专利名称：一种检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及奇异变形杆菌的检测，具体的说是一种检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列及其应用。
背景技术：
奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)属于变形杆菌属(Proteus)，广泛存在于泥土、水和粪便等受到污染的环境。奇异变形杆菌是环境中的一种条件致病菌，是一种常见的能够感染人类并引起人体病变的病原菌。近年来，临床上由奇异变形杆菌引起的食物中毒发生率显著提高，严重威胁到人们的健康。但是，有关奇异变形杆菌的检测方法还比较落后，国内外专门开展该菌检测方法研究的报道也较少。目前对奇异变形杆菌的检测多采用传统方法，主要以实验室分离和生理生化鉴定为主，此类方法繁琐费时，一般需要4到5天，检测周期比较长，且主观性强，容易造成漏检和误检，因此出现假阳性和假阴性的现象。16SrDNA鉴定亦需要3到5天的时间，而且大多数情况下需要结合生理生化鉴定才能确定细菌为哪一个种群。利用基于特异的核酸标识序列进行PCR检测细菌的技术目前已经得到认同，并且正在推广，该技术相对传统的细菌检测方法具有高通量、检测速度快、特异性强和灵敏度高等优点。利用PCR等分子方法进行奇异变形杆菌的检测具有检测过程快速和灵敏度高等优点。PCR的扩增过程仅需要2个小时， 大大缩减了检验检疫所需要的时间，提高了工作效率。而且利用实时荧光定量PCR能够较快和较为准确地对环境中的细菌，尤其是病原菌，进行定量检测。但是目前能够用于PCR检测奇异变形杆菌的特异核酸标识序列发现的还比较少，目前已知的奇异变形杆菌的核酸标识序列主要有16S序列，16S-23S间区序列，ureC序列和一段功能未知的核酸片段。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列及其应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列ureRFl :5，-GGTGAGATTTGTATTAATGG-3，ureRRl :5’ -ATAATCTGGAAGATGACGAG-3，。检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用所述奇异变形杆菌特异的核酸标识序列应用于检测环境中的奇异变形杆菌。采用普通PCR定性检测奇异变形杆菌，具体过程为(1)以核酸标识序列ureRFl和ureRRl为正向引物和反向引物进行PCR, 15μ 1的 PCR的反应体系，PCR体系的反应条件为94°C变性％iin，然后94°C变性40seC，58°C退火 lmin，72°C延伸30sec，30个循环，最后72°C继续延伸IOmin ；(2)所得PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结果在凝胶成像分析系统中进行分析，检测PCR产物的有无和大小。
所述PCR的反应体系为15 μ 1的PCR反应体系分别加入以下体积的物质，1.5μ 1 的10XPCR缓冲液，0. 5μ 1的ΙΟμ οΙ Γ1正向引物，0. 5 μ 1的10 μ mol Γ1反向引物， 1. 5 μ 1的dNTP混合物，1 μ 1的模板，0. 25 μ 1的Taq DNA聚合酶，9. 75 μ 1的灭菌双蒸水。所述10XPCR 缓冲液为 200mmol F1Tris HCl (pH 8. 4)，200mmol F1KCl, 15mmol ” MgCl2。所述步骤(2)琼脂糖凝胶电泳中出现的DNA片段即为，检测样品中含有奇异变形杆菌。检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用采用实时荧光定量 (real-time, RT) PCR定量检测奇异变形杆菌，具体过程为(1)将奇异变形杆菌按10倍的浓度梯度分别稀释，将稀释液10，OOOrpm离心5min 收集菌体，提取细菌的基因组DNA，作为实时荧光定量PCR模板；(2)分别以核酸标识序列ureRFl和ureRRl为正向引物和反向引物进行实时荧光定量PCR，20 μ 1的实时荧光定量PCR反应体系，实时荧光定量PCR的反应条件为94°C变性30sec，然后94°C变性5sec，58°C变性和延伸20sec，循环40个循环，最后94°C热变性 15sec，58°C变性和延伸 lmin，94°C热变性 15sec ；(3)数据分析以细菌的浓度(CFU πιΓ1)为横坐标，以达到荧光阈值所需要的循环数(Ct值)为纵坐标，绘制散点曲线，即可定性地检测样品中的奇异变形杆菌的数量。所述步骤(1)将奇异变形杆菌按10倍的浓度梯度分别稀释至终浓度为1. OX 108， 1. OXlO7,1. OXlO6,1. OXlO5,1. OXlO4,1. OXlO3,1. OXlO2 禾口 1. OX IO1CFU mr1,收集 Iml 不同浓度梯度的奇异变形杆菌稀释液，提取基因组DNA，待用。所述步骤O)中的实时荧光定量PCR反应体系，PCR的反应体系分别加入以下体积的物质，10μ 1 的 STOR Premix，0. 5μ 1 的 ΙΟμπιοΙ Γ1 正向引物，0. 5 μ 1 的 10 μ mol Γ1 反向引物，0. 4 μ 1的ROX校正液和1 μ 1的模板DNA，7. 6 μ 1的双蒸水。本发明所具有的优点本发明利用奇异变形杆菌特异的核酸标识序列对其进行特异地定性、定量的检测。特别是本发明的核酸标识序列可在海水、淡水和尿液等不同水环境中进行奇异变形杆菌的定性和定量PCR检测。该发明的检测过程所需要的时间短，检测方法灵敏度和特异性
尚ο本发明的反应原理根据奇异变形杆菌所特有的ureR基因的序列，设计了 ureRFl和ureRRl —对核苷酸序列作为PCR反应的正反向引物。奇异变形杆菌中含有ureR基因，因此用奇异变形杆菌的DNA或是菌液作为PCR反应的模板就能够得到ureR基因的部分序列，因此在凝胶电泳分析中就能够看到225bp的DNA片段，在实时荧光定量PCR反应中能够看到荧光的增强；而在测定的其他种细菌中均不含有ureR基因，因此用其他种细菌的DNA或是菌液作为PCR反应的模板就不能够得到ureR基因的部分序列，因此在凝胶电泳分析中就不能够看到225bp的 DNA片段，在实时荧光定量PCR反应中亦不能够看到荧光的增强。
图1为本发明实施例提供的核酸标识序列进行检测各种菌种的电泳图谱，其中泳道1和2为霍氏肠杆菌Pd9和阴沟肠杆菌V2 ；泳道3和4，不动杆菌HS51和醋酸钙不动杆菌T32 ；泳道5和6，克雷伯菌Pd2和肺炎克莱伯菌Pd8 ；泳道7-10,弧菌V134，哈维氏弧菌 T4，副溶血弧菌BL，鱼肠道弧菌BX ；泳道11，迟缓爱德华氏菌T2 ；泳道12-16，假单胞菌属 J61和DX7，变形假单胞菌DJ3，绿脓假单胞菌I和恶臭假单胞菌SPl ；泳道17，斯氏普罗威登斯菌；泳道18-20，埃希氏杆菌属HS21，埃希氏大肠杆菌ToplO和HSll ；泳道21，奇异变形杆菌V7 ；泳道22，DNA分子量标准。图2为本发明实施例提供的分别以奇异变形杆菌特异的核酸标识序列ureRFl和ureRRl为正反向引物，奇异变形杆菌V7的培养液作为模板，PCR 得到的DNA片段的核酸序列图谱。图3为本发明实施例提供的普通PCR方法检测奇异变形杆菌的凝胶电泳图谱。其中泳道1，DNA分子量标准；奇异变形杆菌的浓度分别为泳道2，LOXIO0CFU πιΓ1 ；泳道3， 1. OXIOiCFU InrlAIdt^LOXlO2CFU HirlAldtsa-OXiO3CFU mi—jldtea.oxio^FU πιΓ1 ；泳道 7，1.0X IO5CFUmr1 ；泳道 8，1. OX IO6CFU πιΓ1 ；泳道9，1. 0 X IO7CFU πιΓ1 ；泳道 10， 1. OXlO8CFU πιΓ1,,图4为本发明实施例提供的采用PCR方法检测淡水、海水和尿液中的奇异变形杆菌的凝胶电泳图谱，其中泳道1，DNA分子量标准；奇异变形杆菌的浓度分别为泳道 2，1.0Χ IO1CFU ml—1(尿液)；泳道 3，1. 0X IO2CFU ml—1 (尿液)；泳道 4，1. 0X IO3CFU πιΓ1 (尿液)；泳道 5，1.0X IO4CFU πιΓ1 (尿液)；泳道 6，1. 0 X IO5CFU πιΓ1 (尿液)；泳道 7， 1. OXlO6CFU πιΓ1 (尿液)；泳道 8，1. 0 X IO7CFU ml—1 (尿液)；泳道 9，1. 0 X IO1CFU πιΓ1 (海水)；泳道 10，1. OX IO2CFU πιΓ1 (海水)；泳道 11，1. OXlO3CFU πιΓ1 (海水)；泳道 12， 1. OXlO4CFU πιΓ1 (海水)；泳道 13，1. 0 X IO5CFU πιΓ1 (海水)；泳道 14，1. 0 X IO6CFU ι Γ1 (海水)；泳道 15，1.0Χ IO7CFU πιΓ1 (海水)；泳道 16，1. 0X IO1CFU πιΓ1 (淡水)；泳道 17， 1. OXlO2CFU πιΓ1 (淡水)；泳道 18，1. 0 X IO3CFU πιΓ1 (淡水)；泳道 19，1. 0 X IO4CFU πιΓ1 (淡水)；泳道 20，1. 0 X IO5CFU πιΓ1 (淡水)；泳道 21，1. 0 X IO6CFU πιΓ1 (淡水)；泳道 22， 1. OXlO7CFU πιΓ1 (淡水)。图5为本发明实施例提供的实时荧光定量PCR检测奇异变形杆菌的基因组DNA 图，其中横坐标是模板DNA的含量(fg)，纵坐标是Ct值。图6为本发明实施例提供的实时荧光定量PCR对奇异变形杆菌进行定量检测图， 其中横坐标是奇异变形杆菌的菌液浓度(CFU πιΓ1)，纵坐标是Ct值。
具体实施例方式本发明利用特异性引物定性检测奇异变形杆菌的普通PCR方法，其具体步骤为(1)以核酸标识序列ureRFl和ureRRl分别为正向引物和反向引物，15 μ 1 的PCR的反应体系，分别加入以下体积的物质1.5μ1的10XPCR缓冲液OOOmmol F1Tris-HCKpH 8. 4) ,200mmol F1KCl, 15mmol F1MgCl2)，0· 5 μ 1 的 10 μ mo 1 Γ1 正向引物， 0. 5 μ 1 的 10 μ mol Γ1 反向引物，1. 5 μ 1 的 dNTP 混合物(dATP、dGTP、dCTP、dTTP 的浓度分别为2. 5匪ο11_1)，1μ 1的模板，0. 25μ 1的Taq DNA聚合酶，9. 75 μ 1的灭菌双蒸水。PCR 体系的反应条件为94°C变性％iin，然后94°C变性40sec，58°C退火lmin，72°C延伸30sec， 30个循环。然后最后72°C继续延伸IOmin。(2)5μ1的PCR产物在的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结果在凝胶成像分析系统中进行分析，检测PCR产物的有无和大小。本发明利用特异性引物定量检测奇异变形杆菌的实时荧光定量PCR检测的方法， 其具体步骤为(1)将奇异变形杆菌按10倍的浓度梯度分别稀释到至终浓度为1.0X108， 1. OX IO7, 1. OX IO6, 1. OX IO5, 1. OX IO4, 1. OX IO3, 1. OX IO2 和 Loxio1CFU mr1， 10，OOOrpm离心5min收集菌体。用使用基因组提取试剂盒(购自天根公司)并参照试剂盒说明书提取细菌的基因组DNA，吸取提取的1 μ 1基因组DNA作为模板进行实时荧光定量 PCR。(2) 20 μ 1的实时荧光定量PCR的反应体系中分别加入以下体积的物质为10μ 1 的 SYBR Premix(Takara)，0· 5μ 1 的 10μ mo 1 Γ1 正向引物，0· 5 μ 1 的 10 μ mol Γ1 反向引物，0. 4 μ 1的ROX校正液(Takara)和1 μ 1的模板DNA，7. 6 μ 1的双蒸水。实时荧光定量 PCR的反应条件为94°C变性30sec，然后94°C变性kec，58°C变性和延伸20sec，循环40个循环，最后94°C热变性15sec，58°C变性和延伸lmin，94C热变性15sec。(3)以细菌的浓度为横坐标，以达到荧光阈值所需要的循环数(Ct值)为纵坐标， 绘制散点曲线。实施例11.奇异变形杆菌的筛选和基因组DNA的提取在烟台海岸带附近不同的海域取样，收集不同区域的海水。将海水样品取100 μ 1涂布到LB培养基(成分胰蛋白胨，IOg Γ1，酵母浸膏，5g Γ1，氯化钠，IOg Γ1，琼脂糖，12g Γ1)，将固体培养基上出现的能够快速移动的菌落进行16S rDNA测序，在NCBI数据库中BLAST的结果为奇异变形杆菌，命名为V7。 该菌株已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏；地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2010年11月06日；编号为CGMCC No. 4312 ； 奇异变形杆菌ftOteus mirabilis。V7在LB培养基中进行纯培养，并将培养液中加入50% 的甘油保存在_80°C超低温冰箱中。在使用时，首先将甘油中保存的菌株划线接种于LB固体平板，培养过夜，挑取单菌落，将其接种于5ml的LB液体中，待细菌生长至对数期时， 测定菌液的0D_，离心收集菌体，使用基因组提取试剂盒(购自天根公司)并参照试剂盒说明书提取菌体的基因组DNA，将提取的基因组DNA溶解在50 μ 1的无菌水中，使用NanoDrop 核酸蛋白测定仪测定提取的奇异变形杆菌基因组DNA的浓度。2.奇异变形杆菌特异的核酸标识序列的设计与验证(1)根据奇异变形杆菌ureR的核酸序列，设计引物ureRFl 5，-GGTGAGATTTGTATTAATGG-3，和 ureRRl :5，-ATAATCTGGAAGATGACGAG-3，。分别利用此核酸标识序列ureRFl和ureRRl作为PCR反应的正反向引物，利用分离到的奇异变形杆菌 V7(CGMCC No. 4312)和含有ureR同源基因的斯氏普罗威登斯菌，埃希氏杆菌，埃希氏大肠杆菌，以及一些环境中常见的病原菌(菌株包括弧菌、爱德华氏菌、克雷伯氏菌和假单胞菌等菌株)为模板PCR，确定利用PCR进行奇异变形杆菌检测的特异性。(2) 15 μ 1的PCR的反应体系分别加入以下体积的物质1. 5 μ 1的10 X PCR缓冲液 (200mmol F1Tris-HCl (pH 8. 4), 200mmol F1KCl, 15mmol广MgCl2)，0· 5 μ 1 的 10 μ mol Γ1 正向引物，0. 5μ 1 的 10 μ mol Γ1 反向引物，1. 5μ 1 的 dNTP 混合物(dATP、dGTP、dCTP、dTTP的浓度分别为2. 5mmol γ1)，1 μ 1的模板，0. 25 μ 1的taq dna聚合酶，9. 75 μ 1的灭菌双蒸水。pcr体系的反应条件为94°c变性％iin，然后94°c变性40sec，58°c退火lmin，72°c延伸 30sec，30个循环。然后最后72°c继续延伸lomin。(3)5μ 1的pcr产物在的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结果在凝胶成像分析系统中进行分析，检测pcr产物的有无和大小。实验结果如图1所示，只有奇异变形杆菌v7能够pcr得到大小为22^ρ的dna条带，而其他菌株经过pcr无相应大小的dna条带。将pcr得到的奇异变形杆菌v7的核酸片段进行测序，得到的核酸序列如图2所示，于美国国家生物技术信息中心(ncbi)数据库中进行序列比对，发现来自于奇异变形杆菌v7的urer序列和奇异变形杆菌hi4320的序列 am942759和z18752具有100%的同源性。此结果表明，本发明专利中的针对奇异变形杆菌的特异核酸标示序列能够用来进行奇异变形杆菌的检测。3.利用pcr检测奇异变形杆菌的灵敏度(1)将生长至od6tltl约为1. o的奇异变形杆菌培养液，按10倍的浓度梯度稀释到终浓度分别 % 1. ox io8,1.0x io7,1.0x io6,1.0x io5,1.0x io4,1.0x io3,1.0x io2, 1.0x101和loxio0cfu ml—1，分别取1 μ 1作为pcr反应的模板。(2) 15 μ 1的pcr的反应体系，中分别加入以下体积的物质1. 5 μ 1的ioxpcr缓冲液 ooommol f1tris-hckph 8. 4), 200mmol f1kcl, 15mmol f1mgcl2), 0. 5 μ i^loymol γ1 正向引物，0. 5μ 1 的 ιομπιοιγ1 反向引物，1. 5μ 1 的 dntp 混合物(datp、dgtp、dctp、 dttp的浓度分别为2. 5mmol γ1)，1 μ 1的模板，0. 25 μ 1的i1aq dna聚合酶，9. 75 μ 1的灭菌双蒸水。pcr体系的反应条件为94°c变性％iin，然后94°c变性40sec，58°c退火lmin，72°c 延伸30sec，30个循环。然后最后72°c继续延伸lomin。(3)5μ 1的pcr产物在的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结果在凝胶成像分析系统中进行分析，检测pcr产物的有无和大小。结果如图3所示，从1. ox io8到1. ox io3cfu ml—1的奇异变形杆菌稀释液，经过如上的pcr反应后能够得到强阳性的结果；1. ox io2cfu πιγ1的奇异变形杆菌稀释液经过 pcr后有的时候能够得到弱的阳性结果，而有的时候得不到相应的pcr产物，在凝胶电泳分析中呈现的阳性结果不够稳定。4.利用pcr方法检测淡水、海水和尿液中的奇异变形杆菌(1)分别取1 μ 1的尿液、海水和淡水作为模板，进行pcr。(2) 15 μ 1的pcr的反应体系，中分别加入以下体积的物质1. 5 μ 1的ioxpcr缓冲液 ooommol f1tris-hckph 8. 4), 200mmol f1kcl, 15mmol f1mgcl2), 0. 5 μ i^loymol γ1 正向引物，0. 5μ 1 的 ιομπιοιγ1 反向引物，1. 5μ 1 的 dntp 混合物(datp、dgtp、dctp、 dttp的浓度分别为2. 5mmol γ1)，1 μ 1的模板，0. 25 μ 1的i1aq dna聚合酶，9. 75 μ 1的灭菌双蒸水。pcr体系的反应条件为94°c变性％iin，然后94°c变性40sec，58°c退火lmin，72°c 延伸30sec，30个循环。然后最后72°c继续延伸lomin。(3)5μ 1的pcr产物在的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结果在凝胶成像分析系统中进行分析，检测pcr产物的有无和大小。实验结果表明，在采集的尿液、海水和淡水中均无奇异变形杆菌。(4)将不同浓度梯度的奇异变形杆菌分别加入到采集到的尿液、海水和淡水中，使奇异变形杆菌在不同的液体环境中的终浓度分别为1.0x107，1.0x io6,1.0x io5, 1. oxlo4,1. oxlo3,1. oxlo2 禾口 1. ox io1cfu IIir1O5)取1 μ 1上述菌液作为pcr的模板，15 μ 1的pcr的反应体系，分别加入以下体积的物质1. 5μ 1 的 10xpcr缓冲液 ooommol f1tris-hckph 8. 4) ,200mmol f1kcl, 15mmol f1mgcl2),0. 5μ 1 的 ιομπιοιγ1 正向引物，0. 5μ 1 的 ioymol γ1 反向引物，1.5μ 1 wdntp 混合物(datp、dgtp、dctp、dttp 的浓度分别为 2. 5mmol γ1)，1 μ 1 的模板，0. 25 μ 1 的 taq dna聚合酶，9. 75 μ 1的灭菌双蒸水。pcr体系的反应条件为94°c变性^iin，然后94°c变性 40sec，58°c退火lmin，72°c延伸30sec，30个循环。然后最后72°c继续延伸lomin。(6)5μ 1的pcr产物在的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结果在凝胶成像分析系统中进行分析，检测pcr产物的有无和大小。结果如图4所示。在尿液中的奇异变形杆菌，浓度为从1. oxlo7到LOXIO4CFu ml—1的稀释液为阳性结果；在海水中的奇异变形杆菌，浓度为从1.0x107到LOXIO3CFu ml—1的稀释液为阳性结果；在淡水中的奇异变形杆菌，浓度为从1.0x107到LOXIO3CFu πιΓ1的稀释液为阳性结果。5.利用实时定量pcr对环境中的奇异变形杆菌进行定量。(1)将提取的奇异变形杆菌的基因组dna进行紫外定量，然后进行10倍稀释。取 1 μ 1稀释后的dna作为实时荧光定量pcr的模板，进行实时荧光定量pcr。(2)20μ 1的实时荧光定量pcr的反应体系为10μ 1的storpremix，0. 5μ 1的 ioymol γ1正向引物，0.5μ 1的ioymol γ1反向引物，0.4μ 1的rox校正液和1 μ 1的模板dna，7. 6μ 1的双蒸水。实时荧光定量pcr的反应条件为94°c变性30sec，然后94°c变性5sec，58°c变性和延伸20sec，循环40个循环，最后94°c热变性15sec，58°c变性和延伸 lmin，94°c 热变性 15sec。(3)以细菌的浓度为横坐标，以ct值为纵坐标，绘制散点曲线。实验结果如图5所示，dna浓度在85fg μ γ1到85ng μ γ1之间，dna的浓度与ct 值成严格的负相关关系，实时荧光定量pcr可以检测到85fg μ γ1的奇异变形杆菌dna。(4)将0d600约为1. o的奇异变形杆菌培养液按10倍的浓度梯度稀释到终浓度分别为 1. oxlo8,1. oxlo7,1. oxlo6,1. oxlo5,1. oxlo4,1. oxlo3,1. oxlo2 禾口 1. ox io1cfu mr1，13，ooorpm离心5min收集菌体，使用基因组提取试剂盒(购自天根公司)并参照试剂盒说明书提取菌体的基因组dna，将提取的1 μ 1基因组dna作为模板进行实时荧光定量 pcr。(5)20μ 1的实时荧光定量pcr的反应体系为10μ 1的storpremix，0. 5 μ 1的 ioymol γ1正向引物，0.5μ 1的ioymol γ1反向引物，0.4μ 1的rox校正液和1 μ 1的模板dna，7. 6μ 1的双蒸水。实时荧光定量pcr的反应条件为94°c变性30sec，然后94°c变性kec，58°c变性和延伸20sec，循环40个循环，最后94°c热变性15sec，58°c变性和延伸 lmin，94°c 热变性 15sec。(6)以细菌的浓度为横坐标，以ct值为纵坐标，绘制散点曲线。实验结果如图6所示，(a)实时荧光定量pcr可以检测到iocfu ml—1的奇异变形杆菌，细菌浓度在1. ox io8到1. ox io1cfu ml-1的浓度之间和ct值成较好的负相关关系， r2 = 0. 94。(b)细菌的浓度在1. oxlo8到1. ox io4cfu πιγ1之间和ct值成严格的负相关关系，R2 = 0. 99。即在细菌浓度稍高时，定量检测的准确度也越高。
权利要求
1.一种检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列，其特征在于ureRFl :5’ -GGTGAGATTTGTATTAATGG-3’ureRRl :5’ -ATAATCTGGAAGATGACGAG-3，。
2.—种权利要求1所述的检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用，其特征在于所述奇异变形杆菌特异的核酸标识序列应用于检测环境中的奇异变形杆菌。
3.按权利要求2所述的检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用，其特征在于采用普通PCR定性检测奇异变形杆菌，具体过程为(1)以核酸标识序列ureRFl和ureRRl为正向引物和反向引物进行PCR,15 μ 1的PCR 的反应体系，PCR体系的反应条件为94°C变性％iin，然后94°C变性40seC，58°C退火lmin， 72°C延伸30sec，30个循环，最后72°C继续延伸IOmin ；(2)所得PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结果在凝胶成像分析系统中进行分析，检测PCR产物的有无和大小。
4.按权利要求3所述的检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用，其特征在于所述PCR的反应体系为15μ 1的PCR反应体系分别加入以下体积的物质，1.5μ 1的 10XPCR 缓冲液，0. 5μ 1 的 IOymol Γ1 正向引物，0. 5μ 1 的 IOymol Γ1 反向引物，1. 5μ 1 的dNTP混合物，1 μ 1的模板，0. 25 μ 1的Taq DNA聚合酶，9. 75 μ 1的灭菌双蒸水。
5.按权利要求4所述的检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用，其特征在于所述 10XPCR 缓冲液为 200mmol F1Tris HCl (pH 8. 4)，200mmol F1KCl, 15mmol ” MgCl2。
6.按权利要求3所述的检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用，其特征在于所述步骤(2)琼脂糖凝胶电泳中出现225bp的DNA片段即为，检测样品中含有奇异变形杆菌。
7.按权利要求2所述的检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用，其特征在于采用实时荧光定量(real-time，RT) PCR定量检测奇异变形杆菌，具体过程为(1)将奇异变形杆菌按10倍的浓度梯度分别稀释，将稀释液10，OOOrpm离心5min收集菌体，提取细菌的基因组DNA，作为实时荧光定量PCR模板；(2)分别以核酸标识序列ureRFl和ureRRl为正向引物和反向引物进行实时荧光定量PCR，20y 1的实时荧光定量PCR反应体系，实时荧光定量PCR的反应条件为94°C变性30sec，然后94°C变性5sec，58°C变性和延伸20sec，循环40个循环，最后94°C热变性 15sec，58°C变性和延伸 lmin，94°C热变性 15sec ；(3)数据分析以细菌的浓度(CFUπιΓ1)为横坐标，以达到荧光阈值所需要的循环数 (Ct值)为纵坐标，绘制散点曲线，即可定性地检测样品中的奇异变形杆菌的数量。
8.按权利要求2所述的检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用，其特征在于所述步骤(1)将奇异变形杆菌按10倍的浓度梯度分别稀释至终浓度为1.0X108， 1. OXlO7,1. OXlO6,1. OXlO5,1. OXlO4,1. OXlO3,1. OXlO2 禾口 1. OX IO1CFU mr1,收集 Iml 不同浓度梯度的奇异变形杆菌稀释液，提取基因组DNA，待用。
9.按权利要求2所述的检测奇异变形杆菌的特异的核酸标识序列的应用，其特征在于所述步骤O)中的实时荧光定量PCR反应体系，PCR的反应体系分别加入以下体积的物质，10 μ 1 的 SYBR Premix, 0. 5 μ 1 的 IOymol Γ1 正向引物，0. 5 μ 1 的 IOymol Γ1 反向引物，0. 4 μ 1的ROX校正液和1 μ 1的模板DNA，7. 6 μ 1的双蒸水。
全文摘要
本发明涉及奇异变形杆菌的检测，具体的说是一种检测奇异变形杆菌特异的核酸标识序列及其应用。检测奇异变形杆菌特异的核酸标识序列为ureRF15’-GGTGAGATTTGTATTAATGG-3’；ureRR15’-ATAATCTGGAAGATGACGAG-3’。所述奇异变形杆菌特异的核酸标识序列应用于检测环境中的奇异变形杆菌。利用本发明方法对不同环境中的奇异变形杆菌进行检测，具有简便、快速、特异性和灵敏度高等优点。该方法可用于环境和临床样品的奇异变形杆菌的检测和流行病学调查，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/11GK102559863SQ201110290460
公开日2012年7月11日 申请日期2011年9月23日 优先权日2011年9月23日
发明者张卫卫, 殷堃, 牛宗亮, 陈令新 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所