专利名称：用于检测厌氧反硝化细菌的引物和荧光探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测细菌的引物和探针，具体涉及用于检测厌氧反硝化细菌的引物和荧光探针。
背景技术：
厌氧反硝化细菌(anaerobic denitrifying bacteria，ADNB)是一类进行厌氧反硝化反应的细菌总称，其通过诱导产生硝酸还原酶和亚硝酸还原酶对硝酸盐和亚硝酸盐进行还原。在生物脱氮除磷、脱氮除硫的废水生物处理环节以及各种与厌氧反硝化细菌有关的工艺研究中，厌氧反硝化细菌的数量是反应生物量及其活性的一项重要指标。
现有的厌氧反硝化细菌的检测方法有绝迹稀释法(most probable number，MPN)-Griess、杜氏小管法等，它们均采用常规的培养方法，其操作繁琐、费用高、周期长达25～29天，而且厌氧条件不易控制，记数结果往往不够准确。在污水处理和油田生产等领域中，工作人员需要获得即时有效的数据，但由于缺少对厌氧反硝化细菌的特意性检测方法，使得人们不能对厌氧反硝化细菌进行准确及时的监测，而现有检测方法的检测结果无实际意义。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前还没有用于检测厌氧反硝化细菌的特意性引物和特意性探针，以及现有缺少特意性检测的方法存在记数准确率低、方法操作繁琐、费用高、周期长的问题，提供一种用于检测厌氧反硝化细菌的引物和荧光探针。本发明设计了一对保守的特意性引物和一个特意性荧光探针，其上游引物(FP)的基因序列为5’-ATGCGTAGCCGACCTGAGA-3’；下游引物(RP)的基因序列为5’-CGTCAGACTTTCGTCCATTGC-3’；荧光探针的基因序列为5’-CGGGAGGCAGCAGT-3’，荧光探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA-MGB。本发明为厌氧反硝化细菌的检测提供了一种特意性引物和特意性探针，能够提高检测的记数准确率、简化操作、降低费用，从模板DNA的提取到荧光RT-PCR检测，整个操作过程仅需6个小时，有效的缩短了检测周期，在生产中具有实际意义。
图1为具体实施方式
三中以pGEM-T-ADNB为底物的扩增曲线，其中①为1.302×108、②为1.302×107、③为1.302×106、④为1.302×105、⑤1.302×104、⑥为1.302×103、⑦为水对照；图2为具体实施方式
三中厌氧反硝化细菌荧光RT-PCR标准曲线图。
具体的实施方式具体实施方式
一针对厌氧反硝化细菌的16S rDNA基因序列片段，设计一对保守的特意性引物和一个特意性荧光探针，引物和荧光探针的基因序列如下上游引物(FP)5’-ATGCGTAGCCGACCTGAGA-3’下游引物(RP)5’-CGTCAGACTTTCGTCCATTGC-3’荧光探针5’-CGGGAGGCAGCAGT-3’荧光探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA-MGB。
引物和荧光探针的合成由生物工程公司完成。
具体实施例方式
二本实施方式用于制备厌氧反硝化细菌的DNA标准模板(一)将1ml污水注入离心管中后，在超声仪中震荡5min，然后在3000rpm/min离心机中离心2min，取上清液；向上清液中加入2倍体积的10×PBS进行洗涤，在超声仪中震荡5min，然后在12000rpm/min的离心机中离心5min，去掉上清液；向离心管中加入100μl的10×PBS缓冲液，在超声仪中震荡5min；用DNA小量细菌提取试剂盒(购自上海华舜生物工程有限公司)提取DNA；(二)对上一步提取出的DNA进行PCR扩增建立PCR反应体系(20μl)模板(DNA)20ng，Taq DNA聚合酶(购自大连宝生物工程有限公司)0.3U，4种dNTP各0.3mmol/L，上游引物和下游引物各0.1μmol/L；PCR反应条件94℃预热5min，94℃变性30s，58℃复性45s，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min。将PCR产物用1.0％的琼脂糖电泳进行检测。
(三)连接、转化、DNA检测将PCR产物用胶回收试剂盒(购自宝泰克生物科技公司)切胶回收后，与pGEM-T(Promega)载体连接，再转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞(购自北京天为时代科技有限公司)中；将转化后的细胞涂布于含有氨苄青霉素Amp(5μg/mL)和X-gal的LB固体培养基平板上，进行蓝白斑筛选。随机挑取白斑，用DNA小量细菌提取试剂盒(上海华舜生物有限公司)提取质粒，将该质粒命名为pGEM-T-ADNB。再用pGEM-T载体引物T7和SP6扩增，并测序，测序工作由生物工程公司完成，质粒中插入目标序列为110bp，如SEQ ID NO4所示。
具体实施方式
三本实施方式用于检测厌氧反硝化细菌的荧光定量检测灵敏度和绘制标准曲线图(一)测定pGEM-T-ADNB原液浓度并换算为拷贝数，换算结果为pGEM-T-ADNB原液中的拷贝数含量为1.302×108copies/μl。换算公式拷贝数(copies/μl)＝[C(μg/ul)×10-6×6.02×1023]/[660×(载体+目的片段)bp](二)绘制标准曲线将pGEM-T-ADNB原液按拷贝数进行10倍梯度稀释，稀释倍数分别为0、101、102、103、104和105，对各浓度稀释液进行荧光RT-PCR测定，同时设水为阴性对照。
荧光RT-PCR反应体系(25μL)5×real time buffer 5.0μl，dNTP(10mmol/L)0.75μl，Mg2+(250mmol/L)0.5μl，上游引物(FP)和下游引物(RP)(10mmol/L)各0.5μl，荧光探针(5mmol/L)0.6μl，Taq DNA酶(5U/μl)0.3μl，pGEM-T-ADNB2μl，去离子水15.4μl；荧光RT-PCR反应参数95℃预变性5min，94℃变性5s，60℃退火温度30s，72℃延伸45s，40个循环，72℃延伸2min。温度转换率为20℃/s。
图1中，曲线①～⑥分别是拷贝数为1.302×108、1.302×107、1.302×106、1.302×105、1.302×104、1.302×103copies/μl的pGEM-T-ADNB稀释液的荧光RT-PCR扩增曲线，曲线⑦是水对照。在荧光RT-PCR的40个循环结束后，计算机利用分析软件Opticon Monitor2.02根据输入的模板量和产生的荧光信号，计算出一条标准曲线(图2)y＝-0.29x+11.92，相关系数为0.997。检测结果表明，在1.302×100～1.302×108拷贝范围之内，样本的拷贝数与其相应的Ct值具有良好的相关性。因此，本实验可对1.302×100～1.302×108拷贝范围之内的模板进行准确定量。
具体实施方式
四本实施方式为待测样本的厌氧反硝化细菌的定量检测方法(一)将1ml待测样注入离心管中后，在超声仪中震荡5min，然后在3000rpm/min离心机中离心2min，取上清液；向上清液中加入2倍体积的10×PBS进行洗涤，在超声仪中震荡5min，然后在12000rpm/min的离心机中离心5min，去掉上清液；向离心管中加入100μl的10×PBS缓冲液，在超声仪中震荡5min；用DNA小量细菌提取试剂盒(购自上海华舜生物工程有限公司)提取DNA得到待测样的DNA；(二)对待测样的DNA进行荧光RT-PCR测定荧光RT-PCR反应体系(25μl)5×real time buffer 5.0μl，dNTP(10mmol/L)0.75μl，Mg2+(250mmol/L)0.5μl，上游引物(FP)和下游引物(RP)(10mmol/L)各0.5μL，荧光探针(5mmol/L)0.6μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，待测样的DNA 2μl，去离子水15.4μl；荧光RT-PCR反应参数95℃预变性5min，94℃变性5s，60℃退火温度30s，72℃延伸45s，40个循环，72℃延伸2min。温度转换率为20℃/s，在每个循环的60℃时进行荧光信号检测。
(三)检测结果的判定阳性对照中，Ct值小于28，扩增曲线明显；阴性对照中，Ct值大于35，无扩增曲线。
本实施方式对所收集的15个待测样本进行了荧光RT-PCR检测提取大肠杆菌转化子质粒pGEM-T-ADNB，分别以稀释后的质粒溶液为模板，以FP、RP为引物，和被检测样本同时进行荧光RT-PCR检测。各样本的初始拷贝数由分析软件Opticon Monitor 2.02根据标准曲线和样本的Ct值自动计算得出(表1)。检测的15个样本的结果见表1，本实施方式设置了水对照和纯菌(大肠杆菌)对照，同时用绝迹稀释法进行验证。检测结果为14个待测样本中均检测到厌氧反硝化细菌，检测结果与绝迹稀释法的检测结果完全吻合，本实施方式的检测结果精度比绝迹稀释法高两个数量级。
表1
序列表<110>哈尔滨工业大学<120>用于检测厌氧反硝化细菌的引物和荧光探针<160>4<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测厌氧反硝化细菌的上游引物。
<400>1atgcgtagcc gacctgaga 19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测厌氧反硝化细菌的下游引物。
<400>2cgtcagactt tcgtccattgc20
<210>3<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测厌氧反硝化细菌的荧光探针基因序列。
<400>3cgggaggcag cagt 14<210>4<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>阳性质粒中插入的基因序列。
<400>4atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactgggg ctgagacacg gcccagactc 60ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 110
权利要求
1.用于检测厌氧反硝化细菌的引物，其特征在于上游引物的基因序列为5’-ATGCGTAGCCGACCTGAGA-3’；下游引物的基因序列为5’-CGTCAGACTTTCGTCCATTGC-3’。
2.用于检测厌氧反硝化细菌的荧光探针，其特征在于荧光探针的基因序列为5’-CGGGAGGCAGCAGT-3’，荧光探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA-MGB。
全文摘要
用于检测厌氧反硝化细菌的引物和荧光探针，它涉及一种用于检测细菌的引物和探针。本发明解决了目前没有用于检测厌氧反硝化细菌的特意性引物和特意性探针，以及现有缺少特意性检测的方法存在记数准确率低、方法操作繁琐、费用高、周期长的问题。本发明的上游引物的基因序列为5′－ATGCGTAGCCGACCTGAGA－3′；下游引物的基因序列为5′－CGTCAGACTTTCGTCCATTGC－3′；荧光探针的基因序列为5′－CGGGAGGCAGCAGT－3′，荧光探针的5′端标记报告荧光基团FAM，3′端标记淬灭荧光基团TAMRA－MGB。本发明为厌氧反硝化细菌的检测提供了一种特意性引物和特意性探针，能够提高检测的记数准确率、简化操作、降低费用、缩短了检测周期，在生产中具有实际意义。
文档编号G01N33/52GK101086023SQ20071007233
公开日2007年12月12日 申请日期2007年6月8日 优先权日2007年6月8日
发明者马放, 魏利, 姚杰 申请人:哈尔滨工业大学