专利名称：细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒，具体涉及细菌的特异性寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具、使用该细菌检测器具的极其准确且操作性高的细菌检测方法及细菌检测试剂盒。
背景技术：
例如麦芽酒精饮料中混入有害微生物时，会产生浑浊、风味劣化等现象，从而成为质量劣化的原因。更加具体地说，如对于啤酒来说，乳酸杆菌属(LactcAacilIus)、片球菌属(Pediococcus)、梳状菌属(Pectinatus)等是代表性的有害细菌。其中，短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)、酸面团乳杆菌(Lactobacillus lindneri)是有名的啤酒污染菌。作为检测这些有害细菌的方法，现在最普通的方法是，用膜过滤器将对象啤酒过滤后， 在适当的培养基中培养，然后检测生长的菌落。作为判断该菌落是否为上述有害细菌的方法，使用的方法是将从菌落中提取的 DNA作为模板，使用上述有害细菌特异性引物进行PCR反应，通过电泳来判断是否能够得到 PCR产物(如参照日本国特开平7489295号公报(
公开日平成7年11月7日))。但是， 因为在该方法中每个菌种都需要使用多数引物进行多次PCR反应，操作极其烦杂，在快速性方面存在问题。此外，为了缩短时间，虽然可将多数引物混合并在1个试管内进行扩增反应，但可使用的引物数量有限，所以难于根据微量检体进行准确判断。为了解决上述问题点，使用了下述方法，即、设计含有各种菌种内普遍存在的基因的种特异性序列的部分可扩增的引物，扩增后用识别种特异性序列的限制酶切割扩增产物，以电泳得到的电泳带的大小来特定其为何种菌种的基因。但是，能够识别所有对象菌种的限制酶未必都存在，并且，需要用多种类限制酶分别切割得到的扩增产物提供给电泳这样极其烦杂的操作，在快速性、简便性方面存在问题。进而，为了解决上述问题，还实施了下述方法，S卩、用种特异性序列作探针，通过杂交来判断被检体中的DNA或RNA中是否存在与该序列互补的序列。但是，上述通过杂交进行判断的方法，对于非常近缘的DNA同源性高的菌种，也存在频繁发生与别的菌种进行错误杂交的交叉杂交问题，有时难于准确鉴定菌种。特别是，在上述代表性的啤酒污染菌即属于乳酸杆菌属的种中近缘菌非常多，使用频繁发生交叉杂交的方法，不能达到检测、鉴定有害细菌的目的。鉴于上述问题，本发明的目的是提供可以准确判断特定细菌是否存在的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具、使用该细菌检测器具通过简便操作能够进行快速准确判断的细菌检测方法及细菌检测试剂盒。
发明内容
本发明者为了解决上述课题进行了精心研究，其结果在麦芽酒精饮料的代表性污染细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中，发现了特定属或特定种特异性序列；并且发现使用根据该碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的器具，通过和来源于被检试料的核酸进行杂交，可快速且准确地检测、鉴定目的细菌，完成了本发明。本发明的细菌检测器具，是用于检测、鉴定被检试料中的细菌的器具，其特征在于，对象细菌是从(1)属于短乳杆菌(LactcAacillus brevis)的细菌、(2)属于酸面团乳杆菌(Lactobacillus lindneri)的细菌、(3)属于片球菌属(Pediococcus)的细菌、(4)属于巨球形菌属(Megasphaera)的细菌、(5)属于梳状菌属(Pectinatus)的细菌中选择的至少2种或2种以上的细菌，根据对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面，通过该寡核苷酸和来源于被检试料的核酸进行杂交，来检测、鉴定被检试料中的细菌。本发明的(1) (5)的细菌，例如短乳杆菌(LactcAacillus brevis)是序列号 7 9及序列号71所示的碱基序列全部包含在16S核糖体RNA基因中的细菌。酸面团乳杆菌(LactcAacillus lindneri)是序列号22 M所示的碱基序列全部包含在16S核糖体 RNA基因中的细菌。属于片球菌属(Pediococcus)的细菌是序列号36 45所示的碱基序列中至少2个碱基序列包含在16S核糖体RNA基因中的细菌。属于巨球形菌属(Megasphaera) 的细菌是序列号50 55所示的碱基序列中至少2个碱基序列包含在16S核糖体RNA基因中的细菌。属于梳状菌属(Pectinatus)的细菌是序列号56 58所示的碱基序列中至少 2个碱基序列包含在16S核糖体RNA基因中的细菌。作为本发明的细菌检测器具的检测对象细菌，优选包括(6)属于乳酸杆菌属 (Lactobacillus)的细菌、(7)属于链球菌属(Streptococcus)的细菌、(8)属于明串珠菌属(Leuconostoc)的细菌、(9)属于发酵单胞菌属(Zymomonas)的细菌、(10)属于棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)的细菌、(11)属于弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)的细菌、(12)属于德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)的细菌、属于发酵乳杆菌(LactcAacillusfermentum)的细菌、(14)属于坏发酵乳杆菌 (Lactobacillus malefermentans)的细菌、(15)属于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) Ii^ (Lactobacillus casei> Lactobacillus paracasein Lactobacillus zeae) ^tJ M "S、 (16)属于鼠李糖乳杆菌(LactcAacillus rhamnosus)的细菌、(17)属于布氏乳杆菌 (Lactobacillus buchneri)的细菌、(18)属于而 久肠球菌(Enterococcus durans)的细菌、(19)属于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的细菌。作为固定在基板表面的寡核苷酸，优选为下述所示的寡核苷酸，本发明的细菌检测器具的特征是，至少1个或1个以上的所述寡核苷酸固定在基板表面。(A)其是根据属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号1所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号2所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号3所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号4所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号5所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号6所示的碱基序列的寡核苷酸。(B)其是根据短乳杆菌(LactcAacillus brevis)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号7所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号8所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号9所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号71所示的碱基序列的寡核苷酸。(C)其是根据棒状乳杆菌(LactcAacillus coryniformis)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号10所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号11所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号12所示的碱基序列的寡核苷酸。(D)其是根据弯曲乳杆菌(LactcAacillus curvatus)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号13所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号14所示的碱基序列的寡核苷酸。(E)其是根据德氏乳杆菌(LactcAacillus delbrueckii)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号16所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号17所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号18所示的碱基序列的寡核苷酸。(F)其是根据发酵乳杆菌(LactcAacillus fermentum)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列的寡核苷酸，并且是含有序列号19所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号20所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号21所示的碱基序列的寡核苷酸。(G)其是根据酸面团乳杆菌(LactcAacillus lindneri)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号22所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号23所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号M所示的碱基序列的寡核苷酸。(H)其是根据坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)的 16S 核糖体 RNA 基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号25所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号26所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号27 所示的碱基序列的寡核苷酸。(I)其是根据干酷乳杆菌(Lactobacillus casei)群(Lactobacillus casei、 Lactobacillus paracasei>Lactobacillus zeae) W 16SRNA SESIjfX^WMSj^ ^lJΦ WzFMEff^ (Lactobacillus casei、Lactobacillus paracasei) W^^ftj^^Ji^if 的寡核苷酸，并且是含有序列号28所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号四所示的碱基序列的寡核苷酸；以及是根据玉米乳杆菌(LactcAacillus zeae、且含有干酪乳杆菌的标准株)特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号30所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号31所示的碱基序列的寡核苷酸。(J)其是根据鼠李糖乳杆菌(LactcAacillus rhamnosus)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号32所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号33所示的碱基序列的寡核苷酸。(K)其是根据布氏乳杆菌(LactcAacillus buchneri)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号34所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号35所示的碱基序列的寡核苷酸。
(L)其是根据属于片球菌属(Pediococcus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号36所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号37所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号38所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号39所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号40所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号41所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号42所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号43所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号44所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号45所示的碱基序列的寡核苷酸。(M)其是根据属于链球菌属(Sti^ptococcus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号46所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号47所示的碱基序列的寡核苷酸。(N)其是根据属于明串珠菌属(Leuconostoc)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号48所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号49所示的碱基序列的寡核苷酸。(0)其是根据属于巨球形菌属(Megasphaera)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号50所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号51所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号52所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号53所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号M所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号阳所示的碱基序列的寡核苷酸。(P)其是根据属于梳状菌属(Pectinatus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号56所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号57所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号58所示的碱基序列的寡核苷酸。(Q)其是根据属于发酵单胞菌属(Zymomonas)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号59所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号60所示的碱基序列的寡核苷酸。(R)其是根据属于耐久肠球菌(Enterococcus durans)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号61所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号62所示的碱基序列的寡核苷酸。(S)其是根据乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸，并且是含有序列号63所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号64所示的碱基序列的寡核苷酸。(T)其是含有属于部分明串珠菌属(Leuconostoc)的细菌及属于部分乳酸杆菌属 (Lactobacillus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列的共同的碱基序列中的序列号72所示的碱基序列的寡核苷酸。通过使用将上述(A) (T)所述的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，能够全部检测、鉴定食品中的污染菌、特别是麦芽酒精饮料中的污染菌。此外，本发明的细菌检测器具，优选上述基板表面具有碳化二亚胺基或异氰酸酯基，且该碳化二亚胺基或异氰酸酯基与所述寡核苷酸或寡核苷酸末端附加的连接子进行反应形成共价键。
本发明的细菌检测方法，是用于检测、鉴定被检试料中的细菌的方法，其特征在于，包括制备被检试料中的细菌的核酸的核酸制备步骤、以该核酸为模板制备标记探针的探针制备步骤、将所述探针与固定在上述本发明细菌检测器具的基板表面的寡核苷酸进行杂交的杂交步骤、检测杂交信号的信号检测步骤。作为本发明细菌检测方法的被检试料，优选食品，其中最优选麦芽酒精饮料。本发明的细菌检测试剂盒，是用于实施上述本发明细菌检测方法的试剂盒，包含上述本发明的细菌检测器具，并且优选包含杂交步骤、信号检测步骤、探针制备步骤、核酸制备步骤中使用的试剂。本发明的其他目的、特征及优点通过下述内容可以充分理解，并且本发明的利益通过下述参照附图的说明可以得以证明。
图1(a)是表示实施例中使用的本发明的细菌检测器具的基板上固定的寡核苷酸的排列位置图。图1 (b)是表示使用在图1 (a)所示的排列位置上固定寡核苷酸的细菌检测器具检测 Lactobacillus brevis 的结果图像。
具体实施例方式对本发明的一种实施方式进行如下说明，此外，本发明并不限于下述实施方式。(1)本发明的细菌检测器具本发明的细菌检测器具用于检测、鉴定被检试料中的细菌，根据对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面，通过该寡核苷酸和来源于被检试料的核酸进行杂交，来检测、鉴定被检试料中的细菌。[基板]本发明的细菌检测器具所使用的基板的材质，只要能够使寡核苷酸稳定地固定即可。例如可以为聚碳酸酯或塑料等合成树脂、玻璃等，但并不限于这些材质。基板的形态没有特别限定，但可优选使用如板状、薄膜状等基板。[固定在基板表面的寡核苷酸]固定在本发明的细菌检测器具的基板表面的寡核苷酸，只要是根据检测对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸即可。通过该寡核苷酸和来源于被检试料的核酸之间进行杂交，可检测出被检试料中含有的属于目的种或属的细菌。此外，对于根据上述检测对象细菌所属种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸，以下恰当地称之为“捕获性寡核苷酸(capture olig) ”。上述特异性碱基序列，只要从检测对象细菌的基因组碱基序列中选取属或种特异性碱基序列即可，优选从检测对象细菌的核糖体RNA基因所对应的碱基序列中选取。其中， 已知道细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中具有很多属或种特异性碱基序列， 特别优选从16S核糖体RNA基因所对应的DNA序列中选取属或种特异性碱基序列。核糖体 RNA基因的碱基序列，可以从GenBank、EMBL、DDBJ等的数据库等中得到。根据上述属或种特异性碱基序列来设计捕获性寡核苷酸即可。因此，其可以为上述属或种特异性碱基序列自身，只要能够与从检测对象细菌中制备的核酸进行特异性杂交，也可包含变异，变异的位置没有特别限定。捕获性寡核苷酸的长度(碱基数)没有特别限定，如果太短难于对杂交进行检测， 如果太长会发生非特异性杂交。本发明者对捕获性寡核苷酸的最适合长度进行反复研究， 确定标准长度为12 对个碱基。更优选13 22个碱基，但并不限于此。本发明者确认， 碱基长度主要取决于序列特性(特定的碱基含有率、同一碱基的重复)，结合性良好的序列即使链短，也可进行特异性杂交。当捕获性寡核苷酸具有妨碍其与来源于被检试料的核酸进行杂交的发夹结构、环状结构或除此之外的立体结构时，通过将构成捕获性寡核苷酸的1个或1个以上的核苷酸置换为与肌苷或任何核苷酸不联会的核酸，可以解除其立体结构。捕获性寡核苷酸的合成方法没有特别限定，根据公知的方法(如Maniatis，Τ. et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)所述方法)合成即可。一般可以用市售的DNA合成机进行化学合成。本发明的细菌检测器具，不仅将根据上述检测对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面，而且优选在此基础上将所谓的对照捕获性寡核苷酸也固定在基板表面。对照捕获性寡核苷酸包括阳性对照捕获性寡核苷酸及阴性对照捕获性寡核苷酸。阳性对照捕获性寡核苷酸用于判断下述探针制备步骤中的扩增反应是否顺利进行。阴性对照捕获性寡核苷酸用于确认未发生非特异性杂交，即未发生假阳性杂交。本发明也包含这些阳性对照捕获性寡核苷酸及阴性对照捕获性寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具。阳性对照捕获性寡核苷酸只要根据从检测对象细菌中制备的探针中所包含的序列进行设计即可。此外，使用同一细菌检测器具同时检测多数检测对象细菌时，可以对各检测对象细菌设计阳性对照捕获性寡核苷酸，或者也可以根据从多数检测对象细菌中制备的探针中的相同碱基序列进行设计。从所有检测对象细菌中制备的探针中没有相同碱基序列时，也可分为数组分别设计阳性对照捕获性寡核苷酸。或者也可以设计引物序列部分相同、 与对象细菌序列不同的人工序列，使该序列的一部分成为阳性对照捕获性寡核苷酸。以上述人工序列作模板制备探针(在本说明书中称这种探针为对照探针)，通过添加到从被检试料中制备的探针上，可以验证杂交的特异性。此外，在下面将对上述探针进行说明。阴性对照捕获性寡核苷酸，优选以下述方式设计，S卩、在阳性对照捕获性寡核苷酸的碱基序列中，在1个或1个以上的碱基且小于该序列具有的碱基数的未满20%的范围内具有包含人工置换碱基的碱基序列。进行碱基置换的碱基数，取决于与杂交条件之间的关系，可选择来源于检测对象细菌的探针不发生杂交的碱基数。检测对象细菌没有特别限定，可适当选择要从目的被检试料中检测的细菌。例如可以为混入食品中可能污染该食品的细菌。其中优选可能混入、污染麦芽酒精饮料的细菌为检测对象细菌。食品中混入有害细菌已成为公共卫生方面的非常大的问题。此外，对于啤酒、发泡酒等所代表的麦芽酒精饮料，有害细菌混入时成为浑浊、风味劣化等质量劣化的原因，因此，特别期望开发出快速且准确检测、鉴定这些有害细菌的方法。作为污染麦芽酒精饮料的细菌，可以为属于乳酸杆菌属(LactcAacillus)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、巨球形菌属(Megasphaera)以及梳状菌属(Pectinatus)的细菌。并且属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的菌种，可以为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、弯曲乳杆 M (Lactobacillus curvatus)、德氏季Llf (Lactobacillus delbrueckii)、 (Lactobacillus fermentum)、酸面团乳杆菌(Lactobacillus lindneri)、坏发酵乳杆菌 (Lactobacillus malefermentans) λzFSS^LIf ^ (Lactobacillus casein Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、玉米乳杆菌(含有 Lactobacillus zeae、Lactobacillus casei 的标准株)。 此外，作为污染食品的细菌，除上述之外还可以为属于明串珠菌属(Leuconostoc)及发酵单胞菌属(Zymomonas)的细菌，以及耐久肠球菌(Enterococcus durans)和乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)。但检测对象细菌并不限于上述细菌。用于检测、鉴定上述所示细菌的捕获性寡核苷酸，可以为根据属于下述菌属的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的各属的特异性序列设计的寡核苷酸，所述菌属为乳酸杆菌属(LactcAacillus)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属 (Streptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、巨球形菌属(Megasphaera)、梳状菌属 (Pectinatus)及发酵单胞菌属(Zymomonas)；以及可以为由下述菌种的16S核糖体RNA 基因所对应的碱基序列中的各细菌的种特异性序列设计的寡核苷酸，所述菌种为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、弯曲乳杆 lif (Lactobacillus curvatus)lif (Lactobacillus delbrueckii)lif (Lactobacillus fermentum)、酸面团乳杆菌(Lactobacillus lindneri)、坏发酵乳杆菌 (Lactobacillus malefermentans) >zFSS-^LIf 1 (Lactobacillus casei> Lactobacillus paracasei) > IE ^H If lif (Lactobacillus rhamnosus) > 1 If lif (Lactobacillus buchneri)、玉米乳杆菌(含有 Lactobacillus zeae>LactobaciIlus casei 的标准株)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)以及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。具体来说,可以为含有序列号1 64、71及72所示的任何碱基序列的寡核苷酸，但并不限于这些寡核苷酸。表1例举了通过根据乳酸杆菌属(Lactobacillus)特异性碱基序列设计的捕获性寡核苷酸(序列号1 6)、以及根据部分乳酸杆菌属(Lactobacillus)和部分明串珠菌属 (Leuconostoc)所对应的碱基序列设计的捕获性寡核苷酸(序列号72)，可以检测出的乳酸杆菌属的细菌。但通过具有序列号1 6及72所示的任何碱基序列的捕获性寡核苷酸可检测出的细菌，并不限于这些。[表 1]
权利要求
1.细菌检测器具，用于检测、鉴定被检试料中的细菌，其特征在于，对象细菌是从下述 ⑴ (5)中所述的细菌中选择的至少2种或2种以上的细菌，根据对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面，通过该寡核苷酸和来源于被检试料的核酸进行杂交，来检测、鉴定被检试料中的细菌，(1)属于短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)的细菌(2)属于酸面团乳杆菌(LactcAacilluslindneri)的细菌(3)属于片球菌属(Pediococcus)的细菌(4)属于巨球形菌属(Megasphaera)的细菌(5)属于梳状菌属(Pectinatus)的细菌。
2.如权利要求1所述的细菌检测器具，其特征在于，所述对象细菌还包括下述(6) (19)中所述的细菌，(6)属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的细菌(7)属于链球菌属(Streptococcus)的细菌(8)属于明串珠菌属(Leuconostoc)的细菌(9)属于发酵单胞菌属(Zymomonas)的细菌(10)属于棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)的细菌(11)属于弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)的细菌(12)属于德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)的细菌(13)属于发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)的细菌(14)属于坏发酵乳杆菌(Lactobacillusmalefermentans)的细菌(15)属于干酪乳杆菌(LactcAacilluscasei)群的细菌(16)属于鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)的细菌(17)属于布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)的细菌(18)属于耐久肠球菌(Enterococcusdurans)的细菌(19)属于乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的细菌。
3.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的细菌的163核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1 种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号1所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号2所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号3所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号4所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号5所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号 6所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
4.如权利要求1或2所述的细菌检测器具，其为根据短乳杆菌(LactcAacillus brevis)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号7所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号8所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号9所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号71所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
5.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据棒状乳杆菌(LactcAacilluscoryniformis)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号10所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号11所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号12所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
6.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据弯曲乳杆菌(LactcAacillus curvatus)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号13所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号14所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
7.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号16所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号17所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号18所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
8.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据发酵乳杆菌(LactcAacillus fermentum)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号19所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号20所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号21所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
9.如权利要求1或2所述的细菌检测器具，其为根据酸面团乳杆菌(LactcAacillus lindneri)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号22所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号23所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号M所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
10.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据坏发酵乳杆菌(LactcAacillus malefermentans)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号25所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号26所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号27所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
11.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据干酪乳杆菌(LactcAacilluscasei) 群的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1 种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号观所示的碱基序列的寡核苷酸、 含有序列号四所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号30所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号31所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
12.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据鼠李糖乳杆菌(LactcAacillus rhamnosus)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号32所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号33所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
13.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据布氏乳杆菌(LactcAacillus buchneri)的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号34所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号35所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
14.如权利要求1或2所述的细菌检测器具，其为根据属于片球菌属(Pediococcus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1 种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号36所示的碱基序列的寡核苷酸、 含有序列号37所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号38所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号39所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号40所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号41所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号42所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号43所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号44所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号45所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
15.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据属于链球菌属(Streptococcus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1 种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号46所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号47所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
16.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据属于明串珠菌属(Leuconostoc)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1 种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号48所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号49所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
17.如权利要求1或2所述的细菌检测器具，其为根据属于巨球形菌属(Megasphaera) 的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号50所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号51所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号52所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号53所示的碱基序列的寡核苷酸、含有序列号M所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号55所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
18.如权利要求1或2所述的细菌检测器具，其为根据属于梳状菌属(Pectinatus)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1 种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号56所示的碱基序列的寡核苷酸、 含有序列号57所示的碱基序列的寡核苷酸以及含有序列号58所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
19.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据属于发酵单胞菌属(Zymomonas)的细菌的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同属的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1 种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号59所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号60所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
20.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据耐久肠球菌(Enterococcusdurans) 的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号61所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号62所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
21.如权利要求2所述的细菌检测器具，其为根据乳酸乳球菌(Lactococcuslactis) 的16S核糖体RNA基因所对应的碱基序列中的同种的特异性序列设计的寡核苷酸固定在基板表面的细菌检测器具，其特征在于，该寡核苷酸是从所述寡核苷酸组中选择的至少1种或1种以上的寡核苷酸，所述寡核苷酸组由含有序列号63所示的碱基序列的寡核苷酸及含有序列号64所示的碱基序列的寡核苷酸组成。
22.如权利要求1 21中任一项所述的细菌检测器具，其特征在于，所述基板表面具有碳化二亚胺基或异氰酸酯基，并且该碳化二亚胺基或异氰酸酯基与所述寡核苷酸或寡核苷酸末端附加的连接子进行反应形成共价键。
23.细菌检测器具，用于检测、鉴定被检试料中的细菌，其特征在于，含有属于明串珠菌属(Leuconostoc)的细菌及/或属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)的细菌的16S核糖体 RNA基因所对应的序列中的序列号72所示的碱基序列的寡核苷酸固定在基板表面，通过该寡核苷酸和来源于被检试料的核酸进行杂交，来检测、鉴定被检试料中的细菌。
24.细菌检测方法，其为检测、鉴定被检试料中的细菌的方法，其特征在于，包括制备被检试料中细菌的核酸的核酸制备步骤、以该核酸为模板制备标记探针的探针制备步骤、使所述探针和权利要求1 23中任一项所述的在细菌检测器具的基板表面固定的寡核苷酸进行杂交的杂交步骤、检测杂交信号的信号检测步骤。
25.如权利要求M所述的细菌检测方法，其特征在于，所述被检试料是食品。
26.如权利要求25所述的细菌检测方法，其特征在于，所述食品是麦芽酒精饮料。
27.细菌检测试剂盒，其用于实施权利要求M 沈中任一项所述的细菌检测方法。
28.细菌检测试剂盒，其为用于实施权利要求M 沈中任一项所述的细菌检测方法的试剂盒，其特征在于，包含所述杂交步骤及/或信号检测步骤使用的试剂。
29.如权利要求观所述的细菌检测试剂盒，其还包含所述探针制备步骤及/或所述核酸制备步骤使用的试剂。
全文摘要
本发明提供用简便操作可快速准确地判断混入被检试料中的细菌的细菌检测器具、细菌检测方法及细菌检测试剂盒。本发明的细菌检测器具是微阵列型器具，其中根据对象细菌所属的种或属特异性碱基序列设计的寡核苷酸固定在基板表面。根据从被检试料中制备的探针和固定在上述基板表面的寡核苷酸是否发生杂交，可简便、快速且准确地检测、鉴定被检试料中的细菌。
文档编号C12R1/46GK102337209SQ20111029078
公开日2012年2月1日 申请日期2005年2月25日 优先权日2004年2月25日
发明者中川浩子, 儿玉由纪子, 守屋彰悟, 小佐野薰, 田中幸一, 畑中一成 申请人:三得利控股株式会社