莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量pcr检测体系及检测方法
【专利说明】莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测 体系及检测方法
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于生物技术检测领域，特别涉及实时荧光定量PCR检测方法及检测体 系，可同时对莫氏立克次体和恙虫病东方体进行核酸检测。
【背景技术】
[0003] 虫媒病是一类重要的传染病，在我国每年传染病总发病病例中约占 5 %~10 %，死 亡病例数占传染病总死亡数的30 %~40 %。目前，虫媒病流行和爆发呈现出新趋势：原有 虫媒病再度爆发，流行区域不断扩展；新发虫媒病不断被发现，且流行范围在不断扩大；虫 媒病流行的频率不断加大。
[0004] 鼠型斑疹伤寒（Murine Typhus)是由莫氏立克次体（yPicAeiteia a?oase>_ri)经鼠、 蚤等媒介生物传播的自然疫源性疾病；恙虫病（Tsutsugamushi Disease)又称丛林斑疹伤 寒，是由恙虫病东方体（iia tew 邮引起的自然疫源性疾病。莫氏立克次体 和恙虫病东方体均以鼠类为主要传染源。
[0005] 鼠型斑疹伤寒及恙虫病在我国许多地区均有流行，如鼠型斑疹伤寒在我国东北、 上海及长沙等地均有流行。我国目前有港口、机场、车站及陆路边境口岸约400个，每年均 有大量媒介生物借助交通工具、集装箱及货物等在口岸间输入输出。仅2002年到2007年 的五年间，卫生检疫机构就在入境交通工具、集装箱、货物中共捕获各类病媒生物1. 8亿多 只，且捕获数量呈现逐年上升的趋势。大量媒介生物的输入对我国的卫生安全特别是口岸 地区的卫生安全造成极大的威胁。强化对出入境交通工具及集装箱、货物等的排查和对输 入性医学媒介生物携带病原体的检测，是有效防止虫媒传染病通过国境口岸输入、输出，避 免疫情大范围爆发的基础和前提，也是国境口岸检疫执法和疾病监测的迫切需要。
[0006] 在样品检测过程中，因样品感染情况、操作者技术水平等因素影响，传统检测方法 往往具有一定的局限性。随着分子生物学技术的不断发展，实时荧光定量PCR技术被广泛 应用到医学和生物学领域，该技术具有灵敏度高、特异性好和可靠性强等特点，而且能够实 现多重反应，自动化程度高。TaqMan技术是一种对单管PCR产物进行实时荧光定量检测的 技术，通过加入与靶基因序列特异互补的双荧光标记探针，利用荧光信号的积累来实时监 测整个PCR进程，从而对靶标基因进行定量或定性检测。与常规TaqMan探针相比，美国应 用公司推出的TaqMan-MGB探针技术不仅荧光本底得以降低，荧光光谱分辨率得以改善，由 于探针3'端结合了 Minor groove binder结合物，使得探针的Tm值得以提高，同时提高了 探针的杂交稳定性和特异性。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是解决同时检测莫氏立克次体及恙虫病东方体的问题，提供了莫氏 立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测体系，包括引物和TaqMan-MGB探针序 列，特异性强，敏高性高；另外，本发明还提供一种莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时 荧光定量PCR检测方法，PCR反应体系和反应条件，特异性强，敏高性高，且具有良好的重复 性。
[0008] 本发明莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测体系，包括莫氏 立克次体和恙虫病东方体的引物和探针，其中， 莫氏立克次体引物及Taqman-MGB探针序列：
[0010] 本发明莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测方法： (1)首先是引物及探针的设计与合成： 以GenBank公布的莫氏立克次体基因序列（GI :51459527)的ompB蛋白基因序列设计 并合成上下游引物及Taqman-MGB探针，扩增片段大小为64bp， Pr47F :5' -TGTTGATGGTGCAGGATTTGA -3' Pr47R:5' -CGAATTTGTAGCGACAGGAAG A -3' Probe-P :5' - FAM - CAAACTGGCGCTGGTGT -3' ； 以GenBank公布的恙虫病东方体Karp型基因序列（GI: 63079111 )，56-kDa蛋白基因序 列设计并合成上下游引物及Taqman-MGB探针，扩增片段大小为130bp， Ot-F :5' -TCT RCR CCAGTAATYATTCCTCC-3' R=A/G Y=T/C Ot-R :5' -TGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGC-3' Probe-0 :5' -HEX-AAGGACCACACTCTAAT-3' ； (2) 阳性对照样品的合成： 莫氏立克次体阳性对照样品为合成质粒样品，依据GenBank公布的莫氏立克次体基 因序列（GI: 51459527)，选取莫氏立克次体引物扩增区域核酸序列（120 bp)，委托宝生物 工程(大连）有限公司进行基因合成，提取质粒作为莫氏立克次体阳性对照样品，命名为 pMD18-T-Rm，合成序列如下：
恙虫病东方体阳性对照样品为合成质粒样品，依据GenBank公布的恙虫病东方体基 因序列（61:63079111)，选取恙虫病东方体引物扩增区域核酸序列（153匕？），委托宝生物 工程(大连）有限公司进行基因合成，提取质粒作为恙虫病东方体阳性对照样品，命名为 pMD18-T-〇t，合成序列如下：
(3) PCR反应体系的建立：莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR反应体 系的建立，以循环阈值和荧光强度等作为评价指标，通过四因素三水平正交试验（L3 4)优化 PCR反应体系中莫氏立克次体引物（Pr47F/R)和探针（Probe-P)浓度及恙虫病东方体引物 (Ot-F/R)和探针（Probe-Ο)浓度等，建立最佳PCR反应体系如下：
(4) 实时荧光定量PCR反应条件优化：通过优化退火温度，最佳PCR反应条件如下： 50 0C 2min ；95〇C IOmin ；95〇C 15s，60°C lmin，循环45次，退火时收集荧光信号。
[0011] (5)对所述的莫氏立克次体及恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR反应体系和反 应条件进行评价，包括敏感性评价、特异性评价及重复性评价。
[0012] 所述的敏感性评价方法及结果如下： 分别以制备的pMD18-T-Rm标准品、pMD18-T-〇t标准品为模板，进行多重定量PCR扩增 反应，FAM通道和HEX通道均可获得较为理想的扩增曲线，以Ig (浓度）为横坐标，以循环 阈值Ct值为纵坐标，以IO2-IO7标准品测试结果绘制定量关系曲线； 以pMD18-T-Rm标准品和pMD18-T-〇t标准品的混合物为模板进行进行多重定量PCR扩 增反应，FAM通道和HEX通道均获得较为理想的扩增曲线。
[0013] 所述的特异性评价方法及结果如下： 以普氏立克次体、立氏立克次体、Q热立克次体、噬吞噬细胞无形体及伯氏疏螺旋体等 病原体DNA为模板，同时以ddH20、莫氏立克次体和恙虫病东方体阴性的鼠类基因组DNA及 莫氏立克次体和恙虫病东方体阴性的鼠类基因组DNA、pMD18-T-Rm和pMD18-T-〇t的混合 物作为空白对照、阴性对照及阳性对照进行多重定量PCR扩增，通过FAM通道和HEX通道分 析。
[0014] 所述的重复平评价方法及结果如下： 以同一批次制备的IO6个拷贝的pMD18-T-Rm的标准品和pMD18-T-〇t的标准品的混合 物做为模板进行定量PCR扩增，FAM通道和HEX的扩增曲线重合性较高，通过对5次扩增结 果进行统计学分析； 以不同批次制备的IO3和10 7个拷贝的pMD18-T-Rm的标准品和pMD18-T-〇t的标准品 的混合物作为模板进行定量PCR扩增，IO3批间重复性FAM通道和HEX及10 7批间重复性 FAM通道和HEX扩增曲线重合性均较高，通过对5次扩增结果循环阈值（Ct值）进行统计学 分析。
[0015] 本发明与同类技术相比，具有显著的技术特点：以TaqMan探针技术为基础，应用 TaqMan-MGB探针技术设计并合成莫氏立克次体和恙虫病东方体探针，建立莫氏立克次体和 恙虫病东方体双重实时荧光定量PCR检测方法，在同一反应管内可同时对莫氏立克次体和 恙虫病东方体进行检测，极大的缩短了检测周期，操作简便，满足对莫氏立克次体和恙虫病 东方体同时进行快速检测的工作要求。
【附图说明】
[0016] 图1为双重实时荧光定量PCR法敏感性试验检测莫氏立克次体时的扩增曲线，其 中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度； 图2为双重实时荧光定量PCR法敏感性试验检测恙虫病东方体时的扩增曲线，其中横 轴为循环次数，纵轴为荧光强度； 图3为双重实时荧光定量PCR法敏感性试验检测莫氏立克次体的定量关系曲线，其中 横轴为标准品拷贝数的对数，纵轴为循环数； 图4为双重实时荧光定量PCR法敏感性试验检测恙虫病东方体的定量关系曲线，其中 横轴为标准品拷贝数的