qMan? UniversalPCRMaster Mix II，No UNG，无酶去离子水，TE 缓 冲液，无酶200uL PCR薄壁八连管及盖子，或96/384孔PCR板（以下操作以八连管为例）， 无酶移液枪头各1盒。
[0104] ②用0. 1 XTE将逆转录产物以1:20的比例稀释，反复颠倒混匀后，短暂离心备用。
[0105] ③按照表5的设计在PCR八连管里建立实时定量PCR反应，每个反应设定两个复 孔以减少系统和人为误差：
[0106] 表 5
[0107]
[0108] 将以上各组分加好后，反复颠倒管子混匀，短暂离心后置于冰上。
[0109] ④启动Real-time PCR仪，打开热盖，将反应混合物置于Real-time PCR仪的加热 模块上，盖紧盖子。按照表6设定反应条件：
[0110] 表 6
[0111]
[0112] 2)应用 QIAGEN 公司生产的 miScript SYBR Green PCR 试剂盒
[0113] ①备品：miScript SYBR Green PCR试剂盒，无酶去离子水，无酶200uL PCR薄壁 八连管及盖子，或96/384孔PCR板（以下操作以八连管为例），无酶移液枪头各1盒。
[0114] ②用0. 1 XTE将逆转录产物以1:20的比例稀释，反复颠倒混匀后，短暂离心备用。
[0115] ③按照表7的设计在PCR八连管里建立实时定量PCR反应，每个反应设定两个复 孔以减少系统和人为误差：
[0116] 表 7
[0117]
[0118] 将以上各组分加好后，反复颠倒管子混匀，短暂离心后置于冰上。
[0119] ④启动Real-time PCR仪，打开热盖，将反应混合物置于Real-time PCR仪的加热 模块上，盖紧盖子。按照表8设定反应条件：
[0120] 表 8
[0121]
[0122] 实施例6数据分析
[0123] 1)将以等量miRNA为研究材料所获得的序列表达信息输入稳定性评测软件 Normf inder和BestKeeper中，软件将针对每个miRNA分子在不同样本中的拷贝数而给出稳 定性数值。
[0124] 6个候选miRNA内参分子经过测序鉴定之后的稳定性评价如图3所示。将测序所 得的每个候选分子的拷贝数输入Normfinder，经过计算后得出每个候选分子在192个样 本中表达的稳定性和变异度。所选择的6个候选分子分别为miR-30e、miR-30a、miR-99a、miR-16、miR-125和let-7c。将192个样本不分组或者分成疾病组和正常组，此6个候选 分子在群体中的稳定性经由Normfinder分析后如图3A所示，其总体稳定性、组内及组间稳 定性和变异度如3B所示，可见miR-30e、miR-30a和miR-99a是最为稳定的3个候选分子。 图3C表示的是6个候选分子在序列测定时系统测得的拷贝数在群体里面的分布，可见在 miRNA初始量均一的情况下，miR_30e、miR_30a和miR_99a是表现最稳定的候选分子。
[0125] 2)以总量为2ng的miRNA为转录模板进行逆转录后，再针对每个样本扩增感兴趣 的miRNA分子，将Real-time PCR的Ct值输入稳定性评测软件Normfinder和BestKeeper 中，软件将针对每个miRNA分子在不同样本中的Ct值而给出稳定性数值。
[0126] Real-time PCR对内参候选分子的鉴定和验证如图4所示，应用TaqMan Real-time qPCR方法，在10个引物组合中（参见表9)，5个miRNA候选内参在另外100个样本中的变 异程度（4A)和稳定性（4B)。当引物组成由10个缩减为4个时，各miRNA候选内参在同样 100个样本中的变异度（4C)显著减小，与之相对应的是稳定性（4D)明显增强。散点图中 显示的所有的数据均按miR-16-5p Ct值由大到小的顺序排序。由此可以看出miR-30e和 miR-30a，尤其是miR-30e和miR-30a的算术平均值（GM30a/e)的稳定性最好，在群体里面 的分布最为均一。
[0127] 表9受检miRNA分子的引物序列信息
[0128]
[0129] 在应用QIAGEN Real-time qPCR试剂盒时，4个miRNA候选内参（表9)在100个样 本中的变异度（5A)和稳定性（5B)与TaqMan Real-time qPCR方法所得结果类似。miR_30e 和miR-30a，尤其是miR-30e和miR-30a的算术平均值（GM30a/e)的稳定性要远优于其他内 参候选分子。散点图中显示的所有的数据均按miR-16-5p Ct值由大到小的顺序排序。
[0130] 3)输出稳定性参考值后，针对每一个miRNA分子，在不同样本中的稳定性变异度 都可以以柱形图的形式表现出来，需要说明的是：Normfinder所输出的稳定性参考值越 小，表明该分子在不同样本中的稳定性越高。
[0131] 应用miR-30e和miR-30a作为内参，我们成功鉴定了 miR-375和miR-1290两个 miRNA分子对前列腺癌预后的诊断意义。在100名入选的激素敏感及不敏感的患者中，应用 real-time PCR的方法，以miR-30e和miR-30a的Ct值作为内参，靶分子的Ct值与之扣除后 得到的A Ct为该分子在此个体内的相对表达量。将100个患者依据相对表达量的高低分成 两组，经Kaplan-Meier分析后我们发现，只有miR-375和miR-1290两个分子与患者总体生 存率有关联。血清高表达的miR-375和miR-1290与生存期缩短有关（p = 0. 00020. 0001) (图6A，图6C).而另外一个受检分子miR-1246则未发现与总体生存率之间的关联（图6C)。 将miR-375和miR-1290二者组合与单分子预测相比，其诊断力更强（p = 4. 9X10-5)(图 6D) 〇
[0132] 实施例7用于血清/血浆miRNA内参检测试剂盒的制备
[0133] miRNA试剂盒的制备和操作流程是基于RT-PCR和real-time PCR技术。该试剂 盒包括血清/血浆miRNA引物（包括miR-30e的引物或miR-30a的引物，其中，miR-30e的 引物对序列为3￡0 10勵：1和5￡〇10勵:2所示；1^1?-3(^的引物对序列为5￡0 10勵:3 和SEQ ID N0:2所示），还可以有相应PCR反应所需的常用酶和/或试剂，如：逆转录酶，缓 冲液，dNTPs，MgCl2，去核酸酶水，荧光染料或探针、Taq酶等，可根据具体采用的实验方法选 用，这些常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的。此试剂盒可检测血清/血浆miRNA 的内参，应用此内参试剂盒可促进血清/血浆miRNA相关研究成果的临床转化和不同实验 室研究结果的比较，为临床医生快速掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础。
[0134] 以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的； 本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改 变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参，其特征在于，所述内参为 miR_30e 或 miR_30a。2. 检测权利要求1所述的用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参的引物，其 特征在于，扩增miR-30e的引物对序列为SEO ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示；扩增miR-30a 的引物对序列为SEO ID N0:3和SEQ ID N0:2所示。3. 权利要求1所述的用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参在制备血清/血 浆miRNA内参检测试剂盒中的应用。4. 一种血清/血浆miRNA内参检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求2所述 的miR-30e的引物或者含有权利要求2所述的miR-30a的引物。5. 权利要求1所述的用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参在制备鉴定前列 腺癌预后miRNA标记分子试剂盒中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的前列腺癌预后miRNA标记分子为 miR-375 或 miR-1290。7. 权利要求2所述的用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参的引物在制备鉴 定前列腺癌预后miRNA标记分子试剂盒中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的前列腺癌预后miRNA标记分子为 miR-375 或 miR-1290。
【专利摘要】本发明涉及一种用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参，属于生物技术领域。本发明用于血清/血浆miRNA实时定量PCR检测的内参为miR-30e或miR-30a。本发明公开了检测该内参的引物，扩增miR-30e的引物对序列为SEO？ID？NO:1和SEQ？ID？NO:2所示，扩增miR-30a的引物对序列为SEO？ID？NO:3和SEQ？ID？NO:2所示。该内参与引物可用于制备血清/血浆miRNA内参检测试剂盒及鉴定前列腺癌预后miRNA标记分子试剂盒。本发明的内参miR-30a和miR-30e在不同个体之间的表达最为稳定，且表达丰度高，适合血清学检测应用的miRNA定量参考标准。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105039544
【申请号】CN201510437551
【发明人】梁梅花, 王丽宏, 黄小义, 孙玉倩, 傅雪莲
【申请人】哈尔滨医科大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月23日