用于河流弧菌lamp-lfd检测的引物和探针序列及引物和探针的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测河流弧菌的引物和探针序列，尤其是涉及一种用于河流弧菌 LAMP-LFD检测的引物和探针序列及引物和探针的应用。
【背景技术】
[0002] 河流弧菌为嗜盐性革兰性阴性菌，广泛分布于河流和近海口水域，可导致鱼虾贝 等多种水生动物患病，是海水养殖的主要病原菌之一。同时，河流弧菌可从不同水体、城市 污水、动物和人类粪便，以及水产品中分离得到，感染后导致人出现严重的水样腹泻，伴随 呕吐、腹痛、发烧，以及不同程度的脱水等症状。在美国，该细菌还被认为是引起婴儿小肠结 肠炎的重要病原之一。因此，河流弧菌已成为一种重要的全球性人兽共患病病原菌，不仅危 害水产养殖业的发展，而且对食品安全和人类健康也构成了严重威胁，迫切需要建立快捷、 灵敏，特异的检测技术用于基层检测。
[0003] 目前，河流弧菌的检测以传统的细菌分离培养、生化鉴定为主，但是该方法存在检 测周期长、费时费力等缺点，而且检测人员需要专业的知识背景，远不能满足疾病的快速诊 断和及时治疗。尤其，该病原菌被认定为人兽共患病病原菌使得对于该病原的快速准确鉴 定变得更加重要。以蛋白或核酸为检测靶标的分子检测技术，因其检测快速、灵敏度和特异 性高等优点，在病原微生物的诊断与鉴定等领域获得了广泛使用。但针对河流弧菌分子检 测技术的相关报道还很少，国内的相关专家对河流弧菌的检测研究进行了一定的探索。也 取得了一些有效的成果。鄢庆枇等通过利用灭火的河流弧菌抗原制备了效价较高的特异 性抗血清，利用该血清建立了河流弧菌的荧光抗体检测技术应用于牙鲆（Paral ichthys olivaceus)体内该病原的检测；文万烧等基于toxR基因建立了河流弧菌的PCR检测技术， 针对细菌纯培养物的检测灵敏度可达10 3cfu*mL 1数量级；曹际娟等将PCR技术与高效液相 色谱联合应用于河流弧菌的检测，也取得了较好的效果。但是，这些方法存在着实验设备要 求高，工作环境严格，仅限于实验室诊断，不能很好的在基层检测中普及推广。
[0004] 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)自被报 道以来，凭借其低设备依赖性、高灵敏度和特异性等优势，在基于核酸扩增的检测领域取得 了巨大成功。但该方法在检测过程的某些阶段也存在很大的改善空间，其中一个重要的亟 待解决的问题就是针对扩增产物做到如何有效、准确判读。常用的方法是使用琼脂糖凝胶 电泳，该方法成本较低，但需接触EB等有毒试剂，而且很难避免环境中气溶胶污染；利用浊 度或荧光检测不仅增加了检测成本，而且易产生假阳性；这在一定程度上限制了该技术的 推广。LAMP-LFD技术是将LAMP的反应产物与特异性的探针杂交，通过荧光素标记在横向流 动试纸条（lateral flow dipstick，LFD)上完成显色和结果判读。该方法不需要EB等有 毒试剂，也摆脱了对电泳装置和凝胶成像系统等的依赖，肉眼即可观察到反应结果，在微生 物的基层检测和现场快速检测中展现了重大潜力。目前，该技术已成功运用于传染性脾肾 坏死病毒（/D/ectioiAs 1 耶化郎 ant/ ISKNV)、传染性肌肉坏死病 毒（/fl/ectiows Ki/m1，IMNV)、创伤弧菌（K/Ario 以及海膝链 球菌（^Yre/wtococci/s ii?iae)等水产病原微生物的检测，国内外还未见报道将该技术应用 于河流弧菌的诊断和检测。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快，检测成本低，检测灵敏度和 准确性高的用于河流弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列及引物和探针的应用。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为： 1、一种用于河流弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列，根据河流弧菌的外膜蛋白 ompU (GenBank登录号：KC182592)的编码序列设计LAMP的三对引物序列和一条探针序列， 引物序列具体如下： VflompU-F3 :5' -TCATGGCTTACCACGGTA-3' VflompU-B3 :5, -GGTGTAAGACGCTGCTAG-3，， VflompU-FIP ：5, -AGTTGAACCGTCATCGCTACGttttGGCCAGTTCTCTGACCTA-3,, VflompU-BIP :5' -TCTACGCAATCGGCGACACttttCTTTGTCTTGGTCAGCGT-3'， VflompU-LF :5' -ACGGTAAGTTGCACGTAGAG-3'， VflompU-LB :5' -GTGAAACTAGGTGCTGGCT-3'，VflompU-FIP 的 5' 端为生物素标记； 探针序列如下： VflompU-HP :5' -CTCTGATAACAAACAAGATGG-3'，5' 端为异硫氰酸荧光素标记。
[0007] 2、一种用于河流弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针序列在河流弧菌LAMP-LFD可 视化检测方法中的应用，具体检测方法步骤如下： 1) 配置LAMP反应体系：反应体系各成分的终浓度分别为：VflompU-F3和VflompU-B3 各 0? 2 Mmol/L，VflompU-FIP 和 VflompU-BIP 各 1.6 Mmol/L，VflompU-LF 和 VflompU-LB 各 0.4 Mmol/L，dNTPs 1.4 mmol/L，Tris-HCl (pH 8.8)20 mmol/L，KCl 10 mmol/L，MgS04 6.5 mmol/L，（NH4)2S04 10 mmol/L，Triton X-100 0.1%，8U Bst DNA 聚合酶大片段（New England Biolabs)和2 ML样品模版，加双蒸水使反应体系总体积为25 W ; 2) LAMP反应条件：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为63°C，扩增反应时 间为20 min ; 3) 探针杂交和LFD检测：扩增后将20 pmol的VflompU-HP探针加入反应体系中，63°C 温育5 min，进行杂交，取5 ML杂交液加入100 ML buffer中混匀，然后将LFD试纸条浸入 加入杂交液的缓冲液中显色，判断横向流动试纸条检测LAMP扩增的结果。
[0008] 3、一种根据权利要求1所述的用于河流弧菌的LAMP-LFD检测的引物和探针在 制备河流弧菌LAMP-LFD可视化检测试剂盒中的应用，该试剂盒包括LAMP反应体系：反应 体系各成分的终浓度分别为VflompU-F3和VflompU-B3各0? 2 Mmol/L，VflompU-FIP和 VflompU-BIP 各 1. 6 Mmol/L，VflompU-LF 和 VflompU-LB 各 0? 4 Mmol/L，dNTPs 1. 4 mmol/ L，Tris-HCl (pH 8.8)20 mmol/L，KCl 10 mmol/L，MgS04 6 . 5 mmol/L，（NH4)2S04 10 mmol/ L，Triton X-100 0? 1%，8U Bst DNA 聚合酶大片段（New England Biolabs)和 2 ML 样品模 版，加双蒸水使反应体系总体积为25 Ml。
[0009] 与现有技术相比，本发明的优点在于： 1. 灵敏度高，对河流弧菌纯培养物的检测灵敏度为1. ox 102 cfu/mL ; 2. 特异性强，所用的特异性引物根据河流弧菌的外膜蛋白基因中的八个不同区域设 计，并且还有DNA的特异性探针，可有效避免利用琼脂糖凝胶电泳、荧光染料等方法引起的 假阳性问题； 3. 检测时间短，扩增反应只需20 min，从样品基因组DNA的提取到完成结果判断，整 个检测流程仅需70 min，比常规PCR检测技术缩短约2 h ; 4. 仪器设备要求低，无需常规PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统等，只需一个水 浴锅即可完成检测； 5. 操作简单，结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，稍具分子生物学基础 的人员即可完成操作；检测结果清晰明显，肉眼观察即可判断； 6. 对人身和环境更加安全，检测过程中不涉及EB等有毒试剂。
[0010] 综上所述，使用本发明的引物和探针采用LAMP-LFD方法对河流弧菌进行检测，具 有更高的便捷性、特异性和灵敏度，仪器需求简单，有利于河流弧菌的早期诊断和检测，可 满足基层检测机构和现场疫源地检测的需要。
【附图说明】
[0011]图 1为 LAMP 特异性实验结果。M :100 bp Plus DNA ladder (Fermentas,美国）； 1 :以无菌去离子水作为模板；2 :以河流弧菌ATCC 33809的基因组DNA为模板；3~11 :分 别以迟缓爱德华氏菌MCCC235、嗜水气单胞菌ATCC 7966、创伤弧菌ATCC 27562、哈维氏弧 菌ATCC 33866、海豚链球菌ATCC 29178、溶藻弧菌ATCC 33787、鳗弧菌ayu-H080701、单增 李斯特菌ATCC 19115、铜绿假单胞菌ATCC 9027的基因组DNA为模板； 图2为LAMP-LFD特异性实验结果。1 :以无菌去离子水作为模板；2 :以河流弧菌ATCC 33809的基因组DNA为模板；3~11 :分别以迟缓爱德华氏菌MCCC235、嗜水气单胞菌ATCC 7966、创伤弧菌ATCC 27562、哈维氏弧菌ATCC 33866、海豚链球菌ATCC 29178、溶藻弧菌 ATCC 33787、鳗弧菌ayu-H080701、单增李斯特菌ATCC 19115、铜绿假单胞菌ATCC 9027的 基因组DNA为模板； 图 3 为LAMP 检测的灵敏度结果。M:100 bp Plus DNA ladder (Fermentas,美国）；1: 以无菌去离子水作为模板；2~10 :浓度依次为1. 0 X 10s，1. 0 X 107，1. 0 X 106，1. 0 X 105， 1.0X104，1.0X103，1.0X10 2，1.0X101，1.0X10° cfu.mL1 的河流弧菌 ATCC 33809 菌 液提取的基因组DNA作为模板； 图4为LAMP-LFD可视化检测的灵敏度结果。1 :以无菌去离子水作为模板；2~10 : 浓度依次为 1. 〇 X 108，1. 0 X 107，1. 0 X 106，1. 0 X 105，1. 0 X 104，1. 0 X 103，1. 0 X 102， 1. OX 101，1. 0X 10° cfu*mL 1的河流弧菌ATCC 33809菌液提取的基因组DNA作为模板； 图 5为PCR检测的灵敏度结果。M:100 bp Plus DNA ladder (Fermentas,美国）；1 :以 无菌去离子水作为模板；2~10:浓度依次为1.0 X 10s，1.0 X107，1.0 X106，1.0 X105， 1.0X104，1.0X103，1.0X10 2，1.0X101，1.0X10° cfu.mL1 的河流弧菌 ATCC 33809 菌 液提取的基因组DNA作为模板。
【具体实施方式】
[0012] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0013] 实施例1 LAMP-LFD技术检测河流弧菌方法的建立 1.引物设计：根据NCBI中已经发表的河流弧菌的外膜蛋白ompU(GenBank登录号：KC182592)的编码序列进行设计，其中，引物序列具体如下