专利名称：一对鹅源性成分pcr检测用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物物种和动物源性成分鉴定技术领域，具体涉及一种用于检测鹅源性成分的检测方法，尤其涉及一对用于检测鹅细胞线粒体核苷酸序列的引物。
背景技术：
鉴别检测畜、禽源性成分技术是肉食品和饲料出入境海关、贸易、检验检疫中关键定性技术，涉及到肉食品加工业、畜牧养殖业、饲料业、检验检疫部门及其相关管理部门等领域。但是对于鹅的品种鉴定，以及产品中是否含有鹅源性成分还无快速、准确、可靠的检测方法。利用本发明引物进行的PCR扩增目的片段是线粒体DNA序列。线粒体DNA是高等动物唯一的核外遗传物质，是一个比较理想的用于物种鉴别检测的靶基因序列，其主要原因是(1)在所有组织细胞中均含有大量的线粒体，可以获得大量的mtDNA，mtDNA在不同的物种间具有高度的变异性；每个动物细胞中存在许多拷贝的线粒体基因组，在采取相同体积的DNA样品进行PCR检测时，线粒体基因组的模板数大大高于细胞核基因组的模板数，这就大大提高了 PCR检测的灵敏度。0)mtDNA主要以编码序列构成，种内的异质基因很少。不同种类的动物线粒体基因组序列虽然高度同源，存在高度保守区域，但也存在一定的变异区域。
发明内容
本发明的目的在于提供一对检测鹅源性成分的引物。以解决准确、快速、可靠的用 PCR技术鉴定鹅源性成分。本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现1.设计引物用于检测鹅源性成分的引物是根据线粒体DNA中高度保守的D-Loop 区序列进行设计，具体引物序列如下上游引物F 5，-GTGGCTATTCCCAGTGAT-3，；下游引物R 5，-TATTTGGAAGTGGTGGGT-3，。2.提取样品DNA 采用氯仿抽提法或商业DNA提取试剂盒提取样品DNA。3.采用步骤1设计的引物进行PCR扩增PCR反应体系为25yL，包括2. 5μ L 10 X PCRBuffer (含 Mg2+20mmol/L)，3 μ L dNTPs (2. 5mmol/L)，1 μ LTaq 酶 QU/ μ L)，上下游引物F/R各3 μ L (终浓度为1. 2 μ Μ)，DNA模板2 μ L，超纯水补至25 μ L。可采用商业化的 PCR 反应母液。PCR 反应程序为预变性 94°C 5min ；然后 94°C 50sec, 65°C 40sec, 72°C 40sec 循环35次；72°C :3min。反应完成后在4°C下保存。4.电泳检测PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。若动物产品和饲料中含有鹅源性成分，则在电泳图304bp位置处出现扩增目的条带。本发明的有益效果是，对活动物、食用性动物产品、非食用性动物产品、动物源性饲料及饲料添加剂等进行品种鉴定。利用本发明的引物采用PCR方法可以有效检出动物产品和饲料中的鹅源性成分，并进行鉴别检测，其扩增目的条带长度为304bp，检测最低限为 0. 01%。
图1鹅引物特异性PCR检测电泳中M.Marker 2000 ； 1.鹅、2.火鸡、3.鸭、4.鹌鹑、5.鸽、6.鸵鸟、7.鸡、8.马、 9.牛、10.羊、11.猪、12.狗、13.驴、14.猫、15.鱼；16.空白对照图2鹅引物灵敏度PCR检测电泳中 M :marker DL2000 ;1 :100% (鹅 DNA) ;2 :50% ;3 ；4 5% ；5 1% ；6 0. 1% ；7 0. 01% ；8 空白
具体实施例方式以下据所示最佳实施例对本发明作进一步详述。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。1.引物的设计根据NCBI中已经发表的鹅线粒体基因组序列(登录号为 EU571957)在D-Loop区设计一对引物，序列如下上游引物F 5，-GTGGCTATTCCCAGTGAT-3，；
下游引物 R 5，-TATTTGGAAGTGGTGGGT-3，。2.样品总DNA的提取采用氯仿抽提法或商业DNA提取试剂盒，提取鹅、火鸡、鸭、鹌鹑、鸵鸟、鸽、鸡、马、 牛、羊、猪、驴、狗、猫、鱼的基因组DNA，提取的基因组DNA均经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD26tZOD28tl值均为1. 8左右，说明DNA纯度较高符合PCR扩增要求。3.鹅源性成分PCR扩增利用步骤1设计的特异性引物，以鹅DNA等为模板进行PCR扩增。3. IPCR 反应体系为 25 μ L,包括 2. 5 μ L IOXPCR Buffer (含 Mg2+20mmol/L)，3 μ L dNTPs (2. 5mmol/L)，1 μ LTaq 酶(2U/ μ L)，上下游引物 F/R 各 3 μ L (终浓度为 1. 2 μ Μ), DNA 模板2 μ L，超纯水补至25 μ L。可采用商业化的PCR反应母液。3. 2PCR 反应程序为预变性 94°C 5min ；然后 94°C 50sec，65°C 40sec，72°C 40sec 循环35次；72°C :3min。反应完成后在4°C下保存。4.电泳检测PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。5.引物的特异性验证利用所设计鉴别检测鹅源性成分的特异性引物，分别以鹅、火鸡、鸭、鹌鹑、鸵鸟、 鸽、鸡、马、牛、羊、猪、驴、狗、猫、鱼的总DNA为模板，按上述3进行PCR反应，验证引物的特异性。经电泳检测，结果如图1所示，1号样品在304bp位置处出现目的扩增条带，其它样品没有鹅源性成分DNA，则无目的扩增条带，显示上述引物有良好的特异性。6. PCR的灵敏度验证将研磨成粉末的鹅肉骨粉样品用鱼肉粉末稀释(100g/100g)，至鹅成分样品含量分别为 100. 00,50. 00、10. 00、1. 00,0. 10,0. 01g/100g，提取 DNA，按上述 3 进行 PCR 反应，经电泳检测结果如图2。可知其检测低限至少可达0.01%纯鹅肉样DNA浓度，该引物的灵敏度可达0.01%纯鹅肉样品。
权利要求
1. 一对用于检测鹅源性成分的引物，其特征在于所述的引物序列包括 上游引物 F :5’ -GTGGCTATTCCCAGTGAT-3，； 下游引物 R :5，-TATTTGGAAGTGGTGGGT-3，。
全文摘要
本发明涉及动物物种和动物源性成分鉴定技术领域，具体涉及一种用于检测鹅源性成分的检测方法，尤其涉及一对用于检测鹅细胞线粒体核苷酸序列的引物。本发明旨在鉴定饲料、食品等产品中是否含有鹅源性成分。通过设计特异性扩增引物，利用PCR技术检测遗传上相对独立，没有重复序列，生物个体内无组织特异性的线粒体DNA，建立了鹅源性成分PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定鹅源性成分的目的。
文档编号C12Q1/68GK102337337SQ201110290480
公开日2012年2月1日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者刘建利, 卢体康, 吕建强, 宗卉, 曹琛福, 汪燕玲, 秦智锋, 花群义, 陶虹 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心