专利名称：一种牛结核分枝杆菌检测用引物组、快速检测方法和检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种牛结核分枝杆菌检测用引物组、 快速检测方法和检测试剂盒。
技术背景由结核分支杆菌引起的肺结核，是非常严重的一种人畜共患传染病，通过 吸入含细菌的气溶胶或食用被细菌污染的奶制品而弓i起动物及人发病，而且很 难治愈。患牛常表现出短而促的干咳，日渐消瘦，贫而等现象，有的也会表现出体 表淋巴结肿大，如肩前、股后、腹股沟、颌下、咽和颈淋巴结。病情恶化时可 能会发生全身性结核。胸膜和腹膜发生结核病灶时出现所谓的"珍珠病"，胸部 听诊有摩擦音。多数病牛乳房会受侵害，表现出慢性乳房炎的症状。犊牛常发 生肠道结核，出现消化道不良、顽固性下痢、消瘦等症状，最后死亡。世界上很多国家包括我国都是采取"检疫-扑杀"的措施，病情较轻者可以 隔离治疗。如果处理不及时，对牛群及人类的自身安全和健康都会造成极大的 损害。因此对结核病疫情的密切关注己迫在眉睫，控制本病的传播和蔓延，及时 检疫，根除病牛。要做到这些必需加强对本病的研究以及建立一种适用于我国 牛结核病的临床检测方法，以达到控制和消灭结核病的目的。目前对牛结核分支杆菌的临床检测主要集中于提纯结核菌素(PPD)皮内试验，但不足之处在于对因感染其他分支杆菌致敏的动物没有特异性，不能判 断病情，且在那些因病情严重导致免疫反应低下的动物易出现假阴性。而当感 染副结核分支杆菌等环境分支杆菌时，则可能呈现假阳性反应。因此，寻求特 异敏感的诊断抗原以及制定一套严格统一的规范化操作标准，已成为牛结核病 诊断技术研究的重要方面。
等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测 技术上的长足进步，现己建立起来的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)具有很多的优越性，LAMP主要是利用4种 不同的特异性引物(引物F3、引物B3、引物FIP和引物BIP)识别靶基因的 6个特定区段，在聚合酶和等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列，扩 增反应结束后，通常是采用染色剂对反应产物进行分析。LAMP中所用到的聚 合酶通常都选用具有链置换特性的DNA聚合酶，如Bst DNA聚合酶。对 LAMP来说，4种特异性引物的设计是其关键所在。
LAMP因其自身的优点，现已被用于病原微生物的检测和传染性疾病的诊 断。如严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)的检测、分支杆菌属检 测、腺病毒性结膜炎检测、真菌检测等，现尚未见有LAMP用于牛结核分枝 杆菌检测的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种根据环介导等温扩增技 术设计的，对牛结核分枝杆菌具有高特异性的牛结核分枝杆菌检测用引物组。
本发明的另一个目的在于提供一种利用上述引物组对牛结核分枝杆菌进 行高效、高特异性的快速检测方法。本发明的另一个目的在于提供一种利用上述快速检测方法对牛结核分枝 杆菌进行检测的试剂盒。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的一、 本发明的牛结核分枝杆菌检测用引物组，是基于环介导等温扩增技术， 根据己公开的牛结核分枝杆菌基因序列，选取牛结核分枝杆菌基因的特异性序 列，然后分析设计出的，能专一性鉴别牛结核分枝杆菌的特异性引物组，通过 PCR来鉴定牛结核分枝杆菌基因，该引物组包含如下四条引物外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； 内引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示； 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。本发明的牛结核分枝杆菌检测用引物组除上述4条引物外，还可多增加1 对环状引物环状引物LF，其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示； 环状引物LB，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。上述环状引物LF和LB可以结合于LAMP反应生成的哑铃状产物的环状 部位，因此环状引物的增加使得整个引物组多了2个耙基因识别区域，提高了 引物组的特异度。二、 本发明的快速检测方法，是利用上述引物组，对牛结核分歧杆菌进行 高效和高特异性的检测，其具体步骤如下(1) 样品处理处理待测样品并采用本领域的常规做法提取样品的DNA;(2) 环介导等温扩增技术反应过程采用人工合成的引物组对样品DNA进行LAMP反应，扩增牛结核分枝杆菌的特异性片段；
(3)反应后处理LAMP扩增反应结束后，向LAMP扩增体系中加入显 色剂，根据所观察的颜色判断结果。
上述歩骤(1)中，待测样品通常是选择痰液棉拭子或血液样品。
上述步骤(2)中，所述人工合成的引物组，包含如下四条引物外引物
F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQID NO:2所示；内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；内引物BIP， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
上述步骤(2)中，LAMP的反应体系采用本领域技术人员进行LAMP反应 时常用的反应体系，如LAMP反应一般都包含BWDNA聚合酶、Ssf DNA聚合 酶缓冲液、25mmol4iLMgS04、 5nmol4iL甜菜碱和4种dNTP等，可参考教科书 以及LAMP试剂盒中的反应体系配制，均可实现本发明。
上述步骤(2)中，LAMP反应的反应条件可采用本领域人员操作LAMP 反应时的常规反应条件，优选恒温反应温度为60 63"C，恒温反应时间为45 60min， 80°C 2 10min终止反应。
上述步骤(3)中，显色剂可选择任何一种常用的荧光染料，优选SYBR Green I或EvaGreen。
上述步骤(3)中，当荧光染色剂加入反应液后不变色，则说明为阴性， 如果变色则为阳性，以SYBR Green I为例，SYBR Green I为橙色，若SYBR Green I加入到LAMP反应液后依然显橙色，则说明待测样品中不含有牛结核分枝杆 菌，若SYBR Green I加入到LAMP反应液后变成绿色，则说明待测样品中含有 牛结核分枝杆菌。上述步骤(2)中，引物组还可以包含一对环状引物环状引物LF，其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；环状引物LB,其核苷酸序列如SEQ ID NO:6 所示。环状引物LF和LB可以结合于LAMP反应生成的哑铃状产物的环状部 位，同时启动DNA链置换反应，生成一系列核酸结构，从而有效提高LAMP 的反应速度和效率。三、本发明的检测试剂盒，是利用上述快速检测方法来对待测样品是否含 有牛结核分枝杆菌进行检测的，该试剂盒包含本发明的牛结核分枝杆菌检测用 引物组(外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示；外引物B3，其核苷 酸序列如SEQ ID NO:2所示；内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示)和阳性对照品(牛结核分枝 杆菌基因组DNA)，该检测试剂盒使用时，将待测样品DNA与引物组进行常 规的LAMP反应扩增目的片段，可优选在63 65'C的恒温条件，反应时间为 45 60min，然后于80°C 2 10min终止反应。扩增产物后用显色剂染色，将染 色结果和阳性对照组的染色结果进行比较，从而判断待测样品是否含有牛结核 分枝杆菌。上述检测试剂盒还包含环状引物LF，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示 和环状引物LB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。上述检测试剂盒还可以包含^WDNA聚合酶、显色剂和LAMP反应液，所 述显色剂可选择任何一种常用的荧光染料，优选SYBR Green I或EvaGreen，所 述LAMP反应液可参考本领域人员进行LAMP反应时常用的反应液配方，如 LAMP反应液可含有内引物BIP和FIP 35~45 pmol尔L 、夕卜弓I物F3和B3 4 6pmol/VL、环状引物LF和LB 15~25 pmol/^iL、 MgS04 20 30mmol/|_iL、甜菜碱4 7nmol/^L、 4个dNTP 20 30mmol/fiL和10体积。/。 Sw DNA聚合酶缓冲液 (10x)，所述5W DNA聚合酶缓冲液(10x)含200 mM Tris-HCl (pH 8.8)、 100mMKCl、00mM (NH4) 2S04、 20 mM MgS04和0.1体积％ Triton X-100。
上述检测试剂盒使用时可按照如下步骤操作
(1) 处理待测样品，提取样品的DNA;
(2) 采用所述试剂盒中的引物对样品DNA进行环介导等温扩增反应，扩 增牛转核分枝杆菌的特异性片段；
(3) 向上述环介导等温扩增反应体系和阳性对照组中分别加入荧光染色 剂，观察颜色变化，如果样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。选 择染色剂S1^R Oew/为例，Sl"5i Oee"/为橙色，加入到反应体系和阳 性对照组后，阳性对照组中的颜色变为绿色，如果反应体系的颜色还是橙色那 么就说明待测样品中没有感染牛结核分支杆菌，如果反应体系的颜色变成和阳 性对照组一样的绿色，就说明待测样品感染了牛结核分枝杆菌。
为了检测时更加迅速方便，本发明的检测试剂盒除了上述4条引物、Bst DNA聚合酶、荧光染色剂、阳性对照液和LAMP反应液外，还可以包含样品 DNA提取液。所述样品DNA提取液，是提取待测样品(如痰液棉拭子或血液 样品等)中的DNA，其提取液的配制可参考常规的DNA提取液的配制方法， 并可根据不同待测样品进行稍微的改动。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
l.本发明根据已公开的牛结核分枝杆菌基因序列，选取牛结核分枝杆菌基 因的特异性序列，然后分析设计出牛结核分枝杆菌引物组的，具有高特异性， 能够准确且专一性地鉴别牛结核分枝杆菌；2.本发明的引物组在原有4条引物的基础上，增加l对环状引物，可以有效地縮短检测反应时间和增加反应的特异度，增加了 2个靶基因识别区域；3.本发明的快速检测方法可快速高效扩增待测样品，整个扩增在不到lh即可完成，且产率高，所使用的牛结核分枝杆菌引物组特异性高，可大大提高其扩增效率，扩增时间在原来的基础上减少1/3~1/2，使用环状引物可以在现 有的基础上縮短1/3 1/2的时间；4. 本发明的快速检测方法只需一个恒定温度就能扩增反应，且灵敏度高，扩增模板仅需IO拷贝或更少；5. 本发明的快速检测方法多采用一套环状引物，从而有效地提高了 LAMP 的反应速度和效率；6. 本发明的检测试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断 靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；7. 本发明的检测试剂盒鉴定简便，通过荧光染色剂的颜色变化，可通过肉 眼观察鉴定，且阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述，但并不对本发明做任何限定。实施例l牛结核分枝杆菌基因的快速检测本实施例采用牛的痰液棉拭子作为检测样品，其具体检测方法包括如下步骤1、处理待检样品，制取样品的DNA; (1)准备新鲜牛的痰液棉拭待用；(2)材料准备 A.待检样品的处理
痰液棉拭子的处理
将痰液棉拭子中加适量约0.5ml灭菌的0.9°/。生理盐水至于1.5ml离心管 中，放入60。C以上水浴锅或隔热装置中加热30min以上，摇匀直接可作为模 板使用。
2、环介导等温扩增(LAMP)反应
(1) 人工合成牛结核分枝杆菌检测用引物组，该引物组包含如下六条引物 外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示；
外引物B3，其核苷酸序列如SEQIDN0:2所示； 内引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示； 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示； 环状引物LF，其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示； 环状引物LB，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。
(2) LAMP反应
LAMP反应体系如表1所示，表1中的引物BIP、 FIP、 F3、 B3、 LoopF 和LoopB为上述引物组的6条引物。表1LAMP反应体系试剂体积(或浓度)BstDNA聚合酶(8U/nL)1^1BstDNA聚合酶缓冲液(10 x)2.5|ilDNA样品MgS04 (25mmo/VL)舌甘菜碱(5|imol/|jL)一dNTP (25mmol/|iL)BIP &FIP40 pmol/pLF3&B35 pmol/jiLLF&LB20 pmol/|_iLH20up to 25|iLLAMP反应条件为63。C恒温水浴60min， 80°C 2min，终止反应。(3)反应后处理向上述LAMP反应液中加入l[iL SF^ C^ee" /，计时3 5min后观察显 色结果，5T^/ Oeew/的颜色为橙色，当加入本实施例样品LAMP反应液后 颜色变为绿色，说明本实施例样品含有牛结核分枝杆菌。同时采用Real-time PCR对本实施例提取的样品DNA进行检测，检测结 果为样品中含有牛结核分枝杆菌，这一结果和本实施例的结果相吻合。实施例2检测试剂盒快速检测牛结核分枝杆菌基因本实施例采用检测试剂盒对牛结核分枝杆菌进行快速检测，检测试剂盒由 牛结核分枝杆菌检测用引物组、阳性对照品、显色齐IJ、^WDNA聚合酶和LAMP反应液组成，五种液体分别置于不同容器中，其中
a. 牛结核分枝杆菌检测用引物组由如下六条引物组成 外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDN0:1所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； 内引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示； 内引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示； 环状引物LF，其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示； 环状引物LB，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；
b. fiWDNA聚合酶8U;
c. 阳性对照组为牛结核分枝杆菌基因组DNA;
d. 显色剂为Syfi/ GVeew/;
e. LAMP反应液含有内引物BIP和FIP 40 pmol:L 、夕卜弓i物F3和B3 5pmol/(iL、环状引物LF和LB 20 pmol/nL、MgSC>4 25mmol/pL、甜菜碱5[xmol/iiL、 4个dNTP25mmol/iiL和10体积。/。fiWDNA聚合酶缓冲液(10x)，所述^^DNA 聚合酶缓冲液(10 x)含200mMTris-HCl(pH8.8)、100mMKCl、 100mM(NH4) 2S04 、 20 mM MgS04和0.1体积％ Triton X-100 。
本实施例的检测步骤如下 (1)样品处理
准备待检样品牛血液样品(-70°C低温冰箱保存)。
血液样品DNA提取采取血液2 3mL至预先加有EDTA抗凝剂的试管 中，用生理盐水将血样洗3次，弃上清，留沉淀备用；将血样的沉淀用含100mg/L 蛋白酶K的0.5% SDS， 100mmol/L Tris-HC1， lmmol/L EDTA， pH8.0， 50'C水浴消化3h;经1次酚和2次氯仿-异戊醇抽提后，往水相中加入1/10体积3mol/L醋酸钠，无水乙醇沉淀2h或沉淀过夜，空气干燥，重悬在双蒸水中， -20'C保存。(2) LAMP反应向反应管巾加入上述样品DNA2pL， BstDNA聚合酶lpl， LAMP反应 液22pL， 6(TC水浴45分钟，80°C 10min终止反应。 (3)反应后处理向上述反应液和阳性对照品中分别加入显色剂Si^i GVeew/，显色剂为 橙色，加入到阳性对照组后变为绿色，而加入到样品反应液后依然为橙色，由 此说明本实施例的样品中不含有牛结核分枝杆菌。同时采用Real-time PCR对本实施例提取的样品DNA进行检测，检测结 果为样品中不含有牛结核分枝杆菌，这一结果和本实施例的结果相吻合。实施例1和实施例2的检测结果，均与相应的传统荧光定量PCR结果具 有一致性，说明本发明的方法可以准确检测样品中是否含有牛结核分枝杆菌。一种牛结核分枝杆菌检测用引物组、快速检测方法和检测试剂盒序列表 SEQUENCE LISTING
<110>华南农业大学
<120> —种牛结核分枝杆菌检测用引物组、快速检测方法和检测试剂盒
<130>
<160> 6
〈170〉 Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 18
〈212〉 DNA
<213〉 人工合成
<400〉 1
ggcttccaac aacccgat 18
<210> 2
<211〉 18
<212> 腿
<213〉 人工合成
〈400〉 2
ggtcaggatg ctgctgag 18
<210> 3
〈211〉 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gtactcgccg ccgttgaggg tcagtaccct gacctcgg 38
<210〉 4
<211> 38
<212> DNA
<213〉 人工合成
<400〉 4
accgttttcg cccccacctt ggcgtcagtc ttgagttg 38
<210> 5
〈211> 20
<212> DNA
<213〉 人工合成
<400> 5
tcgaccagat tcacatccgg 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA <213>人工合成
<400> 6
aacgccgcat tcgacaag 18
权利要求
1、一种牛结核分枝杆菌检测用引物组，其特征在于该引物组包含如下四条引物外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示；内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示；内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO4所示。
2、 根据权利要求1所述引物组，其特征在于该引物组还包含一对环状引物环状引物LF，其核苷酸序列如SEQIDNO.'5所示； 环状引物LB，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。
3、 一种快速检测方法，其特征在于该方法是采用权利要求1所述引物组， 对待测样品DNA进行LAMP反应，反应结束后向反应液中加入显色剂，判断 显色结果。
4、 一种快速检测方法，其特征在于该方法是采用权利要求2所述引物组， 对待测样品DNA进行LAMP反应，反应结束后向反应液中加入显色剂，判断 显色结果。
5、 根据权利要求3或4所述方法，其特征在于所述LAMP反应的反应温 度为60 63。C，反应时间为45 60min， 80°C 2~10min终止反应。
6、 根据权利要求3或4所述方法，其特征在于所述显色剂为SYBR Green I或EvaGreen。
7、 一种检测试剂盒，其特征在于该检测试剂盒包含权利要求1或2所述 弓I物组和阳性对照品，所述阳性对照品为牛结核分枝杆菌基因组DNA。
8、 根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于该试剂盒还包含SWDNA聚 合酶、显色剂和LAMP反应液。
9、 根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于所述LAMP反应液含有内引 物BIP和FIP 35~45pmol/pL、外引物F3和B3 4 6pmol4iL、环状引物LF和 LB 15 25pmol/^L、 MgS04 20 30mmol/pL、甜菜碱4 7(imol/(iL、 4个dNTP 20~30mmol/^iL和10体积。/。10x SwDNA聚合酶缓冲液，所述10x^^DNA聚 合酶缓冲液含200mMpH 8.8的Tris-HCl、 100mMKCl、 100mM (NHU) 2S04、 20mM MgS04和0.1体积。/。Triton X-IOO。
全文摘要
本发明公开一种牛结核分枝杆菌检测用引物组、快速检测方法和检测试剂盒，该引物组是基于环介导等温扩增技术，根据牛结核分枝杆菌基因的特异性序列设计而得，包含核苷酸序列如SEQ ID NO1～4所示引物，对牛结核分枝杆菌具有高特异性。本发明的引物组中还包含一对核苷酸序列如SEQ IDNO5～6所示的环状引物，环状引物可结合于LAMP反应产物的环状部位，提高引物特异性，同时有效提高LAMP的反应速度和效率。本发明的快速检测方法是利用上述引物组对待测样品DNA进行LAMP反应，通过显色结果判断样品中是否含有牛结核分枝杆菌。本发明还根据上述快速检测方法设计出检测试剂盒，可对待测样品进行快速准确专一性地鉴别。
文档编号C12Q1/68GK101575640SQ200910037858
公开日2009年11月11日 申请日期2009年3月12日 优先权日2009年3月12日
发明者君 张, 李守军 申请人:华南农业大学