Il-4检测引物、试剂盒和半定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞因子检测技术领域，具体涉及一种IL-4检测引物、试剂盒和半定 量检测方法。
【背景技术】
[0002] 细胞因子是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋 白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能。细胞因 子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子 等。其中，比较重要的有IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IFN-y、TNF-f3和神经白细胞素等，在细 胞间相互作用、免疫调节、造血以及炎症过程中起重要调节作用。
[0003] 已经有诸多的文献和研究成果表明，IL-4表达水平与多种疾病和机体免疫密切相 关。通过对IL-4表达水平的检测，可以利于很多必要信息的更早获取以及相关某些疾病的 早期诊断。而现有IL-4的检测中常使用免疫学测定法，比如使用率最高的ELISA试剂盒； 但是现有的这些检测的试剂盒或者方法，其检测针对的是IL-4分泌、吸附、消耗和降解后 的净含量，不是细胞因子产生过程中基因转录、翻译及翻译后调控机制提供必要的信息，也 不能反映细胞或组织内实时的细胞因子基因表达水平，所以检测的结果不能作为IL-4指 标实时定点检测真实情况。
【发明内容】
[0004] 本发明实施的目的在于克服现有的缺陷，提供一种能更真实和准确检测细胞或组 织内实时的IL-4表达水平的IL-4检测引物、试剂盒和半定量检测方法。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0006] 一种IL-4检测引物，包括具有序列表SEQ. ID. No. 1碱基序列的引物P1、具有序列 表SEQ. ID. No. 2碱基序列的引物P2。
[0007] 基于上述检测引物，本发明还提出包括上述引物的IL-4检测试剂盒。
[0008] 本发明的上述引物基于基因表达过程中编码IL-4的mRNA合成远先于分泌的 IL-4蛋白产物，且蛋白质的表达量的多少与对应编码的mRNA的量成线性正比的关系；通过 RT-PCR方式扩增对应编码的mRNA，再通过mRNA的量即可得到对应IL-4蛋白产物的量；其 检测的不是IL-4分泌、吸附、消耗和降解后的净含量，而是IL-4产生过程中基因转录、翻译 及翻译后调控机制的实时定点水平；其能更真实和准确反应细胞或组织内实时的IL-4表 达水平。
[0009] 本发明基于上述引物和试剂盒，进一步提出一种采用上述引物构建竞争性RT-PCR 进行IL-4半定量检测方法，包括如下步骤：
[0010] 获取IL-4对照组细胞和IL-4待测组细胞；
[0011] 提取所述IL-4对照组细胞的总RNA，并用具有序列表SEQ. ID. No. 1碱基序列的引 物P1和具有序列表SEQ. ID. No. 3碱基序列的竞争性引物P3进行RT-PCR，得到竞争模板；
[0012] 提取所述IL-4待测组细胞的总RNA，并进行反转录获得待测cDNA模板；
[0013] 将所述待测cDNA模板和竞争模板混合后，用具有序列表SEQ. ID. No. 1碱基序列的 引物P1和具有序列表SEQ. ID. No. 2碱基序列的引物P2进行PCR，得到靶序列扩增产物。
[0014] 上述方法的过程，通过引物平P1和引物P2扩增的IL-4cDNA靶片段长474bp，而用 引物P1和引物P3扩增的管家基因长454bp，比靶片段短22bp ;竞争模板与靶片段序列差异 小，在作竞争PCR时可将影响因素降至低水平，从而使检测结果更能反映样本的真实情况； 且所用的竞争模板与靶序列电泳位置接近，为判断RT-PCR产物电泳条带提供了较理想的 参照物，可避免对非特异性条带的误判通过测定电泳带的密度，即可对靶序列的扩增产物 进行定量，从而推知所测样本中相应mRNA的含量，更加接近真实的表达水平。
【具体实施方式】
[0015] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0016] 本发明实例提出一种IL-4检测引物，包括具有序列表SEQ. ID. No. 1碱基序列的引 物P1、具有序列表SEQ. ID. No. 2碱基序列的引物P2。
[0017] 本发明的上述检测的引物，与现有的免疫学测定法的方法和ELISA试剂盒的检测 内容上不同。本发明的立意是基于细胞中表达蛋白质时，基因表达过程中编码IL-4的mRNA 合成远先于分泌的IL-4蛋白产物，且蛋白质的表达量的多少与对应编码的mRNA的量成线 性正比的关系；所以本发明采用上述特异性的引物通过RT-PCR方式扩增对应编码的mRNA， 再通过mRNA的量即可得到对应IL-4蛋白产物的量。而且本发明的半定量检测引物和方 法，相比现有的检测方法和试剂盒，其能具有的优势在于其检测的不是IL-4分泌、吸附、消 耗和降解后的净含量，而是IL-4产生过程中基因转录、翻译及翻译后调控机制的实时定点 水平；其能反应细胞或组织内实时的IL-4表达水平。
[0018] 在上述IL-4检测引物中含有的是一组上下游引物，其中引物P1为上游引物、而引 物P2是下游引物，单一进行RT-PCR扩增，其扩增的结果在没有内参或者是对比的情况下， 单个的IL-4的mRNA不方便进行准确的定量。所以在上述基础上，本发明的上述IL-4检测 引物进一步包括具有序列表SEQ. ID. No. 3碱基序列的竞争性引物P3。
[0019] 该竞争性引物P3的设计是以P-actin(肌动蛋白）的基因设计的引物，其中需 要进一步仔细的说明的是0-actin基因是属于管家基因，在哺乳动物细胞表达中是由管 家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，且其产物是对维持细胞 基本生命活动所必需的，可以作为半定量中的比对参照物。在进行半定量RT-PCR时，选择 管家基因可以通过计算目的基因和内参的比值，得到基因表达的相对浓度，从而辅助判断 RT-PCR的整个体系和反应条件是否合适，以及PCR的结果情况。
[0020] 通过该竞争性引物P3的引物与上述引物P1共同组成引物对，同时扩增IL-4基因 片段（即靶序列）和0 -actin基因片段（内参序列），扩增过程中靶序列和竞争性序列均 用相同的引物对以相同的效率扩增，两序列的初始化比值在整个反应过程中保持不变，得 到竞争性的cDNA模板。然后再以该竞争性的cDNA模板分别用IL-4引物对和0 -actin引 物对进行单独扩增；通过0-actin蛋白mRNA扩增产量（扩增过程中0-actin的引物可 以自行设计，或者采用本发明下述设计的引物P4和P5)的结果，即可作为相对确定IL-4的 mRNA表达水平的对照，便于本发明IL-4检测中的定量分析。
[0021] 进一步在上述检测的引物的基础上，为了便于竞争性RT-PCR中0-actin蛋白 mRNA量的检测，进一步提出辅助用于0 -actin蛋白mRNA扩增的引物，包括具有序列表 SEQ. ID. No. 4碱基序列的引物P4、具有序列表SEQ. ID. No. 5碱基序列的引物P5。这一组引 物P4和引物P5组成的引物对是以上述构建的竞争性cDNA模板扩增0 -actin蛋白mRNA 进行检测的引物对，便于IL-4检测的分析参考和比对。
[0022] 当然，上述引物的特异性和扩增的稳定性，反复的经过BLEAST比对检测以及多次 的试验验证，稳定性和特异性比较好，能够达到检测的目的和半定量分析的要求。
[0023] 同时，本发明的上述引物对是基于RT-PCR和竞争性RT-PCR设计的引物，所以引物 对在使用过程中，技术人员根据领域的常规RT-PCR和竞争性RT-PCR的实施步骤进行即可。 其中，引物的信息如下表所示：
[0024]
[0026] 基于本发明的上述IL-4检测引物的提出，本发明进一步还提出一种IL-4半定量 检测试剂盒产品；本发明的试剂盒产品包括上述具有序列表SEQ. ID. No. 1碱基序列的引物 P1、以及具有序列表SEQ. ID. No. 2碱基序列的引物P2。该试剂盒实施的过程中其机理和理 由可以参见上述引物部分对应的描述，本部分