专利名称：一种应用同源参照引物和同源参照模板的定量聚合酶链式反应方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及定量聚合酶链式反应的方法及其应用。
背景技术：
聚合酶链式反应(PCR)是一种高效体外扩增特定基因片段的方法，由于PCR平坡现象和DNA凝胶电泳后用核酸染色剂检测定灵敏度较低，通常的终点法不能用于定量测定。基于荧光能量传递技术(fluorescence-resonance-energy-transfer，FRET)的和SYBR录I的各种实时荧光定量PCR方法使PCR技术出现了突破，但实时荧光定量PCR需要用昂贵的仪器，而且虽然荧光定量方法测定的范围相当宽但不能在小范围内作精确的测量。另一方面基础研究表明微小的基因表达量差异可能导致细胞活动的异常和引起疾病，测定基因表达量差异的临床诊断必然要求发展精确的基因定量方法，所以发展终点法定量PCR仍有重要的应用价值和广阔的前途。终点定量PCR方法包括双管外参照定量PCR、单管非竞争定量PCR和单管竞争定量PCR。外参照方法的引物和模板完全相同扩增效率相同又互不干扰，但二个反应管的背景核酸等截然不同使试验结果往往不可靠。单管非竞争定量PCR参照模板与目标基因的引物和模板均不相同或仅仅模板相同，引物的不同必导致扩增效率不同影响测定的可靠性。单管竞争定量PCR不仅制备参照模板的过程复杂，而且参照模板和目标基因共享一对引物。竞争是否发生和竞争的程度与扩增的阶段、二种模板的绝对浓度和相对浓度、引物的浓度、引物浓度与原始模板浓度比值等有关。这些因素的变化均会对定量测定结果的稳定性和可靠性带来负面影响。本发明是一种单管定量PCR，目标基因和参照模板的引物顺序和模板顺序均同源使扩增效率相同或非常接近，但目标基因和参照模板扩增应用各自的引物相互间不存在竞争，参照模板的制备过程也非常简单。
发明构思准确、稳定的单管终点法定量PCR要求目标基因和参照模板的扩增既要相似又必须不相同。单管非竞争定量PCR二者在引物上没有相似性或者在引物和模板上均无相似性。单管竞争定量PCR二者的模板相似但引物完全相同必存在相互干扰。理想的方法需要要扩增效率一致必须使引物和模板均相似，又需要互不干扰平行扩增必须使引物和模板不相同，本发明的同源引物和同源模板的方法能同时满足上述要求。扩增效率主要取决于引物的顺序和特性也与模板的顺序和特性有关。引物的扩增效率取决于引物的长度、3‘端碱基互补特性、引物发夹结构、引物GC％，引物解链温度和引物与模板的结合强度。二个长度相同的引物如他们的3’端前10个左右的碱基顺序完全相同，而其它部分碱基有G与C或A与T的相互置换就能满足上述要求。由于上述二个引物之间内有多个碱基错配，因而只能与自身匹配的模板退火而不会与对方不匹配的模板退火。
发明内容
发明所要解决的技术问题本发明提出了一种应用同源参照引物和同源参照模板的单管定量PCR方法，克服了现有各种终点定量PCR方法参照模板和目标基因扩增效率不同、目标基因扩增和参照模板扩增相互干扰及参照模板制备困难等缺陷。
技术方案完成定量PCR包括几个步骤，首先根据一般引物设计的原则用人工方法、引物设计软件自动搜索方法或二者相结合的方法针对目标基因选定目标基因引物对。目标扩增产物长度以通常的PCR扩增长度范围200至800碱基为宜。扩增产物太长不容易通过电泳将目标基因扩增产物与比他小几十个碱基的参照模板扩增产物分开。如扩增产物太短目标基因扩增产物顺序与比他小几十个碱基的参照模板扩增产物的顺序同源性相对减小、二种扩增产物特性的差别增大。扩增目标基因的引物确定后再设计制备参照模板的正反引物，该正反引物均由3‘端的基因专一部分和5’端延伸的非基因专一部分组成。基因专一部分的5’端的位置应距上述目标基因引物3‘端内侧的20-100个碱基。如距目标基因引物太远参照模板扩增产物与目标基因扩增产物的长度差别太大，使二种扩增产物顺序的相对同源性降低、二种扩增产物特性区别增大。如距目标基因引物太近，则二种扩增产物的长度相差太小难以通过电泳将二者完全分开。在合适的制备参照模板的引物的位置范围内，借助引物设计软件确定制备参照模板引物的基因专一部分的顺序。然后在正反引物的5‘端延伸一段寡核甙酸，延伸部分长度与扩增目标基因的正反引物的长度可以不同，但应以相同为原则和首选。然后对延伸部分的寡核甙酸的碱基进行变换，碱基变换方式可多样，但以只进行G和C的互换或A和T的互换为原则和首选，以使目标基因引物和参照模板引物的GC％一致。变换的要点是不改动延伸部分3’端数起的1-5至1-15个碱基，优选不改动1-8至1-12个碱基。如开始改动的碱基距3‘端太近会造成目标基因引物和参照模板引物之间的同源性太低、特性差异太大使扩增效率区别增大。如开始改动的碱基距3‘端太远则造成目标基因引物和参照模板引物之间的同源性太高、特性差异太小使二种引物均可能和非匹配的模板退火造成干扰。变换另一要点是被改动的碱基数为3-15个，优选5-10个碱基。合适的改动碱基数取决于第一个被改动碱基距3‘端的位置、被改动的碱基是连续还是间隔及被该动碱基的特性等。制备参照模板的引物确定后用通常的PCR试剂和方法以基因组DNA(PCR)或cDNA(RT-PCR)为模板进行扩增。PCR反应完成后进行凝胶电泳，切割目标扩增产物条带使之与残留的引物、原始模板DNA、引物二聚物和非专一扩增产物分开。测定目标扩增产物的浓度并调整、稀释到指定浓度后作为参照模板。扩增参照模板的引物顺序与制备参照模板引物的延伸部分的顺序完全相同。定量PCR操作按传统的单管非竞争定量PCR和单管竞争定量PCR方法，分5个左右反应管进行每个反应管加相同量的含目标基因的样品DNA和不同稀释度的已知量的参照模板DNA。PCR反应的程序、目标基因与参照模板扩增产物的分离、条带强度的测定及目标基因原始模板数量的计算均为常规方法。
有益效果1.本发明目标基因模板和参照模板同源，二者的引物也同源，克服了传统单管非竞争定量PCR目标基因和参照模板引物不同、扩增效率不一致的缺点。
2.本发明目标基因模板和参照模板的引物同源但不相同，各自平行扩增互不干扰，克服了传统单管竞争定量PCR目标基因和参照模板共享一对引物，相互竞争干扰带来的扩增不稳定性。
3.通过一次PCR扩增即完成参照模板的制备简单、方便、省时、省力。
具体实施例方式
实施例1实施例1以人神经激肽态2受体基因(TACR 2)(美国国家生物技术中心基因库编号NM_001058)为目标基因。先在引物设计软件Oligo6.0的辅助下选择目标基因正反引物，其顺序和特性示于表1和表3。目标基因引物顺序中含下划线碱基为与参照模板引物互为错配的碱基表1.实施例1引物顺序
目标基因引物确定后，在引物设计软件0ligo 6.0的辅助下在目标基因引物的内侧选择制备参照模板的引物，其顺序和特性示于表1和表2，制备参照模板引物顺序中含下划线和斜体部分为非基因专一顺序，该顺序与目标基因引物顺序同源、与参照引物顺序相同。扩增参照模板的引物顺序和特性示于表1和表3。扩增参照模板引物顺序中含下划线的碱基为与目标基因引物互为错配的碱基。实施例1中参照正引物与目标基因正引物的3‘端前11个碱基相同，引物中有7个G/C和A/T碱基置换；参照反引物与目标基因反引物的3’端前10个碱基相同，引物中有6个G/C和A/T碱基置换。
表2.实施例1制备参照模板引物的特性
表3.实施例1参照模板引物和目标基因引物特性比较
由表3可知目标基因引物和参照模板引物的各项特性几乎完全相同。
实施例1目标基因和参照模板扩增产物的特性示于表4表4.实施例1参照模板扩增产物和目标模板扩增产物特性比较
由表4可见目标基因和参照模板的扩增产物的基本特性除长度外也几乎完全相同。从表3可知正参照模板引物顺序与目标基因模板顺序之间及正目标引物顺序与参照模板顺序之间分别7个和6个碱基错配；这使得非匹配引物与模板之间的结合强度均小于250，最大高允许退火温度比匹配模板间的最高允许退火温度低约20℃。实施例1反应所用的Advantage2-PCR试剂盒及反转录试剂盒合均为BD ClonTech公司产品。反应所需的cDNA由人组织总RNA(1.0ug/ul)以Oligo(dT)为引物合成。制备参照模板时每100微升PCR反应液加c-DNA5微升。反应液引物终浓度为0.4uM。每管反应体积20微升。PCR反应首次变性92℃1分钟，循环变性92℃10秒，退火60-75℃30秒钟，延伸75℃30秒钟，反应35个循环。电泳证实在试验的退火温度60至75℃的范围内都得到专一的目标扩增产物，纯化扩增产物测定浓度并作一系列稀释作为参照模板。按模板和引物的匹配性和数量分9个组进行试验结果示于表5表5.实施例1试验结果
+代表310碱基目标基因扩增产物，φ代表233碱基参照模板扩增产物结果在试验的退火温度60-75℃范围内目标基因引物和参照模板引物均能和匹配模板退火形成专一的扩增产物，而与非匹配模板均不能完成扩增，说明在相当宽的退火温度范围内二者相互不干扰。据此可选择变性变性92℃10秒，退火和延伸72℃60秒钟条件完成定量检测试验实施例2实施例2以人beta肌动球蛋白基因(美国国家生物技术中心基因库编号BC0016045)为目标基因。引物设计方法与实施例1相同。先选择目标基因正反引物，其顺序和特性示于表6和表8。目标基因引物顺序中含下划线碱基为与参照模板引物互为错配的碱基表6.实施例2引物顺序
然后在目标基因引物的内侧选择制备参照模板的引物，其顺序和特性示于表6和表7，制备参照模板引物顺序中含下划线和斜体部分为非基因专一顺序，该顺序与目标基因引物顺序同源、与参照引物顺序相同。扩增参照模板的引物顺序和特性示于表6和表8。扩增参照模板引物顺序中含下划线的碱基为与目标基因引物互为错配的碱基。实施例2中参照正引物与目标基因正引物3‘端前6个碱基相同，引物中有4个G/C和A/T碱基置换；参照反引物与目标基因反引物3’端前5个碱基相同，引物中有4个G/C和A/T碱基置换。
表7.实施例2制备引物特性
表8.实施例2参照模板引物和目标基因引物特性比较
由表8可知目标基因引物和参照模板引物的各项特性几乎完全相同。
目标基因和参照模板扩增产物的特性示于表9
表9.实施例2参照模板扩增产物和目标模板扩增产物特性比较
由表9可见目标基因和参照模板的扩增产物的基本特性除长度外也几乎完全相同。表8表明正参照模板引物顺序与目标基因模板顺序之间及正目标引物顺序与参照模板顺序之间均有4个碱基错配，这使得非匹配引物与模板之间的结合强度均小于250，最大高允许退火温度比匹配模板间的最高允许退火温度低约20℃。实施例2反应所用试剂和条件与实施例1相同。PCR反应首次变性87℃1分钟，循环变性87℃10秒，退火62℃30秒钟，延伸72℃30秒钟或退火和延伸72℃60秒钟，反应30个循环。结果目标基因和目标模板组合或参照引物和参照模板组合，均能在退火温度为72℃的高温下完成扩增有电泳条带。反之，目标基因和参照模板组合或参照引物和目标模板组合即使退火温度62℃也不能完成扩增没有电泳条带。据此可选择变性87℃10秒，退火和延伸72℃60秒钟的条件完成定量检测试验实施例3实施例3也以人beta肌动球蛋白基因为目标基因。引物设计方法与实施例1相同。先选择目标基因正反引物，其顺序和特性示于表10和表12。目标基因引物顺序中含下划线碱基为与参照模板引物互为错配的碱基表10.实施例3引物顺序
然后在目标基因引物的内侧选择制备参照模板引物，其顺序和特性示于表10和表11，制备参照模板引物顺序中含下划线和斜体部分为非基因专一顺序，该顺序与目标基因引物顺序同源、与参照引物顺序相同。扩增参照模板的引物顺序和特性示于表10和表12。扩增参照模板引物顺序中含下划线的碱基为与目标基因引物互为错配的碱基。实施例3中参照正引物与目标基因正引物3‘端前11个碱基相同，引物中有9个G/C和A/T碱基置换；参照反引物与目标基因反引物3’端前14个碱基相问，引物中有14个G/C和A/T碱基置换。
表11.实施例3制备引物特性
表12.实施例3参照模板引物和目标基因引物特性比较
由表12可知目标基因引物和参照模板引物的各项特性几乎完全相同。
目标基因和参照模板扩增产物的特性示于表13表13.实施例3参照模板扩增产物和目标模板扩增产物特性比较
由表13可见目标基因和参照模板的扩增产物的基本特性除长度外也几乎完全相同。表12表明正参照模板引物顺序与目标基因模板顺序之间及正目标引物顺序与参照模板顺序之间分别有9个和14个碱基错配，这使得非匹配引物与模板之间的结合强度均小于260，最大高允许退火温度比匹配模板间的最高允许退火温度低20℃以上。实施例3反应所用试剂和条件与实施例2相同，结果目标基因和目标模板组合或参照引物和参照模板组合，均能在退火温度为72℃的高温下完成扩增有电泳条带。反之，目标基因和参照模板组合或参照引物和目标模板组合即使退火温度62℃也不能完成扩增没有电泳条带。据此可选择变性87℃10秒，退火和延伸72℃60秒钟的条件完成定量检测试验。
权利要求
1.一种应用同源参照引物和同源参照模板的定量聚合酶链式反应方法，由若干个反应管组成一组反应，每个反应管含相同量的含基因组DNA或cDNA的样品、不同稀释度的参照模板DNA、目标基因引物和参照引物各一对，PCR反应依次包括如下步骤(1)DNA模板变性解链；(2)引物与模板退火；(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；按步骤(1)-(3)循环进行扩增反应；其特征在于参照模板与目标基因模板顺序同源，目标基因引物和参照引物顺序同源而且均不与对方模板退火。
2.根据权利要求1所述的一种应用同源参照引物和同源参照模板的定量聚合酶链式反应方法，其特征在于所述的目标基因引物和参照模板引物长度相同。
3.根据权利要1所述的一种应用同源参照引物和同源参照模板的定量聚合酶链式反应方法，其特征在于所述的目标基因引物和参照模板引物的GC％相同。
4.根据权利要求1所述的一种应用同源参照引物和同源参照模板的定量聚合酶链式反应方法，其特征在于所述的目标基因引物和参照模板引物的3’端1-5至1-15个碱基完全相同。
5.根据权利要求1所述的一种应用同源参照引物和同源参照模板的定量聚合酶链式反应方法，其特征在于所述的目标基因引物和参照模板引物的3’端1-8至1-12个碱基完全相同。
6.根据权利要求1所述的一种应用同源参照引物和同源参照模板的定量聚合酶链式反应方法，其特征在于所述的目标基因引物和参照模板引物有3-15个碱基不同。
7.根据权利要求1至3所述的一种应用同源参照引物和同源参照模板的定量聚合酶链式反应方法，其特征在于所述的目标基因引物和参照模板引物有5-10个碱基不同。
全文摘要
一种单管内参照定量聚合酶链式反应和反转录聚合酶链式反应。目标基因模板顺序和参照模板顺序同源，前者扩增产物长度比后者略长。目标基因引物和参照模板引物顺序也同源，他们的3“端碱基顺序相同，引物3”端碱基互补特性相同，引物的长度相同，引物的GC％相同，引物的发夹结构相同或仅有微小差异，引物的解链温度和与模板的结合强度也相同或仅有微小差异，所以目标基因模板和参照模板的扩增效率相同或非常接近。但是目标基因引物和参照模板引物之间有多个碱基错配，在相当宽的退火温度范围内不与非匹配模板退火相互之间没有干扰。发明克服了传统单管非竞争定量PCR目标基因和参照模板扩增效率不同的缺点。又克服了传统竞争定量PCR制备参照模板过程复杂，在不同阶段引物竞争状态不同所造成的测定不稳定等缺点。
文档编号C12P19/00GK1880468SQ20051002672
公开日2006年12月20日 申请日期2005年6月14日 优先权日2005年6月14日
发明者徐定邦, 谢文凯 申请人:徐定邦, 徐文慧