专利名称：一种检测结核分枝杆菌感染的试剂、方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物医学检验领域，涉及微生物分子生物学检测方法，具体涉及一种检 测结核分枝杆菌感染的试剂、方法及应用。
背景技术：
结核病是当今全球面临的主要公共健康问题之一，它的病原体是结核分枝杆菌， 属分枝杆菌属。近年来，由于耐药结核病、人类免疫缺陷病毒(HIV)合并结核分枝杆菌感 染、大规模人口流动等问题的出现，结核病疫情出现加重的趋势。据调查报道，全球每年约 有900万人发展成活动性结核，200万 300万人死于结核病。我国是全球22个结核病高 负担国家之一，有结核病患者450万，其中开放性肺结核患者高达200万。据估计，我国每 年新发肺结核145万，约有13万人因结核病死亡。结核病已成为引起成年人死亡的头号传 染病。据WHO报道，全球三分之一的人口(约20亿)已感染了结核杆菌，如不采取措施，近 10年内还将有约3亿人受结核杆菌感染。特异性抗原诊断一直是确认病原体感染及评估感染状况较为可靠的方法，且有早 期诊断价值，其已经在HBV、HCV、HIV等疾病的诊断方面获得了广泛的应用。由于人体在 对抗结核分枝杆菌的感染中，细胞介导的免疫反应起到了关键性的作用，所以寻找结核杆 菌特异性的T细胞抗原和检测T细胞免疫反应已经成为近年来研究热点。一种以T细胞 为基础的Y-干扰素释放实验(Interferon-YRelease Assay, IGRAs)得到了较为广泛 的应用，其原理是受到结核分枝杆菌抗原刺激而致敏的T细胞，再次遇到同类抗原时能产 生Y-干扰素，对全血或分离的外周血单核细胞在结核分枝杆菌特异性抗原刺激后产生的 Y-干扰素进行检测，就可以反映机体是否存在潜伏性的结核感染。目前获得商品化应用的 IGRAs 主要有 2 种方法，一种称为 QuantiFERON(QFT)-TB GOLD 试验(Cellestis, Victoria, Australia)，另一种称为 T-SPOT. TB 试验(Oxford Immunotec，Oxford，UK)。这两种检测方 法所采用的结核分枝杆菌特异性的抗原为ESAT-6 (early secreted antigenic target 6) 禾口 CFP-10 (culture filtrate protein 10)，其编码基因位于 RDl (Region ofDifference 1)区，RDl在BCG和绝大多数非结核分枝杆菌的基因组中是缺失的，理论上可以避免上述在 TST中影响特异性的PPD交叉抗原反应，能够较好地区分真性结核感染和BCG接种诱导的反 应。但上述ESAT-6、CFP-10抗原属于结核杆菌早期分泌蛋白，主要在结核杆菌的快速 生长期分泌，而在结核持续感染中分泌量减少，导致检测的敏感性不足，局限了该试剂的推 广。另有研究显示上述两种IGRAs试剂在发展中国家的效果并不理想，推测可能与发展中 国家非结核分支杆菌的感染率较高有关。此外该两种IGRAs试剂价格较昂贵，在发展中国 家难以得到广泛应用。随着结核分枝杆菌全基因组测序的完成，其基因组与BCG基因组之间的差异也被 揭示。通过比较基因组学，可以得到结核杆菌基因在BCG中缺失的部分，称为RD区。RD区 中的基因，特别是那些同时在非结核分枝杆菌中也缺失的基因，它们所编码的蛋白成为寻找新的结核杆菌特异性抗原的首选。除RDl区的ESAT-6和CFP-IO外，多种RD区蛋白被证明具有较高的诊断价值，如RD2区的Rvl980(MPT64)，Rvl984(Cfp21)，Rvl985c及RDll区 的Rv3425，Rv3429等。但部分具有较强免疫原性的RD区抗原仍与BCG和非结核分枝杆菌 之间存在交叉反应，影响的诊断的特异性。有关研究认为，通过进一步对这些蛋白的T细胞 抗原表位进行分析，并除去与BCG有交叉反应的部分，将可以得到具有较高敏感性和特异 性的多肽或混合物用于结核病的诊断。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的缺陷，提供一种新的检测结核分枝杆菌感染的 试齐LU本发明公开了一种新的结核分枝杆菌检测试剂，其含有SEQ ID NO. 1_10代表的多 肽或其类似物。它能有效地检测活动性结核病和结核潜伏感染，同时它不受BCG疫苗和非 结核分枝杆菌感染的干扰。本发明的另一个目的是提供一种新的检测结核分枝杆菌感染的方法，本方法基于 细胞介导的免疫反应，使用单个或多个SEQ ID NO. 1-10的多肽与结核杆菌宿主的T细胞相 接触，通过检测激活T细胞释放的细胞因子，确定T细胞是否识别该多肽。本发明的目的还在于进一步提供基于上述多肽的诊断试剂盒和其应用。本发明的一个方面，提供了一组新的多肽，含有由SEQ ID NO. 1-10代表的氨基酸 序列。它们来自于BCG疫苗相对结核分枝杆菌的基因组缺失的区域(RD区)，可用于检测活 动性结核病和潜伏性结核感染。本发明所述的SEQ ID. 1-10序列如下1. QQVGQVLVVREKPCRATTAGIPLLR2. ATTAGIPLLRLAAQTALLESEALAE3. LREGVAMGAVTTERNPVPGCRVHPL4. PVPGCRVHPLGEMRYLPVASRPFVQ5. LPVASRPFVQRHLSDGFTAAAAAKA6. RRAIT RPTHF VPTTE GFTAA ARAGL,7. GFTAAARAGLGffGMFPEKLAASPLA8. PEKLAASPLADGSFVRVCDIHLDVP9. RELAYSVETTAESLEDELDELDENW10. DLLADAVERYLQffLSKHSSQLKHAA其中序列1-8来源于Rvl985c，序列9-10来源于Rv3425。本发明中涉及多有氨基酸序列都是从N端到C端的。本发明中所述多肽片段，都是通过T细胞抗原表位分析筛选的具有高度敏感性 和特异性的多肽片段。本发明中SEQ ID NO. 1-10的多肽均为经过优选的，包含结核分枝 杆菌特异性T细胞抗原表位核心序列的多肽。为了实现上述目的，具体的分析及筛选方法 为首先通过生物信息学技术对RD2区蛋白Rvl985c和RDll区蛋白Rv3425的T细胞抗 原表位进行预测，同时分析其与不同HLA分型之间的识别关系。根据预测及分析的结果以 Overlap(重叠序列)的方法设计覆盖蛋白氨基酸序列的多肽。然后收集临床标本，包括结核感染者和BCG接种的健康人群，以一种基于全血(Whole Blood)的Y -干扰素释放试验 及T细胞增殖实验的方法进行系统的抗原表位作图(Epitope Mapping)。并通过反复的临 床验证实验，找到了结核分枝杆菌特异性T细胞抗原表位，并排除了部分与BCG之间有交叉 反应的抗原表位。本发明筛选并通过临床试验证实了结核分枝杆菌特异性的T细胞抗原表位。 本发明所述多肽与相应的蛋白包括应用基因工程技术获得的重组蛋白比较，其作 用和效果是完全不同的，一方面不包含与BCG和非结核分枝杆菌有交叉反应的抗原表位， 保证了诊断的特异性，另一方面，本发明所述多肽均含有抗原表位的核心序列，与不同HLA 分型个体间有较高的结合率和免疫原性，可以简化抗原加工过程而直接与MHC分子结合， 提高反应效率。此外，所述多肽可由全自动化的仪器合成，费用较低，质量有所保证。本发明上下文中所述的抗原表位多肽除了通常所指的一种氨基酸聚合物，还应该 包括其类似物。所述类似物，是指其特性与所述多肽相同，包括其同样可以与抗体特异性地 结合，这种同源肽通常具有至少75%的同源性，优选至少90%、95%的同源性。其不同一 般来自于氨基酸残基的替换、插入、缺失和修饰，可发生在序列的N端、C端或其他任何位置 上。具有代表性的是类似物可以结合到相同的抗体分子上，且类似物中处于等价位置上的 氨基酸与原始肽中的那些抗原序列相同或保守。所述的修饰，通常指的是天然的转录后修饰或人工修饰。修饰可提供化学部分的 改变，包括氨基、乙酰基、羟基、卤素基团和碳水化合物基团。具有代表性的是一种是氨基酸 侧链的修饰，即形成一个或多个非天然氨基酸。本发明中所述的抗原表位多肽可以通过固相多肽合成方法合成得到，也可以通过 基因工程技术制备得到，一种具有代表性的方法是用较长的融合蛋白制备上述肽段，此融 合蛋白包含上述代表性的肽段序列。这些技术都为本领域人员所通晓。本发明所述抗原表位多肽或其连接物可用于制备成为检测活动性结核病和潜伏 性结核感染的试剂。将本发明所述的抗原表位多肽制备成抗原试剂，至少包括所述的一个 或全部抗原表位，这些多肽通过自身连接、相互连接或与载体连接。本发明的另一个方面，提供一种新的检测结核分枝杆菌感染的方法，通过使用SEQ IDN0. 1-10的多肽或混合物，刺激个体外周血中的T细胞，然后检测T细胞释放的细胞因子， 以确定T细胞是否识别这些多肽或类似物，从而间接地反应机体是否感染过结核杆菌。所述结核杆菌感染，通常指的是活动性结核病或潜伏性结核感染的人群。机体在 感染结核分枝杆菌后，只有少数发展成为活动性结核病，表现出相应的临床症状，如发热、 咳嗽、胸片异常等。大多数人感染后由于机体免疫系统控制结核杆菌复制，而无相应的临床 症状，但机体无法将结核杆菌全部清除，即潜伏性结核感染(LTBI)。潜伏性结核感染者在免 疫力低下等情况下可以发展成为活动性结核病。因此此方法不仅可用于活动性结核病的诊 断，还可以在高危人群中对潜伏性结核感染者进行筛查。上述方法所述T细胞在感染后被结核杆菌的抗原预先致敏，这些T细胞可在宿主 的外周血液、肺泡灌洗液、胸水、脑脊液、淋巴结及其它包含T细胞的组织中被检出。此T细 胞主要是⑶4+T细胞，也可以是⑶8+T细胞等。本方法中所述的识别，通常是指MHC-肽复合物与TCR(T细胞受体)特异的结合而 诱发的τ细胞的激活，T细胞激活后开始分泌相关细胞因子，如IFN- y、IL-2、IL-12、TNF- α等，通过测定这些细胞因子的含量变化，可以反映T细胞激活的状态。此外，激活的T细胞 也会发生大小、数量(增殖)或表面标志的改变。测定细胞因子的方法通常是领域内常用 的方法，如ELISA、ELISPOT、，Immunoblotting、T细胞增殖试验等。具有代表性的是采用预 先加入的抗体与分泌的细胞因子相结合，通过测定抗体或抗体复合物的存在来检测所述的 因子。所述抗体可以是但克隆抗体或多克隆抗体，也可以使商品化购买的或者使用标准技 术制备的。
在一个实施方案中，本发明采用ELISA的方法直接对全血标本中的IFN-γ含量 进行检测，通过在酶标仪上读取OD值和对照标准曲线，可以确定标本中的IFN-Y含量。 ELISA方法操作简便，有商品化试剂盒可以应用，适合大量标本的检测。在另一个实施方案 中，使用的检测方法是一种高灵敏度酶联免疫斑点法，即ELISP0T方法来检测T细胞分泌的 IFN-γ。IFN-Y先与固定在固相载体上的IFN-Y单克隆抗体结合形成一抗复合物，再与用 生物素偶联的第二 IFN-Y抗体结核结合，然后使用酶联的抗生物素蛋白链菌素与生物素 特异结合。最后通过酶的显色底物在固相载体上形成斑点，每个斑点代表一个分泌IFN-Y 的T细胞，斑点的数量可以代表性地显示被激活的T细胞的数量。本方法中所述T细胞可以使体外分离的，也可以是未加工过的或者是体内的。在 一个实施方案中直接采用肝素抗凝的全血标本，用相应抗原刺激后，全血内特异性的T细 胞会释放相应细胞因子，这些细胞因子可以在全血离心后的上清中测得。也可以从血液或 其他样本中分离外周血单核细胞(PBMC)，其中将包括T细胞和抗原递呈细胞(APC)。APC可 将抗原肽递呈给T细胞，供T细胞识别。本发明的再一个方面，提供了实施此方法的试剂盒，所述的试剂盒应包括序列为 ID的一种或多种多肽或其类似物，以及一种检测T细胞对相应多肽识别的工具。所述的试 剂盒中的多肽可以是单独使用，也可以混合、连续使用，以提高检测的敏感性。如实施例2 中使用混合多肽。试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照。阳性对照所选用的抗原对绝大多数个体的 T细胞均能产生应答，如市售的PHA (植物血凝素)。阴性对照通常不加入抗原成分，选用培 养基或其他缓冲液。本发明能有效地在体外检测活动性结核病和潜伏性结核感染，同时不受接种BCG 疫苗的干扰，具有较高的敏感性和特异性。与现有Y干扰素释放实验比较，在没有降低特 异性的情况下，能够明显地提高阳性检出率。此外本试剂价廉，操作简便，适用于在发展中 国家进行临床诊断和对高危人群进行筛查。
图1、图2分别为结核杆菌抗原Rvl985c和Rv3425的T细胞抗原表位分析。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。下列实施例中的实验方法，如无特别说 明，均为常规方法。实施例1 结核分枝杆菌特异性T细胞抗原表位的分析和筛选通过生物信息学的分析结合体外检测T细胞免疫反应来分析和筛选蛋白的T细胞抗原表位，具体流程如下1.通过生物信息学技术及相应数据库如ProPred，EpiPredict等，对RD2区蛋白 Rvl985c和RDll区蛋白Rv3425的T细胞抗原表位进行预测，同时分析其与不同HLA分型之 间的识别关系。2.结合生物信息学分析结果，以Overlap (重叠序列)的方法设计覆盖Rvl985c和 Rv3425蛋白氨基酸序列的多肽。每条多肽含22-25个氨基酸，相邻两条多肽之间含9或10 个氨基酸重复序列。多肽由固相合成仪合成。3.收集临床血液标本，包括结核感染者和BCG接种的健康对照两组人群。同时对 每个受试者，均用SSP (Sequence Specific Primers)方法进行HLA分型，以确定T细胞表 位在不同HLA分型个体中的识别率。
4.以一种基于全血(Whole Blood)的Y -干扰素释放试验及T细胞增殖实验的 方法进行系统的抗原表位作图(Epitope Mapping)。并通过反复的临床验证实验，找到T 细胞抗原表位序列，其结果以外周血T细胞识别含抗原表位的多肽并被激活的反应率来表 示，如图1和图2所示。通过排除与BCG之间有交叉反应的抗原表位，并优选与在不同HLA 分型中识别率较高的抗原表位，得到SEQ ID N0. 1-10的多肽。其均包含有结核杆菌特异性 T细胞抗原表位的核心序列。实施例2 通过全血IFN- γ释放实验以ELISA方法检测IFN- γ以全血IFN- γ释放实验，分别在痰涂片或培养阳性的结核病人和BCG接种的健康 人群中进行检测。所述SEQ ID Nol-IO的多肽通过固相合成仪按合成仪说明书的实验条 件合成并通过HPLC分析和纯化。纯化后的多肽干粉以DMSO溶解，配置成10mg/ml的储存 液，"80度冻存。临用前以RPMI1640培养液稀释至使用浓度10ug/ml.实验对象结核感染者和健康人分别从重庆肺科医院病人及家属和上海复旦大学学生中组 织招募。结核感染者包括活动性结核患者和潜伏性结核感染者。从受测者中抽取的血液样 品经过肝素抗凝处理，所有试验均在采血后6小时内完成。三组人群入选标准如下24例肺结核患者痰涂片或痰培养阳性，临床表现与X线检查结果相符，且接受抗 结核治疗的时间少于三周。HIV检测阴性。25例健康对照接种过BCG疫苗，无发热、咳嗽等症状，近期无结核病人接触史的 健康人群。HIV检测阴性。10例潜伏性结核感染者(高危人群)无发烧、咳嗽等明显症状，胸片无异常，近期 与活动性肺结核病人有密切接触，如共同生活等，且T-SPOT试验阳性。实验方法方法一1.采集受试者肝素抗凝全血，以1 10的比例与RPMI1640混合后，加入96孔细 胞培养板内。2.每孔内分别加入单条多肽或多肽混合物作为刺激抗原，使每条多肽的终浓度为 10ug/ml，每孔内终体积为200ul。同时设立对照阳性对照PHA终浓度5ug/ml，PPD终浓度 5ug/ml，不加多肽的全血稀释液为阴性对照。多肽孔和阳性对照、阴性对照均做复孔。3. 37°C,5% C02培养箱中孵育5天后，收集培养液上清，-20°C冻存以备检测。
4. ELISA方法检测全血培养液上清中IFN- γ的释放量，具体步骤为在96孔酶标 板上包被人IFN-γ单克隆抗体过夜，BSA封闭后加入待测标本和已知浓度的IFN-Y标准 品，同时加入稀释后的生物素化抗体(Biotinylated antibody)，室温孵育2小时，洗板后 加入Str印tavidin-HRP，室温孵育20分钟，洗板3次后加入TMB显色液，室温避光孵育10 15分钟后加入终止液。应用酶标仪在450nm波长读取OD值。根据标准品做标准曲线后计 算样本中IFN-Y的释放量。5.结果判定在阳性对照孔反应正常的情况下(一般应彡100pg/ml)，多肽刺激孔 的IFN-Y释放量减去阴性对照孔大于15pg/ml则判定为阳性。方法二1.采集受试者肝素抗凝全血，并充分混勻2.将混勻后的全血直接加入24孔细胞培养板内，每孔Iml3.每孔内分别加入多肽(终浓度lOug/ml)，阳性对照PHA(终浓度5ug/ml)和阴 性对照(生理盐水)，并充分混勻 4. 37°C>5% C02培养箱中孵育16 24小时后，每孔收集200 300ul血浆，_20°C 冻存以备检测。5. ELISA方法检测IFN- γ的释放量及结果判定同方法一。结果显示，在34例结核感染者中，单条多肽的阳性反应率最高为59% (20/34)，最低为32% (11/34)；在25例BCG接种的健康对照中，每条多肽的阳性反应人数均低于1人，即诊断的 特异性均在90%以上。对多肽混合物来讲，其阳性反应率即诊断的敏感性为82% (28/34)， 特异性为96% (1/25)。表1为两组人群T细胞对SEQ ID NO. 1-10的多肽及其混合物产生 的应答。表 权利要求
1.一种检测结核分枝杆菌感染的试剂，其特征在于，其包含SEQ ID No. 1-10所代表的 多肽或其类似物。
2.根据权利要求1所述的检测结核分枝杆菌感染的试剂，其特征在于，所述多肽含有 结核分枝杆菌特异性的T细胞抗原表位，与BCG疫苗之间不存在交叉反应。
3.根据权利要求1所述的检测结核分枝杆菌感染的试剂，其特征在于，所述多肽或其 类似物，是人工合成的或是天然分离的。
4.一种体外检测结核分枝杆菌感染的方法，其特征在于，通过使用SEQ ID No. 1-10所 代表的多肽或其类似物，与结核杆菌宿主的T细胞相接触，并通过检测从T细胞分泌的细胞 因子，确定T细胞是否识别该多肽或类似物。
5.一种体外检测结核分枝杆菌感染的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的多 肽或其类似物，以及一种可视情况而使用的检测T细胞对多肽或其类似物识别的工具。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中的检测识别的工具包含IFN-Y抗体。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其检测方法包括ELISA、ELISP0T、细胞内细胞因子 染色、Immunoblotting和T细胞增殖试验。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其中的T细胞来源于血液、肺泡灌洗液、胸水、脑脊 液、淋巴结或其它包含T细胞的组织。
全文摘要
本发明属生物医学检验领域，具体涉及一种检测结核分枝杆菌感染的试剂、方法及应用。本发明通过筛选结核分枝杆菌特异性的T细胞抗原表位，公开了一种新型的结核杆菌检测试剂，其含有SEQ ID No.1-10所代表的多肽或其类似物。本方法是用单个或多个SEQ ID No.1-10多肽与感染结核杆菌个体的T细胞相接触，检测从T细胞释放的细胞因子。它能够有效地检测活动性结核或潜伏性结核感染，同时它不受接种BCG疫苗的干扰。本发明还公开了基于上述多肽及方法的诊断试剂盒和其他应用。本发明与现有技术γ干扰素释放试验相比较，在没有降低特异性的情况下，能明显提高检出率，具有较高的临床应用价值。
文档编号G01N33/68GK102004155SQ20101011066
公开日2011年4月6日 申请日期2010年2月12日 优先权日2010年2月12日
发明者张文宏, 王森, 王菲菲, 翁心华, 邵凌云, 金嘉琳, 陈嘉臻 申请人:复旦大学附属华山医院