一种用于血液直接荧光pcr扩增的反应液及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应 液及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着生物、医学、法医学等各相关领域的发展，荧光PCR技术得到了越来 越广泛的应用。特别是对于血液遗传病，感染性病毒及疾病和遗传背景分析，荧光PCR技术 已经成为不可或缺的基本技术。而血液作为一种重要的生物分析样本，其内含有大量的 DNA聚合酶抑制物质，如血红素、杂蛋白、脂肪等。因此，基于现有技术，无法实现荧光PCR方 法直接对血液中的核酸进行扩增。通常，为了完成血液样本核酸的荧光PCR扩增，必须先从 血液中对核酸物质进行纯化处理。目前血液基因组提取的方法主要有酚-氯仿抽提法、柱 提取法和磁珠法。尽管具体的提取方式不一样，但是都包括以下三个过程：一是破裂细胞膜 和核膜；二是纯化核酸即去除蛋白质等影响后续PCR反应的杂质；三是洗脱核酸。通过提取 处理虽然可以获得纯度比较高的核酸，但是核酸提取过程往往会导致80-90%以上的核酸 损失，同时繁琐的提纯步骤增加了样本间交叉污染的风险，从而增加了后续荧光PCR扩增 失败的可能。此外，由于提取过程耗时长，成本高，且需借助苯酚等有害试剂，增加了操作者 感染的风险，且难以实现高通量检测。因此，血液样本能够直接作为模板或经过简单处理就 能够作为模板进行荧光PCR扩增检测，成为血液荧光PCR扩增亟待解决的难题。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种扩增效率高、成本低的用于血液直接荧光PCR扩增的 反应液，旨在解决现有技术对血液进行PCR扩增时，需要预先对血液进行核酸提取纯化处 理，从而导致核酸大量损失、且增加了交叉污染以及有毒试剂使用的问题。
[0004] 本发明的另一目的在于提供一种血液直接荧光PCR试剂盒。
[0005] 本发明是这样实现的，一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，所述PCR反应液 中含有下列组分：寡肽、Bri j-58、Tween 20、甲酰胺。
[0006] 以及，一种血液直接荧光PCR试剂盒，包括上述用于血液直接荧光PCR扩增的反应 液。
[0007] 本发明实施例提供的用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，通过对PCR反应液中 进行合理配制，添加了特异的协同组分，使血液中的血红素、蛋白质和脂肪等DNA聚合酶抑 制物变性，以降低其对后续荧光PCR的抑制作用；同时，促进DNA聚合酶活性，使得荧光PCR 扩增能直接以血液为模版、在抗血液抑制作用的突变型DNA聚合酶的作用下进行高效和特 异的荧光PCR扩增。所述用于血液直接荧光PCR扩增的反应液的使用，省去了对血液样本 进行荧光PCR扩增时进行核酸提取纯化的步骤，避免了核酸的损失，显著提高了荧光PCR扩 增的效率和成功率；同时，避免了核酸提取纯化中交叉污染的可能和有毒试剂的使用，复合 环保理念。
【附图说明】
[0008] 图1是本发明提供的1份人血液样本在不同寡肽浓度的PCR反应液的扩增荧光扩 增曲线图；
[0009] 图2是本发明提供的1份人血液样本在不同dNTP浓度的PCR反应液的扩增荧光 扩增曲线图；
[0010] 图3是本发明提供的1份人血液样本在不同Brij-58浓度的PCR反应液的扩增荧 光扩增曲线图；
[0011] 图4是本发明提供的1份人血液样本在不同Tween 20浓度的PCR反应液的扩增 荧光扩增曲线图；
[0012] 图5是本发明提供的1份人血液样本在不同甲酰胺浓度的PCR反应液的扩增荧光 扩增曲线图；
[0013] 图6是本发明实施例1提供的10份不同来源的人血液样本的进行平行PCR的扩 增荧光扩增曲线图；
[0014] 图7是本发明实施例1提供的第1份人血液样本进行三次平行实验的荧光扩增曲 线图；
[0015] 图8是本发明实施例1提供的第2份人血液样本进行三次平行实验的荧光扩增曲 线图；
[0016] 图9是本发明实施例1提供的第3份人血液样本进行三次平行实验的荧光扩增曲 线图；
[0017] 图10是本发明实施例2和对比例1分别提供的PCR反应液对10份不同来源的血 液样本进行平行PCR扩增的荧光扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0018] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合 附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用 以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0019] 为了攻克血液荧光PCR扩增时需对血液样本进行核酸提取、以及血液内含物严重 抑制DNA聚合酶活性的血液抑制物问题，发明人意在开发一种避开核酸提取步骤、直接用 血液样本进行荧光PCR扩增的方法-即以全血作为模板直接扩增目的基因的血液直接荧光 PCR扩增法。该方法主要依赖于选择合适的PCR反应液来实现，具体的，如何研发一种针对 血液抑制物及增强DNA聚合酶酶活性的PCR反应液成为了本课题亟待解决的问题。本发明 实施例发明人立足于使血液中的血红素、蛋白质和脂肪等物质变性，同时又能促进DNA聚 合酶活性、且对PCR扩增效率无影响、对操作者安全，通过反复的分析研究、经过多次试验， 研究出了本发明实施例用于血液直接荧光PCR扩增的反应液。
[0020] 本发明实施例提供了一种用于血液直接荧光PCR扩增的反应液，所述PCR反应液 中含有下列组分：寡肽、Bri j-58、TWeen 20、甲酰胺。其中，所述寡肽能结合DNA聚合酶，在 PCR反应中起保护作用，使所述DNA聚合酶的酶活性不下降；所述Bri j-58和所述Tween 20 都是非离子去污剂，两者共同使用能够增加血液细胞的通透性，通过使蛋白质变性，破坏膜 结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中；所述甲酰胺也能分 离蛋白质-DNA复合物并使蛋白变性和释放，同时提高PCR反应的特异性。
[0021] 本发明实施例提供的用于血液直接荧光PCR扩增的反应液中，所述寡肽组分能保 护DNA聚合酶的酶活性，所述Bri j-58和Tween 20组分能增加细胞的通透性，破坏膜结构 和解聚蛋白质-DNA复合物，使血液中的血红素、蛋白质和脂肪等抑制物变性，以降低其对 后续荧光PCR的抑制作用，所述甲酰胺组分除了能分离蛋白质-DNA复合物并使蛋白变性 和释放外，还能提高PCR反应的特异性，此外还能够促进DNA聚合酶活性的活性，使得荧光 PCR扩增能避开核酸提取纯化过程，直接以血液为模版、在抗血液抑制作用的突变型DNA聚 合酶的作用下进行高效和特异的荧光PCR扩增。因此，不仅简化了荧光PCR扩增的步骤，节 省了操作时间，同时降低成本、避免样本间的交叉污染和减小了操作者感染的风险，实现高 效率、高成功率扩增检测的目的。
[0022] 作为优选实施例，所述寡肽为六肽，所述六肽的组成形式为 AA1-AA 2-AA3-AA4-AA5-Aa6，本发明实施例提供的所述六肽，由于具有相对确定的肽长和结 构，对保护DNA聚合酶的酶活性明显优于其他寡肽，其血液扩增效果好。作为进一步优选实 施例，通过发明人反复研究发现，所述的PCR反应液中的寡肽为Ser-Phe-Lys-Arg-Gly-Thr 时，其特定的空间结构、基团等，对保护DNA聚合酶的酶活性具有最佳效果。
[0023] 作为一个优选实施例，所述寡肽的浓度为3-20mg/ml，所述寡肽浓度过高，会影响 DNA聚合酶的酶活性，从而抑制PCR反应，如图1所示，从左至右寡肽的浓度分别为18mg/ ml、12mg/ml、6mg/ml和24mg/ml的4条扩增曲线；所述寡肽浓度过高，则起不到保护DNA 聚合酶的作用。以所述PCR反应液的总重为100%计，所述PCR反应液中下列各组分的组 成为：Bri j-58 :0. 05-5%、Tween 20 :0. 5-0. 8%、甲酰胺：2-10%，在该浓度下，3 组分能破 坏血液细胞膜，使血红素、蛋白质和脂肪等抑制物变性，浓度过低，变性不彻底，浓度过高， Bri j-58、Tween 20和甲酰胺都会对PCR反应起抑制作用，如图2为从左至右Bri j-58浓 度分别为0.3%、0. 1 %和0.6%的3条扩增曲线；如图3为从左至右TWeen20浓度分别为 0. 7 %、0. 5 %和0. 9 %的3条扩增曲线；如图4为从左至右甲酰胺浓度分别为2 %、6 %和 10%的3条扩增曲线。
[0024] 进一步地，所述寡肽的浓度为14-16mg/ml。以所述PCR反应液的总重为100%计， 所述？〇?反应液中下列各组分的组成为出4」-58 :0.2-0.4%、了￥661120:0.7-0.8%、甲酰 胺：2-4% 〇
[0025] 作为最优实施例，所述寡肽的浓度为15mg/ml，以所述PCR反应液的总重为100% 计，所述？〇?反应液中下列各组分的组成为出4」-58 :0.25%、1￥661120:0.8%、甲酰胺： 3%〇
[0026] 作为本发明另一个实施例，所述PCR反应液中还包括下述组分：Tris-HCl、硫酸 铵、氯化镁、dNTPs。其中，所述Tris-HCl能提供一个稳定的反应环境；所述硫酸铵中的NH/ 在高温条件下可以生成NHJPH +，所述NH3有生成氢键的条件，可以破坏非特异退火的引物 和模板间的不稳定氢键，提高了退火的特异性；所述氯化镁的Mg 2+为DNA聚合酶的辅助因 子，增加Taq酶活性，提高扩增效率；所述dNTPs为PCR反应DNA链的合成提高原材料。优 选的，下列各组分的浓度分别为：Tris-HCl :10-50mmol/L，pH9. 1 ;硫酸铵：10-50mmol/L ;氯 化镁：2-5mmol/L ;dNTPs :100-600 ymol/L。
[0027] 本发明实施例中，所述PCR反应液中dNTPs的组成比例为：dATP: d