采用实时荧光定量 PCR检测，具体操作为：
[0052] Α.标准α -变形细菌的检测；
[0053] 根据步骤六中α-变形细菌的DNA含量的测定结果，将步骤五中α-变形细菌的 质粒原液做5?10倍的连续梯度稀释，将稀释后的α-变形细菌的质粒菌液作为标准品；
[0054] 进一步地，根据上述实时荧光定量PCR反应体系、条件绘制出不同浓度的α-变 形细菌标准品的扩增曲线，来测定样品中目的基因模板量，空白对照保持水平，非常平整； 扩增曲线的指数区较明显，陡度大，平台区汇于一起，线性范围宽，因此则扩增效果非常理 想；
[0055] 进一步地，绘制溶解曲线，溶解曲线基本重合在一起，具有单一峰、无杂峰的特点， 表明无其他产物或引物二聚体的非特异性荧光，定量准确；
[0056] 因此，该目的基因模板量一般集中在103copy/y 1?107copy/y 1之间，故剔除 108、109的数值，取103copy/y 1?107copy/y 1的稀释浓度为已知浓度；
[0057] B.对生物膜样品的检测；
[0058] 步骤九，对步骤八中测得的DNA含量进行结果分析；
[0059] 分别对步骤八中已知浓度为103copy/ μ 1?107copy/ μ 1的溶液测得的DNA含量 进行标准曲线的绘制和分析，当相关系数R2>〇. 99且扩增效率在0. 9-1. 1之间时，认为扩增 有效且结果可信；
[0060] 根据步骤六中测得的DNA含量及其扩增结果的分析，结果分析，得到标准曲线方 程y = -ax+b，进而求出DNA含量X的值；其中，y表示循环阈Ct值，X表示DNA浓度，X是 以10为底的对数，a、b表示系数；以a接近于3. 33且初始b在38-40之间时，标准曲线最 为理想。
[0061] 如上所述的一种生物膜α -变形细菌的定量检测方法，其中，步骤一至四中的LB 液体培养基的灭菌条件为：121°C高温下灭菌25min。
[0062] 如上所述的一种生物膜α -变形细菌的定量检测方法，其中，步骤二中预冷的灭 菌CaCl2为CaCl2在冰水混合物中预冷至0度。
[0063] 如上所述的一种生物膜α -变形细菌的定量检测方法，其中，步骤三中的含氨苄 青霉素的2块LB固体平板为向每100ml固体培养基加入200-250ml氨苄青霉素
[0064] 如上所述的一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法，其中，步骤四中向灭菌 的LB液体培养基中加入氨苄青霉素的具体操作为：向每40ml灭菌的LB液体培养基加入 80 μ 1氨苄青霉素。
[0065] 如上所述的一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法，其中，由于大肠埃希氏菌 感受态细胞受温度影响较大，故成功制备的感受态细胞需完全置于散冰中低温保存，并于 制备之日起5日内尽快使用。
[0066] 如上所述的一种生物膜α -变形细菌的定量检测方法，其中，步骤八中的实时荧 光定量PCR的体系包括：SYBR? Green Realtime PCR Master Mix,正向引物，反向引物，灭 菌去离子水ddH20，模板DNA。
[0067] 如上所述的一种生物膜α -变形细菌的定量检测方法，其中，步骤八中α -变形细 菌的正向引物采用
[0068] 5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGCGCGGGGGCACGGGGGGCCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGAT ΤΤΑΤ-3 '，反向引物采用 5' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 '。
[0069] 如上所述的一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法，其中，步骤八中实时荧光 定量PCR扩增反应的条件为：预变性条件为95°C保持3min ;变性扩增条件为95°C保持15s， 延伸条件为60°C保持60s，该过程共循环40次；最后在72?99°C下解离。
[0070] 本发明的有益效果：
[0071] 1、每次荧光定量PCR试验均需进行标准曲线的同步测定，每个样品宜取2个平行 样，每次试验需采用1组空白对照，进而考察反应体系是否被污染，通过与空白标样进行比 较，判断更为准确。
[0072] 2、所有试验材料均需高温灭菌处理后密封烘干使用，配置体系时需在无菌超净 台中进行操作，防止带入细菌，对实验的结果造成干扰；由于SYBR? Green Realtime PCR MasterMix试剂的热感性，所有操作均需在冰上进行，防止放热，降低细菌定量测量的准确 性。
[0073] 3、本发明选择α-变形细菌为研究对象进行定量分析研究，建立了基于SYBR Green I的实时荧光定量PCR技术检测管网、管壁生物膜微生物结构组成的方法，通过步骤 九可准确检测出α -变形细菌的数量，从微观角度定量了解生物膜的组成与结构。因此， 有效的克服了传统纯化培养方法分析速度慢、制约因素多、低估生物多样性、准确性低、主 观因素强等问题，以更加科学地监测水处理工艺及管网生物膜中致病菌的信息，反映饮用 水系统中的潜在危害，从而为研究饮用水系统的微生物稳定性提供支撑，为给水管网的水 质净化提供更加科学的依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0074] 下面结合附图和【具体实施方式】来详细说明本发明：
[0075] 图1是本发明一种生物膜α -变形细菌的定量检测方法的溶解曲线。
[0076] 图2是本发明一种生物膜α -变形细菌的定量检测方法的标准曲线。
【具体实施方式】
[0077] 为了使本发明技术实现的措施、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合具体图示，进一步阐述本发明。
[0078] -种生物膜α -变形细菌的定量检测方法，其中，包括如下步骤：
[0079] 步骤一，样品的预处理；
[0080] 首先，对α -变形细菌的标样进行预处理，即进行α -变形细菌标样的复苏操 作，得到新鲜活化的标样菌液，具体操作如下；
[0081] 将在-80°C低温下保存的α-变形细菌标样取出，将其溶解至室温，并且充分混 匀；
[0082] 进一步地，取20 μ 1混匀后的液态α -变形细菌标样加入用前在121°C高温下灭菌 25min的2ml LB液体培养基中；
[0083] 进一步地，将其置于37°C、转速控制在160rpm的恒温摇床中进行培养，24h后得到 新鲜活化的标样菌液；
[0084] 步骤二，大肠埃希氏菌感受态细胞的制备，具体操作如下：
[0085] A.选用大肠埃希氏菌菌株，并且从LB固体平板上挑取单菌落置于用前在121°C高 温下灭菌25min的lml的LB液体培养基中；
[0086] 进一步地，将其置于37°C、转速控制在160rpm的恒温摇床中进行培养，24h后得到 新鲜大肠杆菌菌液；
[0087] B.将A中新鲜培养的大肠杆菌菌液充分混匀，取400 μ 1此大肠杆菌菌液放入用前 在121°C高温下灭菌25min 40ml灭菌的LB液体培养基中；
[0088] 进一步地，将其置于37°C下培养lOOmin ;
[0089] C.取B中在37°C下培养lOOmin的50ml大肠杆菌菌液；
[0090] 进一步地，将其放在离心机中预冷，使其降温至4°C ;
[0091] 进一步地，将其放在4°C、转速为6000rpm的离心机中高速离心5min，并缓慢去除 上清液；
[0092] D.向C中已经去除上清液的大肠杆菌菌液中加入lml在冰水混合物中预冷至0度 的灭菌CaCl 2，充分混匀；混匀后，继续加入20ml在冰水混合物中预冷至0度的灭菌CaCl2 ;
[0093] E.将装有D中菌液的离心管放在散冰中静置30min ;
[0094] 进一步地，将其放在4°C、转速为6000rpm的离心机中高速离心5min，并缓慢去除 上清液；
[0095] 进一步地，向此离心管中继续加入800 μ 1在冰水混合物中预冷至0度的灭菌 CaCl2，在散冰上轻柔地摇匀，得到大肠埃希氏菌感受态细胞；
[0096] 由于大肠埃希氏菌感受态细胞受温度影响较大，故成功制备的感受态细胞需完全 置于散冰中低温保存，并于制备之日起5日内尽快使用；
[0097] 步骤三，将步骤一中经过预处理的α -变形细菌标样转化入步骤二中的大肠埃 希氏菌感受态细菌菌液中，为考察感受态效果，选用阳性质粒进行转化试验，具体操作如 下：
[0098] A.从步骤二中制得的800 μ 1大肠埃希氏菌感受态细菌菌液中分别取80 μ 1放入 2个1. 5ml的离心管中；
[0099] 进一步地，一个不加入任何其他试剂，作为阴性对照；
[0100] 进一步地，向另一个离心管中加入1μ 1拷贝数为ΚΓ9的阳性质粒，作为阳性对 昭. >、、、?
[0101] 进一步地，将2个离心管都置于冰水混合物中，进行冰水浴30min ;
[0102] B.将A中冰水浴后的2个离心管分别放入42°C水浴中热激80?90s ;
[0103] 进一步地，迅速将热激后的2个离心管再次放置于冰水浴中冷却2min ;
[0104] C.向B中冰水浴后的2个离心管中分别加入用前在121°C高温下灭菌25min的 500 μ 1LB液体培养基，混匀后将2个离心管都置于37°C、转速控制在160rpm的恒温摇床中 进行培养，复苏lh;
[0105] 进一步地，将复苏后的2个离心管都放在室温下、转速为13000rpm的离心机中高 速离心lmin,并缓慢去除500 μ 1上清液；
[0106] 进一步地，将去除上清液的2个离心管充分混匀，混匀后将2个离心管内的菌液分 别涂布到含氨苄青霉素的2块LB固体平板上，此处的含氨苄青霉素的2块LB固体平板是 指向每lOOmlLB固体平板上加入200-250ml氨苄青霉素；
[0107] 进一步地，分别倒置2块LB固体平板，并且将其都放在37°C下培养12?16h ;
[0108] D.培养后，观察2块LB固体平板，若阴性平板无菌落，阳性平板菌落较多，则证明 大肠埃希氏菌感受态菌液制作效果良好，将步骤一中制得的α-变形细菌复苏活化后的新 鲜菌液与步骤二中制得的大肠埃希氏菌感受态菌液相连接，具体操作为：
[0109] 从步骤二中制得的大肠埃希氏菌感受态菌液中分别提取80 μ 1放入多个1. 5ml离 心管中，
[0110] 进一步地，一个不加入任何其他试剂，作为阴性对照，标记为空白样；
[0111] 进一步地，向其它离心管中分别加入?μ 1的α-变形细菌复苏活化后的新鲜菌 液，对应标记为α-变形细菌；
[0112] 进一步地，将所有离心管都置于冰水混合物中，冰水浴30min，并重复本步骤三中 的步骤B-C ;
[0113] 进一步地，培养后的多块LB固体平板为α -变形细菌转化入大肠杆菌后的新鲜变 形细菌菌落产物；
[0114] 步骤四，对步骤三中制得的α -变形细菌转化入大肠杆菌后的新鲜变形细菌菌落 产物的挑菌培养，具体操作如下：
[0115] 首先，在灭菌的40ml LB液体培养基中加入80 μ 1氨苄青霉素；
[0116] 进一步地，向1. 5ml灭菌离心管中，加入从步骤三中制得的α -变形细菌转化入大 肠杆菌的LB固体平板中挑出的单个菌，再加入lml上述含有氨苄的LB液体培养基；
[0117] 进一步地，将上述离心管置于37°C、转速为160rpm的恒温摇床中培养14?16h ;
[0118] 步骤五，采用质粒抽提试剂盒对步骤四中培养后的挑菌进行质粒提取，提取方法 按试剂盒说明所述进行；
[0119] 步骤六，采用超微量核酸蛋白测定仪对步骤五中α-变形细菌提取的质粒进行定 量双链DNA含量的测定；
[0120] 步骤七，进行待测生物膜的预处理，具体操作为：
[0121] 首先，从水处理工艺或管道内壁采集生物膜样品；
[0122] 进一步地，向采集的生物膜样品中加入适量的灭菌生理盐水，并进行超声预处 理；
[0123] 进一步地，采用提取DNA试剂盒进行DNA的提取；
[0124] 进一步地，DNA提取完毕后，采用0. 7%的琼脂糖凝胶电泳或通过PCR扩增再电泳 对提取的DNA进行定量测量；
[0125] 步骤八，对步骤五、七中的标准α-变形细菌、生物膜样品分别采用实时荧光定量 PCR检测，其中，实时荧光定量PCR体系包括：12. 5μ1 SYBR? Green Realtime PCR Master Mix, 0. 5 μ 1正向引物，0. 5 μ 1反向引物，10 μ 1灭菌去离子水ddH20, 1. 5 μ 1模板DNA,总体 系为25 μ 1，其中，模板DNA为从各个生物膜样品提取的DNA ;
[0126] 其中，α-变形细菌的正向引物为
[0127] 5,-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGCGCGGGGGCACGGGGGGCCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGAT ΤΤΑΤ-3'，反向引物为 5' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3' ；
[0128] 实时荧光定量PCR扩增反应的条件为：预变性条件为95°C保持3min ;变性扩增条 件为95°C保持15s，延伸条件为60°C保持60s，该过程共循环40次；最后在72?99°C下解 离；
[0129] A.标准α -变形细菌的检测；
[0130] 由于标准品为纯α-变形细菌，下面通过建立梯度的形式，在定量PCR后通过绘制 标准曲线，测得未知样品的α-变形细菌含量；
[0131] 根据步骤六中α-变形细菌的DNA含量的测定结果，将步骤五中α-变形细菌的 质粒原液分别稀释至?ο 9、?ο8、?ο7、?ο6、?ο5、1〇 4、103c〇py/ μ 1浓度，将稀释后的α -变形细菌 的质粒菌液作为标准品；
[0132] 根据管网、管壁生物膜微生物存在水平与组成的特点，该目的基因模板量一般集 中在 103copy/y 1 ?107copy/y 1 之间，故剔除 108、109 的数值，取 103copy/y 1 ?107copy/ μ 1的稀释浓度为已知浓度；
[0133] Β.对生物膜样品的检测；
[0134] 步骤九，对步骤八中测得的DNA含量进行结果分析；
[0135] 根据上述实时荧光定量PCR反应的结果，绘制得到不同浓度的α-变形细菌标准 品的溶解曲线，
[0136] 图1是本发明一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法的溶解曲线，检测结果得 到103copy/y 1?107copy/y 1 5种浓度溶液的溶解曲线，从图1中可以看出5种浓度的溶 解曲线基本重合在一起，具有单一峰、无杂峰的特点，表明无其他产物或引物二聚体的非特 异性荧光，定量准确；
[0137] 分别对步骤八中已知浓度为103copy/ μ 1?107copy/ μ 1的溶液测得的DNA含量 进行标准曲线的绘制和分析，图2是本发明一种生物膜α -变形细菌的定量检测方法的标 准曲线，即为l〇3copy/y 1?107copy/y 1 5种浓度溶液的标准曲线，得到标准曲线方程y =-ax+b ;其中，y表示循环阈Ct值，X是以10为底的对数，表示DNA含量，a、b表示系数； 以a接近于3. 33且初始b在38-40之间时，标准曲线最为理想。当相关系数R2>0. 99且扩 增效率在0. 9-1. 1之间时，认为扩增有效且结果可信；根据理想的标准曲线，以及生物膜样 品检测得到的Ct值，可以获得未知样品的DNA含量，即为α -变形细菌的定量值。
[0138] 每次荧光定量PCR试验均需进行标准曲线与未知样品的同步测定，每个样品宜取 2个平行样，每次试验需采用1组空白对照，进而考察反应体系是否被污染，通过与空白标 样进行比较，判断更为准确。
[0139] 所有试验材料均需高温灭菌处理后密封烘干使用，配置体系时需在无菌超净台中 进行操作，防止带入细菌，对实验的结果造成干扰；由于SYBR? Green Realtime PCR Master Mix试剂的热感性，所有操作均需在冰上进行，防止放热，降低细菌定量测量的准确性。
[0140] 本发明选择α-变形细菌为研究对象进行定量分析研究，建立了基于SYBR Green I的实时荧光定量PCR技术检测管网、管壁生物膜微生物结构组成的方法，通过步骤九可准 确检测出α -变形细菌的数量，从微观角度定量了解生物膜的组成与结构。因此，有效的 克服了传统纯化培养方法分析速度慢、制约因素多、低估生物多样性、准确性低、主观因素 强等问题，以更加科学地监测水处理工艺及管网生物膜中致病菌的信息，反映饮用水系统 中的潜在危害，从而为研究饮用水系统的微生物稳定性提供支撑，为给水管网的水质净化 提供更加科学的依据。
[0141] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。
【权利要求】
1. 一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，包括： 步骤一，对α -变形细菌的标样进行预处理，得到新鲜活化的标样菌液，具体操作如 下；将在低温下保存的α-变形细菌标样取出，将其溶解至室温，并且充分混匀； 进一步地，取混匀后的液态α-变形细菌标样加入灭菌的LB液体培养基中； 进一步地，将其置于恒温摇床中进行培养，培养后得到新鲜活化的标样菌液； 步骤二，大肠埃希氏菌感受态细胞的制备，具体操作如下： Α.选用大肠埃希氏菌菌株，并且从LB固体平板上挑取单菌落置于灭菌的LB液体培养 基中； 进一步地，将其置于恒温摇床中进行培养，培养后得到新鲜大肠杆菌菌液； Β.将所述Α中新鲜培养的大肠杆菌菌液充分混匀，取此大肠杆菌菌液放入灭菌的LB液 体培养基中； 进一步地，将其置于适当温度下进行培养； C. 取所述B中培养后得到的大肠杆菌菌液； 进一步地，将其放在离心机中预冷，使其降温； 进一步地，将其放在离心机中进行高速离心，并缓慢去除上清液； D. 向所述C中已经去除上清液的大肠杆菌菌液中加入预冷的灭菌CaCl2，充分混匀；混 匀后，继续加入预冷的灭菌CaCl 2 ; E. 将装有所述D中菌液的离心管放在散冰中静置； 进一步地，将静置后的离心管放在离心机中高速离心，并缓慢去除上清液； 进一步地，向此离心管中继续加入预冷的灭菌CaCl2，在散冰上轻柔地摇匀，得到大肠 埃希氏菌感受态细胞； 步骤三，将所述步骤一中经过预处理的α -变形细菌标样转化入所述步骤二中的大 肠埃希氏菌感受态细菌菌液中，为考察感受态效果，选用阳性质粒进行转化试验，具体操作 如下： Α.分别从所述步骤二中制得的大肠埃希氏菌感受态细菌菌液中提取等量的液体放入 2个离心管中； 进一步地，一个不加入任何其他试剂，作为阴性对照； 进一步地，向另一个离心管中加入阳性质粒，作为阳性对照； 进一步地，将2个离心管都置于冰水混合物中，进行冰水浴； Β.将Α中冰水浴后的2个离心管分别放入水浴中进行热激； 进一步地，迅速将热激后的2个离心管再次放置于冰水浴中冷却； C. 向B中冰水浴后的2个离心管中分别加入灭菌的LB液体培养基，混匀后将2个离心 管都置于恒温摇床中进行培养、复苏； 进一步地，将复苏后的2个离心管都放在离心机中高速离心，并缓慢去除上清液； 进一步地，将去除上清液的2个离心管充分混匀，混匀后将2个离心管内的菌液分别涂 布到含氨苄青霉素的2块LB固体平板上； 进一步地，分别倒置2块LB固体平板，并且将其都放在适当温度下进行培养； D. 培养后，观察2块LB固体平板，若阴性平板无菌落，阳性平板菌落较多，则证明大肠 埃希氏菌感受态菌液制作效果良好，将所述步骤一中制得的α -变形细菌复苏活化后的新 鲜菌液与所述步骤二中制得的大肠埃希氏菌感受态菌液相连接，具体操作为： 首先，分别从所述步骤二中制得的大肠埃希氏菌感受态菌液中提取等量的液体放入多 个离心管中； 进一步地，一个不加入任何其他试剂，作为阴性对照，标记为空白样； 进一步地，向其它离心管中分别加入α -变形细菌复苏活化后的新鲜菌液，对应标记 为α-变形细菌； 进一步地，将所有离心管都置于冰水混合物中进行冰水浴，并重复所述步骤三中的步 骤 B-C ; 进一步地，培养后的多块LB固体平板为α -变形细菌转化入大肠杆菌后的新鲜变形细 菌菌落产物； 步骤四，对所述步骤三中制得的α-变形细菌转化入大肠杆菌后的新鲜变形细菌菌落 产物的挑菌培养，具体操作如下： 首先，在灭菌的LB液体培养基中加入氨苄青霉素； 进一步地，向灭菌后的离心管中，加入从所述步骤三中制得的α -变形细菌转化入大 肠杆菌的LB固体平板中挑出的单个菌，再加入上述含有氨苄的LB液体培养基； 进一步地，将上述离心管置于恒温摇床中进行培养； 步骤五，采用质粒抽提试剂盒对所述步骤四中培养后的挑菌进行质粒提取，提取方法 按试剂盒说明所述进行； 步骤六，采用超微量核酸蛋白测定仪对所述步骤五中α-变形细菌提取的质粒进行定 量双链DNA含量的测定； 步骤七，进行待测生物膜的预处理，具体操作为： 首先，从水处理工艺或管道内壁采集生物膜样品； 进一步地，向采集的生物膜样品中加入适量的灭菌生理盐水，并进行超声预处理； 进一步地，采用提取DNA试剂盒进行DNA的提取； 进一步地，DNA提取完毕后，采用琼脂糖凝胶电泳或通过PCR扩增再电泳对提取的DNA 进行定量测量； 步骤八，对所述步骤五、七中的标准α -变形细菌、生物膜样品分别采用实时荧光定量 PCR检测，具体操作为： Α.标准α-变形细菌的检测； 根据所述步骤六中变形细菌的DNA含量的测定结果，将所述步骤五中α-变形细 菌的质粒原液做5?10倍的连续梯度稀释，将稀释后的α -变形细菌的质粒菌液作为标准 品；进一步地，根据所述实时荧光定量PCR反应体系、条件绘制不同浓度的的α-变形细菌 标准品的标准曲线，来测定样品中目的基因模板量； Β.对生物膜样品的检测； 步骤九，对所述步骤八中测得的DNA含量进行结果分析； 对步骤八中测得的DNA含量进行扩增曲线、熔解曲线和标准曲线的分析，当回归系数 R2>0. 99且扩增效率在0. 9-1. 1之间时，认为扩增有效且结果可信； 根据步骤六中测得的DNA含量及其扩增结果的分析，得到标准曲线方程y = -ax+b，得 至IJ DNA浓度X值；其中，y为循环阈Ct值，X为以10为底的对数，表示DNA浓度，a为荧光 值，b为初始模板量；以a接近于3. 33且初始b在38-40之间时为最佳。
2. 根据权利要求1所述的一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，所述 步骤一至四中的LB液体培养基的灭菌条件为：121°C高温下灭菌25min。
3. 根据权利要求1所述的一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，所述 步骤二中预冷的灭菌CaCl2为CaCl 2在冰水混合物中预冷至0度。
4. 根据权利要求1所述的一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，所述 步骤三中的含氨苄青霉素的2块LB固体平板为向每100ml固体培养基加入200-250ml氨 节。
5. 根据权利要求1所述的一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，所述 步骤四中向灭菌的LB液体培养基中加入氨苄的具体操作为：向每40ml灭菌的LB液体培养 基加入80 μ 1氨苄。
6. 根据权利要求1所述的一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，所述 由于大肠埃希氏菌感受态细胞受温度影响较大，故成功制备的感受态细胞需完全置于散冰 中低温保存，并于制备之日起5日内尽快使用。
7. 根据权利要求1所述的一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，所述 步骤八中的实时突光定量PCR的体系包括：SYBR? Green Realtime PCR Master Mix，正向 引物，反向引物，灭菌去离子水ddH20，模板DNA。
8. 根据权利要求1所述的一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，所述 步骤八中α-变形细菌的正向引物采用 5,-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGCGCGGGGGCACGGGGGGCCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGATTTA Τ-3 '，反向引物采用 5' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 '。
9. 根据权利要求1所述的一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，所述 步骤八中实时荧光定量PCR扩增反应的条件为：预变性条件为95°C保持3min ;变性扩增条 件为95°C保持15s，延伸条件为60°C保持60s，该过程共循环40次；最后在72?99°C下解 离。
10. 根据权利要求1所述的一种生物膜α-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，所 述步骤一至九中使用的所有试验材料均需高温灭菌处理后密封烘干使用；配置权利要求7 中的实时荧光定量PCR体系时在无菌超净台中进行操作，由于SYBR? Green Realtime PCR Master Mix试剂的热感性，所有操作均在冰上进行。
【文档编号】C12Q1/06GK104152569SQ201410411810
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月20日 优先权日:2014年8月20日
【发明者】戴婕, 王雪峰, 张丽丽, 李伟英, 张东, 王铮 申请人:上海浦东威立雅自来水有限公司, 上海城市水资源开发利用国家工程中心有限公司