一种利用线粒体dna鉴别牛羊肉中猫肉的lamp检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中猫肉的LAMP检测方法，属于分子生 物学检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 近年来随着市场对牛羊肉的需求逐渐增加及价格快速上涨，一些不法商贩在利益 的驱动下，掺加其他廉价肉造假冒充牛羊肉。2012年以来，国内曝光了多起以猪肉、鸡肉、鸭 肉冒充牛羊肉的事件；更有甚者，在牛羊肉中还掺入病死的狗肉和猫肉。这种现象不仅扰乱 了经济秩序，而且严重危害人们身体健康。
[0003] 目前，用于动物源性成分检测的方法主要有常规PCR、荧光定量PCR等，但上述诊 断方法花费时间较长，而且判定结果需要借助精密仪器设备，难以在实际生产中普及应用。
【发明内容】
[0004] 为了解决采用常规PCR、荧光定量PCR法检测牛羊肉中掺入猫肉时所存在的上述 技术问题，本发明利用LAMP技术和动物线粒体DNA上细胞色素C氧化酶亚单位I (COX I ) 基因对猫肉进行鉴定，整个反应在恒温水浴锅中进行40min即可，而且可以通过在终产物 中加入染料的方法直接用肉眼观察结果。
[0005] 本发明的技术方案是： 一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中猫肉的LAMP检测方法， 以待测肉品的DNA作为模板、以MF3、MB3、MFIP、MBIP为引物构建LAMP检测体系；LAMP 检测体系于64°C恒温水浴中反应40min，反应结束后向反应液中加入1 uL荧光染料SYBR GREEN I ;若反应液变成绿色，说明待测肉品中存在猫肉；若为橘黄色，则待测肉品中不存 在猫肉； 所用引物如下： MF3: CACTTCCTAGGCCTGTCC，如 SEQ ID NO. 1 所示， MB3:ATGTGTGGTACGGAGGAGjnSEQIDN0.2K*， MFIP:GAAAGAGCCCATTGAGGAAATCGTAGACGTTATTCTGACTATCCAGAT，如 SEQ ID NO. 3 所示， MBIP:GTTTTCATAGTGTGAGAAGCTTTCGCAAGATTAGTTGTGGTTAGTTCT，如 SEQ ID NO. 4 所示； 所述LAMP检测体系，总体积为25uL ;其组成如下 10umol/L 的 MF3、MB3 各 0? 5uL，10umol/L 的 MFIP、MBIP 各 4uL，2. 5mmol/L 的 dNTP 4uL，50mmol/L 的 MgS04 2uL，5mol/L 的 Betaine2. 5uL，Bst DNA 聚合酶 luL，lOXThermo buffer 2. 5uL，模板2uL，余量为超纯水。
[0006] 本发明的检测方法与传统PCR相比，在普通恒温水浴锅中反应40 min即可完成， 而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果，能快速准确地鉴定出动物 源性成分；具备操作简便、对实验仪器要求较低、结果判定容易的优点。本发明无需借助于 大型的昂贵仪器设备，更适合于基层的现地检测，具有广阔的市场前景和较大的社会经济 效益。
[0007] 本发明选用线粒体DNA上细胞色素C氧化酶亚单位I (COX I )基因作为目的基 因；以MF3、MB3、MFIP、MBIP为引物，能将特异性地扩增猫肉COX I基因，从而将猫肉从羊 肉、牛肉中检测出来；且能够将其与狗、狐狸、貂等相近种属的肉区分开来；具备特异性高 的优点。另外，采用MF3、MB3、MFIP、MBIP为引物，其灵敏度高，所能检测到的最低浓度为 2X 10 4ng/uL ;因此，即使掺杂有微量猫肉也能被检测出来。
[0008] 本发明还提供了一种上述LAMP检测方法所用检测试剂，含有如下引物： MF3: CACTTCCTAGGCCTGTCC，如 SEQ ID NO. 1 所示， MB3:ATGTGTGGTACGGAGGAGjnSEQIDN0.2K*， MFIP:GAAAGAGCCCATTGAGGAAATCGTAGACGTTATTCTGACTATCCAGAT，如 SEQ ID NO. 3 所示， MBIP:GTTTTCATAGTGTGAGAAGCTTTCGCAAGATTAGTTGTGGTTAGTTCT，如 SEQ ID NO. 4 所示。
[0009] 本发明还提供了一种上述LAMP检测方法所用检测试剂盒，含有lOumol/L的MF3、 MB3 各 0? 5uL，10umol/L 的 MFIP、MBIP 各 4uL，2. 5mmol/L 的 dNTP 4uL，50mmol/L 的 MgS04 2uL，5mol/L 的 Betaine2. 5uL，Bst DNA 聚合酶 luL，10 X Thermo buffer 2. 5uL ; 其中： MF3: CACTTCCTAGGCCTGTCC，如 SEQ ID NO. 1 所示， MB3:ATGTGTGGTACGGAGGAGjnSEQIDN0.2K*， MFIP:GAAAGAGCCCATTGAGGAAATCGTAGACGTTATTCTGACTATCCAGAT，如 SEQ ID NO. 3 所示， MBIP:GTTTTCATAGTGTGAGAAGCTTTCGCAAGATTAGTTGTGGTTAGTTCT，如 SEQ ID NO. 4 所示。
【附图说明】
[0010] 图1为实施例1的检测结果图；从左向右顺序为：阳性对照，阴性对照，狗肉，猫 肉，貂肉，狐狸肉，牛肉，羊肉；结果显示：第1、4管为绿色，其余为橘黄色； 图2为PCR检测方法灵敏度示意图；从右向左顺序为：Marker，10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5 稀释度； 图3为LAMP检测方法灵敏度示意图；从左向右顺序为：Marker，10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5 稀释度。
【具体实施方式】
[0011] 下述实施例中：所用试剂除由生产厂家直接提供的以外，其它均为分析纯；水，如 果没有特别说明，为超纯水。
[0012] 实施例1设计引物 从GenBank中检索获得猫的COX I序列，并进行软件比对分析，确定序列的准确性；根 据上述序列利用PrimerExplore软件设计引物如下： MF3: CACTTCCTAGGCCTGTCC (如 SEQ ID NO. 1 所示）， MB3: ATGTGTGGTACGGAGGAG (如 SEQ ID 勵.2所示）， MFIP:GAAAGAGCCCATTGAGGAAATCGTAGACGTTATTCTGACTATCCAGAT(如 SEQ ID NO. 3 所示）， MBIP:GTTTTCATAGTGTGAGAAGCTTTCGCAAGATTAGTTGTGGTTAGTTCT(如 SEQ ID NO. 4 所示）。
[0013] 实施例2特异性实验 (1)提取DNA作为模板 严格无菌采集牛、羊、狗、猫、狐狸、貂的新鲜肌肉组织作为样品，然后采用酚氯仿提取 法分别提取组织中的DNA。分别以本实验室保存的含有猫肉COX I基因的阳性质粒（阳性对 照)，超纯水（阴性对照)，狗肉DNA，猫肉DNA，貂肉DNA，狐狸肉DNA，牛肉DNA，羊肉DNA为模 板建立LAMP反应体系；DNA模板浓度均为20ng/uL。
[0014] (2 ) LAMP反应体系的建立 通过摸索内外引物浓度比、dNTP浓度、反应温度、反应时间等建立的LAMP反应体系为 25 yL，其组成如下： 10umol/L 的 MF3、MB3 各 0? 5uL，10umol/L 的 MFIP、MBIP 各 4uL，2. 5mmol/L 的 dNTP 4uL，50mmol/L 的 MgS04 2uL，5mol/L 的 Betaine2. 5uL，Bst DNA 聚合酶 luL，lOXThermo buffer 2. 5uL，最低浓度为20ng/uL的模板2uL，余量为超纯水。
[0015] 其中，dNTP和1%304购自宝生物工程(大连)有限公司、Betaine购自美国Sigma公 司、Bst DNA 聚合酶（8U/ uL)和 lOXThermo buffer 购自美国 NEB 公司、SYBR GREEN I 核 酸染料购自北京Solarbio公司。
[0016] (3) LAMP 扩增反应 将上述LAMP反应体系(按照实施例1获取模板的顺序排列）同时置于64°C恒温水浴中 进行LAMP扩增40min;反应结束后加入luL荧光染料SYBRGREEN I ;反应液颜色依次为绿 色、橘黄色、橘黄色、绿色、橘黄色、橘黄色、橘黄色、橘黄色(如图1所示)。其中，橘黄色为阴 性结果，绿色为阳性结果。
[0017] 实施例3 从山东省内屠宰厂采集鲜牛肉样品30个，鲜羊肉样品30个；从山东省动物医院采集 鲜猫肉样品10个；采用实例1的方法提取样品的DNA作为模板、建立LAMP反应体系、进行 LAMP扩增反应，检测结果如表1所示： 表1 _
[0018] 由实施例2和3可以得出，实施例1的引物能特异性扩增猫肉DNA，只有模板中含 有猫肉DNA时，向LAMP反应产物加入荧光染料SYBR GREEN I后的反应液才显示绿色；而 模板中含有其他任意非猫肉（牛、羊、貂、狐狸、狗） DNA时，向LAMP反应产物加入荧光染料SYBR GREEN I后的反应液显示橘黄色。因此， 以实施例1的引物，采用上述LAMP反应体系，以荧光染料SYBR GREEN I作为显色剂，能够 将猫肉与其他动物(牛、羊、貂、狐狸、狗）的肉区分开来；从而能用于鉴别肉品中是否含有猫 肉。
[0019] 实施例4灵敏度实验 将实施例1的阳性对照所用DNA以10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5的稀释度进行稀释，分别以 稀释后的DNA为模板分别进行LAMP和PCR，比较两种检测方法的灵敏度。结果显示：LAMP 法的扩增灵敏度比普通PCR法要高。普通PCR可以检测到第3个稀释梯度(如图2所示)， 而LAMP法在第4个稀释梯度仍可以检测到(如图3所示)。
【主权项】
1. 一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中猫肉的LAMP检测方法，其特征在于， 以待测肉品的DNA作为模板、以MF3、MB3、MFIP、MBIP为引物构建LAMP检测体系；LAMP 检测体系于64°C恒温水浴中反应40min，反应结束后向反应液中加入I uL荧光染料SYBR GREENI;若反应液变成绿色，说明待测肉品中存在猫肉；若为橘黄色，则待测肉品中不存 在猫肉； 所用引物如下： MF3: CACTTCCTAGGCCTGTCC，如 SEQ ID NO. 1 所示， MB3:ATGTGTGGTACGGAGGAGjnSEQIDN0.2K*， MFIP:GAAAGAGCCCATTGAGGAAATCGTAGACGTTATTCTGACTATCCAGAT，如 SEQ ID NO. 3 所示， MBIP:GTTTTCATAGTGTGAGAAGCTTTCGCAAGATTAGTTGTGGTTAGTTCT，如 SEQ ID NO. 4 所示； 所述LAMP检测体系，总体积为25uL ;其组成如下 lOumol/L 的 MF3、MB3 各 0? 5uL，lOumol/L 的 MFIP、MBIP 各 4uL，2. 5mmol/L 的 dNTP 4uL，50mmol/L 的 MgSO4 2uL，5mol/L 的 Betaine2. 5uL，Bst DNA 聚合酶 luL，IOXThermo buffer 2. 5uL，模板2uL，余量为超纯水。2. -种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中猫肉的LAMP检测方法所用检测试剂，含有如下引 物： MF3: CACTTCCTAGGCCTGTCC，如 SEQ ID NO. 1 所示， MB3:ATGTGTGGTACGGAGGAGjnSEQIDN0.2K*， MFIP:GAAAGAGCCCATTGAGGAAATCGTAGACGTTATTCTGACTATCCAGAT，如 SEQ ID NO. 3 所示， MBIP:GTTTTCATAGTGTGAGAAGCTTTCGCAAGATTAGTTGTGGTTAGTTCT，如 SEQ ID NO. 4 所示。3. -种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中猫肉的LAMP检测方法所用检测试剂盒，含有 lOumol/L 的 MF3、MB3 各 0? 5uL，lOumol/L 的 MFIP、MBIP 各 4uL，2. 5mmol/L 的 dNTP 4uL， 50mmol/L 的 MgSO4 2uL，5mol/L 的 Betaine2. 5uL，Bst DNA 聚合酶 luL，10 X Thermo buffer 2. 5uL ； 其中： MF3: CACTTCCTAGGCCTGTCC，如 SEQ ID NO. I 所示， MB3:ATGTGTGGTACGGAGGAGjnSEQIDN0.2K*， MFIP:GAAAGAGCCCATTGAGGAAATCGTAGACGTTATTCTGACTATCCAGAT，如 SEQ ID NO. 3 所示， MBIP:GTTTTCATAGTGTGAGAAGCTTTCGCAAGATTAGTTGTGGTTAGTTCT，如 SEQ ID NO. 4 所示。
【专利摘要】本发明涉及一种利用线粒体DNA鉴别牛羊肉中猫肉的LAMP检测方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明的检测方法以待测肉品的DNA作为模板、以MF3、MB3、MFIP、MBIP为引物构建LAMP检测体系；LAMP检测体系于64℃恒温水浴中LAMP反应40min，反应结束后向反应液中加入1uL荧光染料SYBR？GREEN？Ⅰ；若反应液变成绿色，说明待测肉品中存在猫肉；若为橘黄色，则待测肉品中不存在猫肉。本发明的检测方法与传统PCR相比，在普通恒温水浴锅中反应40min即可完成，而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果，能快速准确地鉴定出动物源性成分；具备操作简便、对实验仪器要求较低、结果判定容易的优点。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105039540
【申请号】CN201510411176
【发明人】刘少宁, 陈智, 高迎春, 张琦, 尹菲菲
【申请人】山东省兽药质量检验所
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月14日