一种用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参的制作方法

一种用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参，具体涉及一种 用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参miR-30e/a，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 长度在21-23bp的单链miRNA分子，能够以部分互补的方式革E1向结合于mRNA非翻 译区，引导其降解或是抑制mRNA的翻译，使靶基因发生转录后沉默。miRNA在众多的生理和 病理进程中均扮演重要调控作用，几乎参与人类所有恶性肿瘤的病理过程。目前已证实，血 液中的miRNA在多种恶性肿瘤的诊断、治疗及预后的评估中都有潜在的应用价值，催生了 基于检测miRNA种类及含量来对肿瘤进行诊断和评估的新方式。一旦体液中的特定miRNAs 表达特征被广泛接受，那么这种检测miRNA的方法就为临床提供了一种非侵入或是最低侵 入式的疾病相关生物标记的检测方式。并且血清学检测的标准一旦建立，即如同生化学检 测那样具备普遍性、强制性和客观性的特点，会在最大限度上排除主观因素的干扰，进而提 高诊断效率。然而，同一miRNA表达特征在不同的研究中差异很大，这不仅表现在血浆和尿 液这样不同来源的体液样本中，而且表现在同样以血液为研究样本的不同研究中。例如，很 多报道中均显示前列腺癌患者血清和血浆中miR-141的表达水平增高。但是也有少量报道 显示同一 miRNA在患者血清中的表达降低，甚至无法检出。还有报道指出该miRNA在前列 腺癌、膀胱癌和肾癌患者血清中的含量没有差别。再如miR-16在前列腺癌组织中呈现低表 达状态，但是在血清中却无法鉴别患者和正常对照人群。出现以上相互矛盾的结果的原因， 固然有样本来源、样本处理等等方面的因素，但更重要的是不同的研究及商品化的试剂盒 应用不同的定量参考体系所致。
[0003] 在鉴定和验证疾病相关的miRNA时，通常会使用两种方法，一种是首先通过微阵 列或者下一代DNA测序技术确定候选的生物标记，然后使用实时定量PCR的方法继续鉴定 以确定该生物标记的可靠性。在此过程中，标准化占有极为重要的地位，因为其一，正确的 标准化可以移除系统性偏倚和实验性变异，其二，准确的标准化能够确保对不同样本之间 生物性差异的检测。对于评价miRNA在体外、体内甚至是临床试验过程中的治疗性作用，标 准化尤其重要。有偏倚的标准化会使本来有意义的结果被误读，进而出现错误的结论。目 前，多种多样的miRNA定量标准严重制约了各个研究结果横向可比性。
[0004] 在微阵列的过程中，标准化通常会采用loess方法，该法假设过表达的miRNA种 类和绝对量与低表达的相同。而在下一代DNA测序过程中，标准化的方法假设不同样本中 特定miRNA在总miRNA中的含量一致，因而特定miRNA相对表达量一般采用该miRNA的拷 贝值与文库总的拷贝数进行比较而得出。这种总体均数的方法及其他多标准合并应用的模 式并不适用于较小规模的研究，尤其不适用于临床的应用性检测，因为以单个样本或少量 基因为对象的miRNA定量过程中，如果仅仅为了标准化而无奈选择微阵列或下一代DNA测 序，这会造成严重的资源浪费。所以，在科研和临床实践中，在实时定量PCR检测仍然是目 前miRNA定量研究和应用的主流手段的背景下，一个合适的定量参考会极大促进miRNA含 量检测从科研到临床应用的适用性。目前，一个被广为接受的miRNA特异的定量标准仍然 处在争论中。争论的焦点集中在现有参考标准的合理性和表达的稳定性方面。
[0005] 目前以组织样本为对象的miRNA定量研究多采用核糖体RNA (5S rRNA)和核仁小 RNA(small nucleolar RNA)如 RNU6，RNU43，RNU44,和 RNU48。另外，RNU43 可以单独用来 作为参考标准，也可以同RNU1-4合并应用作为定量参考，合并时可以增加其稳定性。但是， 以上这些定量标准存在明显的合理性问题。核糖体RNA及小核仁RNA的功能与miRNA存在 明显不同。三者并不属于同一类型的RNA。不仅如此，核仁小RNA的长度处于60-300nt之 间，与miRNA的19-23nt明显不同，这种分子量上的差异可能会导致核仁小RNA对提取过程 和酶促化学反应的反应性不同于miRNA。另外更重要的是，核小和核仁小RNA主要分布于细 胞核中，而成熟的miRNA主要分布于细胞质和细胞所分泌的脂双层小体中，二者的分布区 域有显著不同。有鉴于此，核小和核仁小RNA直接拿来作为miRNA定量参考并不合适。
[0006] 除了内源性的RNA定量参考，一些人工合成的非人源的miRNA也被用来作为插入 式定量参考。该方法是将等量的人工合成的非人源性miRNA在RNA提取的时候添加到不同 样本中，在进行实时定量PCR时通过检测该外源miRNA的含量而将miRNA样本标准化。常 用的插入式定量参考有来自于秀丽线虫的cel-miR-39/43/54/238。该方法在样本中缺乏常 规使用的定量时，尤其是在血液检测中经常使用。但是该方法存在的问题也是显而易见的， 首先，它存在的意义仅在于在RNA提取及后续检测步骤中将技术性差异标准化和减少实验 的系统误差。任何生物性差异及RNA提取前的系统及人工误差都无法做到有效标准化。其 次，这种插入式定量参考在操作过程中又新添加的可能的人工误差，这样最直接的效应是 导致结果的误读。另外，该定量参考在操作过程中极易造成难以消除的外源miRNA污染。
[0007] 缺乏有效的内源性定量参考在一定程度上制约了miRNA的应用。各个研究所采用 的不同标准一方面说明目前迄需把这些具有miRNA定量潜能的候选标准进一步的精确验 证，另一方面提示某一类型的定量参考可能只会对某一特定系统发挥有效作用而无法移植 到其他系统中，这种情况会令寻找普遍适用的定量标准更加困难。
[0008] 目前，有研究显示miR-191和miR-103在众多的正常和肿瘤组织中均呈现明显优 于5S rRNA和RNU6B高度均一性表达，该结果也得到了进一步的证实，该研究发现miR-103 在所有人类脂肪和不同背景的细胞中表达都最为稳定。另外一些miRNA内参标准有 miR-130b、miR-16、和miR-345。其中miR-16被经常用来作为内源性定量参考。但是，这些内 源性参考也存在问题。比如，有证据表明miR-191在前列腺癌组织里面表达下调。miR-103 在多药耐药的胃腺癌细胞中表达下调。另有研究显示，miR-16在红细胞中的含量很高，一 旦采血是发生溶血，大量的miR-16就会被释放，这样在后续的血清学检测中，miR-16便不 适合作为内源性参考而使用。
[0009] 基于以上背景，本发明发明人分别取等量的来自于192个个体的血清miRNA制备 成文库，利用下一代DNA测序平台检测了各个已知miRNA的表达水平，发现其中miR-30a及 miR-30e在不同个体之间的表达最为稳定。接下来本发明发明人应用实时定量PCR的方法， 确定miR-30a和miR-30e在几个候选内参里稳定性最佳，且表达丰度高，从而鉴定出了适合 血清学检测应用的miRNA定量参考标准。

【发明内容】

[0010] 针对目前在miRNA相对定量过程中存在参考性不足、异质化、稳定性不足及种 间污染等诸多问题，本发明提供了一种用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参 miR-30e或miR-30a，克服了现有内源性和外源性内参标准的缺点和误区，提供了一种相对 简便、效果更佳的血清miRNA含量标准化的内参。
[0011] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0012] 一种用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参，所述内参为miR-30e或 miR-30a〇
[0013] 检测所述的用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参的引物，扩增miR-30e 的引物对序列为3￡0 10勵：1和5￡〇10勵:2所示；扩增1^1?-3(^的引物对序列为5￡0 10 NO:3 和 SEQ ID NO:2 所示。
[0014] 所述的用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参在制备血清/血浆miRNA 内参检测试剂盒中的应用。
[0015] -种血清/血浆miRNA内参检测试剂盒，该试剂盒含有所述的miR-30e的引物或 者含有所述的miR-30a的引物。
[0016] 所述的用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参在制备鉴定前列腺癌预后 miRNA标记分子试剂盒中的应用。以及
[0017] 在本发明中，优选的，所述的前列腺癌预后miRNA标记分子为miR-375或 miR-1290〇
[0018] 所述的用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参的引物在制备鉴定前列腺 癌预后miRNA标记分子试剂盒中的应用。
[0019] 在本发明中，优选的，所述的前列腺癌预后miRNA标记分子为miR-375或 miR-1290〇
[0020] 本发明的技术方案由以下4个步骤组成，（1)血清/血浆制备；（2)miRNA提取； (3)1^尺嫩定量；（4)1^尺嫩逆转录；（5)实时定量？0? ;(6)1^1?-30&/11111?-3〇6表达稳定性分析 (图1)。各步骤之间有时间和技术上的承接关系。此技术上的序贯性不能更改。具体步骤 为：
[0021] (1)血清/血浆制备：取等量的来自于192个个体的血清/血浆；（2)miRNA提 取：采用QIAGEN公司生产的miRNeasy Serum miRNA提取试剂盒提取血清/血衆样本中 的 miRNA; (3) miRNA 定量：用 Agilent Small RNA Chip 对从血清中抽提的 small RNA 进 行检测；（4)miRNA 逆转录：分别用 Life Technologies 的 TaqMatr? MicroRNA Re