专利名称：一种细菌纳米磁小体纯度的检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种细菌纳米磁小体纯度的检测方法。
背景技术：
趋磁细菌广泛分布于海洋、淡水湖泊、池塘的沉积物中，于1975年被美国科学家Blakemore发现。这类细菌能大量吸收外界铁并在细胞内合成磁小体(Bacterial Magnetic Particles，BMPs)，因此能沿着磁场方向移动，具有趋磁性。磁小体的主要组成是Fe3O4晶体，外面以脂膜包被，直径在25～45nm之间，这一特性使它不易聚集成团，是一种理想的生物纳米材料。磁小体已被人们作为连接抗体应用于高灵敏度的免疫检测、酶载体、制备磁性细胞、基因转移、污水处理和金属回收等方面，还有望在靶向治疗肿瘤上成为关键的载体。
在磁小体的应用研究中，磁小体的纯度及磁小体膜的完整性是必须解决的关键问题。磁小体膜由磷脂双分子层组成，膜中嵌合各种蛋白，类似细胞质膜，膜中高含量的磷脂酰乙醇胺使磁小体表面呈电负性，不易聚集。研究表明，在磁小体膜中有多种其它生物膜中不存在的特异性蛋白。磁小体膜上游离的氨基或羧基，可以直接与药物或抗体偶联，还可采用一些双功能的小分子试剂将磁小体与药物或抗体连接，所以磁小体膜的完整与否是影响连接效率的关键。
因此，在保证磁小体膜完整性的前提下，建立起简便高效的磁小体纯度检测方法是目前急需解决的技术难题。
发明内容
为克服现有磁小体纯度检测方法的缺陷，本发明人经过多年研究，提供了下述行之有效的解决方案。
本发明的目的在于提供一种细菌纳米磁小体纯度的检测方法。
本发明所述的细菌纳米磁小体纯度的检测方法，其包括下述步骤(1)建立磁小体标准品谱图采用γ射线照射对磁小体的标准品进行灭菌处理，然后将磁小体悬浮于无菌的纯水中，取样滴加于硒化锌窗片，吹干后进行红外谱区扫描，得到标准品谱图；(2)对待测的磁小体样品采用与上述步骤(1)相同的方式进行灭菌、悬浮、滴样、吹干处理，然后进行红外谱区扫描，得到待测样品谱图；(3)比较待测样品谱图和标准品谱图，由特征吸收峰的峰位是否一致来判断待测样品的纯度。
本发明提供的是对分离纯化后的纯净磁小体的纯度检测方法，检测前需对磁小体进行灭菌处理。采用常规的化学药物灭菌会改变磁小体膜和膜上蛋白的性质，而采用常规的物理方法灭菌产生的高压高温也会破坏磁小体膜的组分与结构，均不适用于磁小体的灭菌处理。本发明所述的方法的灭菌处理是采用γ射线照射磁小体，照射剂量为15kGy，γ射线照射既可有效灭菌，又不至于破坏磁小体膜的组分与结构。
本发明所述的方法，其中步骤(1)和步骤(2)所述的红外扫描的谱区范围为400～4000cm-1。
本发明所述的方法，其中磁小体标准品谱图中的特征吸收峰出现在3273cm-1，2921cm-1，1735cm-1，1645cm-1和1531cm-1。具体地，3273cm-1和2921cm-1表示有NH结合和CH的伸缩振动，而1735cm-1，1645cm-1和1531cm-1表示C＝O和C＝C的伸缩振动。
本发明所述的方法，其中步骤(3)中的纯度判定方法具体为比较得到的样品谱图和标准谱图，如两者的特征吸收峰一致，表明样品达到了纯化标准；如出现其他吸收峰，表明样品不纯。
采用红外光谱仪对样品进行检测时，确定检测条件如扫描波长、扫描次数等，检测结束会自动生成谱图。该方法一般用于定性分析，如果样品量有变化，只是吸收峰的高低有不同，而峰位不应变化，否则表明样品有结构上的变化。因此，采用红外光谱扫描来检测纯度，是对被检测物组成上的鉴定。
本发明所述的磁小体纯度检测方法，操作简单，结果判断直观，结论可靠性高，并有效保证了磁小体膜的完整性，为磁小体的广泛应用提供了可靠的检测技术手段。
图1磁小体标准品谱图，图中，箭头所示之处为特征峰；图2磁小体标准品的能谱检测结果图；图3磁小体标准品的电镜照片，图中，箭头所示之处为磁小体脂膜，左图标尺为50nm，右图标尺为10nm；图4磁小体标准品对小鼠成纤维细胞毒性的检测结果图；图5待测磁小体样品的红外光谱图，图中，箭头所示之处为特征吸收峰。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1采用本发明所述的方法检测细菌纳米磁小体纯度(1)建立磁小体纯度检测的标准品谱图采用Magnetospirillumgryphiswaldense(MSR-1)(购自德国Deut Sche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkkulturen，编号为DSM6361)菌株作为原材料，用法式细胞压榨机(French Press)破碎细胞，压强为1000Psi。然后用磁铁吸附回收磁小体，再用PBS(pH7.0)缓冲液洗涤磁小体10次，配合以轻微超声波击打。接着，使用冷冻干燥机(LABCONCO，Free Zone)干燥洗涤后的磁小体。然后采用γ射线照射磁小体，照射剂量为15kGy。灭菌结束后，将磁小体悬浮于无菌的纯水中，取20μl磁小体悬浮液滴加于硒化锌窗片，吹干后置于付立叶变换红外光谱仪(Bruker，Vector33)中扫描，扫描谱区为400-4000cm-1，获得磁小体标准品谱图，如附图1所示，其中，特征吸收峰出现在3273 cm-1，2921cm-1，1735cm-1，1645cm-1和1531cm-1。
(2)建立待测样品谱图取样品磁小体，采用与上述步骤(1)相同的方式进行灭菌、悬浮、滴样、吹干处理，然后进行红外谱区扫描，得到待测样品谱图，如附图5所示。
(3)比较待测样品谱图和标准品谱图，得出磁小体纯度检测结论将获得的待测样品谱图(附图5)与标准品谱图(附图1)进行比对，发现特征峰的峰位一致，峰型吻合，检测结论为样品磁小体的纯度达到了标准品的标准。需要说明的是，附图5中2300cm-1处出现的吸收峰是CO2干扰所形成的，由于空气中含有大量CO2，特别是人呼出的气体中CO2的浓度更高，因此出现CO2干扰峰是不可避免的，与磁小体的纯度检测无关，不影响检测结果。
实施例2采用本发明所述的方法制得的磁小体的性质检测实验我们对实施例1所得到的磁小体标准品的性质做了进一步的检测分析(1) 能谱分析取实施例1中制得的磁小体悬浮液20μl滴加于碳网上，干燥后置于能谱仪(Philips Tecnai F30)上检测，可分别选取1、10和25个纯净磁小体检测，磁小体中各种元素的含量是稳定不变的，除Fe、O、C、N、P元素外，还应有Cu、Si、Na、K元素(为背景元素)。能谱分析结果如附图2所示，没有其它杂质元素的存在；(2)污染菌分析取实施例1中制得的磁小体悬浮液涂布于血清培养基平板上，在37℃培养一周，未发现任何污染菌落长出；(3)电镜观察磁小体外膜完整性取实施例1中制得的磁小体悬浮液滴加于铜网上，样品干燥后不需染色，直接置于电镜下观察(放大20000倍)，观察结果如附图3所示，可以清楚地观察到磁小体脂膜是完整的；(4)细胞毒性检测取实施例1中制得的磁小体悬浮液，分别以0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L和1.3mg/L浓度的磁小体与小鼠成纤维细胞[mouse fibroblasts(L-929)]进行共培养，经72小时后，与对照品进行比对(磁小体浓度为0mg/L)，检测结果如附图4所示，未发现磁小体对细胞的毒性反应。
上述实验结果表明，采用本发明所述的方法制得的磁小体纯度高、外膜完整，进而从侧面证明了采用本发明所述的方法得到的纯度检测结果可靠性高。
权利要求
1.一种细菌纳米磁小体纯度的检测方法，其包括步骤(1)建立磁小体标准品谱图采用γ射线照射对磁小体的标准品进行灭菌处理，然后将磁小体悬浮于无菌的纯水中，取样滴加于硒化锌窗片，吹干后进行红外谱区扫描，得到标准品谱图；(2)建立待测样品谱图对待测的磁小体样品采用与上述步骤(1)相同的方式进行灭菌、悬浮、滴样、吹干处理，然后进行红外谱区扫描，得到待测样品谱图；(3)比较待测样品谱图和标准品谱图，由特征吸收峰的峰位是否一致来判断待测样品的纯度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的γ射线照射剂量为15kGy。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)和步骤(2)所述的红外扫描的谱区范围为400～4000cm-1。
4.根据权利要求1-3之任一项所述的方法，其特征在于磁小体标准品谱图中的特征吸收峰出现在3273cm-1，2921cm-1，1735cm-1，1645cm-1和1531cm-1。
全文摘要
本发明提供了一种细菌纳米磁小体纯度的检测方法，该方法包括建立磁小体的标准品谱图，建立待测磁小体样品谱图，通过比较待测样品谱图和标准品谱图得出检测结论等步骤。本发明所述的方法操作简单，结果判断直观，结论可靠性高，并有效保证了磁小体膜的完整性。
文档编号G01N21/31GK1971250SQ20061016483
公开日2007年5月30日 申请日期2006年12月6日 优先权日2006年12月6日
发明者李颖, 李想, 姜伟, 田杰生, 王珍芳 申请人:中国农业大学