一种探针室温下检测耐药基因多态性的试剂盒的制作方法
【技术领域】 [0001] ：本发明属于分子生物学领域，具体说是涉及一种用分子信标二联体探 针检测多药耐药基因 ABCG2 C421A的单核苷酸多态性。
【背景技术】 [0002] ：传统分子信标长约25-35个碱基，具有类似发夹形状的二级结构，被称 为茎环结构。茎环结构分为外环结构和茎杆结构两部分，外环结构是与目的片段互补的核 苷酸单链，其功能是识别目的片段，并与之杂交。茎杆结构为长度约5-8个碱基的双螺旋结 构，其功能是形成二级结构，不直接参与目的片段的识别与杂交。在茎的5'端和3'端分别 连有荧光基团和荧光淬灭基团。当分子信标以茎环结构的形态存在时，位于两端的荧光分 子与和淬灭分子非常接近（小于IOnm)，此时给予荧光基团的激发波长，会有荧光共振能量 转移现象发生，荧光基团发出的荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发，因此检测不到荧 光信号。当有靶序列存在时，分子信标的序列与靶序列特异性结合，形成的双螺旋体比分子 信标的莖环结构更稳定，焚光分子与淬灭分子分开，焚光共振能量转移现象终止，此时焚光 分子发出的荧光可以被检测到，且所检测到的荧光强度与杂交体系中靶序列浓度成正比。 因此，分子信标无需洗脱操作，可以连续输出信号，具有实时分辨力。
[0003] 传统分子信标常用于基因表达的实时监控，也可用于SNPs检测，这种无需第二次 开盖加样的"一站式"方法优势在于对于操作的简化达到了极致，但同时也存在不足。首先， 传统分子信标的应用范围在高温区，需要精密的温控设备辅助，并绘制熔解曲线。为了获得 与目的单链的的互补链竞争结合位置，需要提高外环序列的Tm值，目前的做法是延长外环 序列的长度，或修饰更多的非天然核酸。前者导致了对单碱基错配识别能力的降低，后者则 使成本大幅攀升。其次，传统分子信标至少要制备一对才能检测一种双等位基因。因此市 场急需开发一种室温下高特异性，不依赖温控设备，单体即可检测一种双等位基因的探针。
【发明内容】
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[0004] 发明目的：本发明设计了一种带有新型分子信标二联体探针的试剂盒，实现了探 针单体在室温条件下快速检测基因 ABCG2 C421A的单核苷酸多态性，解决了传统探针在室 温条件下特异性差，单体不能检测双等位基因的问题。
[0005] 技术方案：
[0006] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] -种探针室温下检测耐药基因多态性的试剂盒，包括一种分子信标二联体探针， 以及室温杂交预混液，其特征在于：所述的分子信标二联体具有双茎环结构，是由寡核苷酸 单链基于碱基互补原则形成的二级结构，分为茎环结构I和茎环结构II，这两个茎环结构 均由外环和茎杆两部分组成；构成双茎环结构的一级核苷酸序列为5' gcaggtgTTGAATGTCA AGAGTCGcacctgcictgcgagTTGAATTTCAAGAGTCGctcgcag 3'，其中大写碱基组成茎环结构的 外环部分，小写无下划线碱基组成茎环结构的茎杆部分，5'端修饰绿色荧光基团6FAM，3'端 修饰红色荧光基团HEX，中间位置用i表示的T碱基，该试剂盒用于检测耐药基因 ABCG2的 C421A单核苷酸多态性，检测样本为PCR产物。
[0008] 所述外环部分的核苷酸用来识别目的序列，茎杆部分的核苷酸用于形成二级结 构，其不直接参与目的序列识别。
[0009] 这两个功能独立的茎环结构，茎环结构I用于检测ABCG2 C421A的C亚型等位基 因，茎环结构Π 用于检测ABCG2 C421A的A亚型。
[0010] 所述探针的PCR的正向引物序列5 ' TTGTGATGGGCACTCTGACG3 '，反向引物序列 5' CGTCATAGT TGTTGCAAGCCG3'。
[0011] 构成双茎环结构一级核苷酸序列中间位置的i不属于茎环结构，仅用于修饰荧光 淬灭基团BHQl。
[0012] 室温杂交预混液：每10 μ L杂交预混液中由5 μ L浓度为25mmol/L的MgCl2、4 μ L 甲酰胺和1 μ L浓度为1 μ mol/L的分子信标二联体组成。
[0013] 所述的分子信标二联体的制备是通过如下步骤实现的：
[0014] (1)向8联管中加入室温预混液10 μ L ;
[0015] (2)对目的基因进行不对称PCR扩增；
[0016] (3)吸取10 μ L不对称PCR产物至装有室温预混液的8联管中；混匀后利用QPCR 仪等能够检测荧光强度的仪器检测荧光强度值。
[0017] 优点及效果：
[0018] 本发明实现了一个分子信标二联体单体可以同时检测两个等位基因，无需加入第 二个探针，并且在室温条件下显示了对单碱基错配序列显示了极高的识别能力。只修饰一 种淬灭基团，减少了合成成本。如将分子信标二联体单体用于微阵列固体表面的修饰，可以 节省一半的偶联位置大幅减少偶联所用的时间及成本。
【附图说明】：
[0019] 图1 :分子信标二联体二级结构图；
[0020] 图2 :分子信标二联体分别与模板G和模板A杂交的恪解曲线；
[0021] 图3 :从NCBI Gene数据库中获取的基因 ABCG2 C421A附近的序列（含C421A位 点）；
[0022] 图4 :由NCBI-BLAST得到的PCR产物匹配结果；
[0023] 图5 :分子信标二联体与不同浓度模板杂交的焚光强度-模板浓度线性图；
[0024] 图6 :实例2中部分PCR产物的基因测序图（由生工生物工程（上海）股份有限 公司提供）。
【具体实施方式】：
[0025] -种室温下检测多药耐药基因 ABCG2 C421A的单核苷酸多态性的试剂盒，包括一 种新型的分子信标二联体探针，以及室温杂交预混液，其特征在于：分子信标二联体具有独 特的双茎环结构，是由寡核苷酸单链基于碱基互补原则形成的二级结构，分为茎环结构I 和莖环结构II，见图1所示。
[0026] 分子信标二联体由两个茎环结构均由外环和茎杆两部分组成，外环部分的核苷酸 用来识别目的序列，茎杆部分的核苷酸用于形成二级结构，不直接参与目的序列识别。
[0027] 构成双莖环结构的一级核苷酸序列为5'gcaggtgTTGAATGTCAAGAGTCGcacctgc主ctg cgagTTGAATTTCAAGAGTCGctcgcag 3'，其中大写碱基组成茎环结构的外环部分，小写无下划 线碱基组成茎环结构的茎杆部分，5'端修饰绿色荧光基团6FAM和3'端修饰红色荧光基团 HEX，中间位置用i表示的T碱基不属于茎环结构，仅用于修饰荧光淬灭基团BHQl。
[0028] 双茎环结构是两个功能独立的茎环结构，茎环结构I用于检测基因 ABCG2C421A的 C亚型，茎环结构II用于检测A亚型。每个茎环结构在与互补的序列或单碱基错配序列杂 交时产生的熔解曲线都具有显著差异，见图2A、B。选取荧光强度值差异最大的温度作为观 测点见图2C，并利用甲酰胺将观测点调整至25,见图2D。茎环结构的熔解曲线为降温曲线， 曲线走向为从高温向低温（从右向左）。图2中，A :分子信标二联体与模板G的熔解曲线 (茎环结构I的熔解曲线为红色，茎环结构II的熔解曲线为蓝色，下同）；B :分子信标二联 体与模板A的熔解曲线；C :图A与图B的合图，双箭头位置的荧光强度差异最大；D :甲酰胺 的加入使荧光强度差异最大位置被降低至25°C附近。
[0029] 利用具有荧光扫描及读取功能的仪器，在25°C下直接读取荧光强度值，凡高于临 界值的样本为基因型检出阳性，低于或等于临界值的样本为基因型检出阴性。
[0030] 阳性样本临界值的定义：人工合成两种基因型模板，用A亚型模板代替实际样本 做为C亚型的阴性对照，绘制熔解曲线，见图2中的③号线；用C亚型模板代替实际样本做 为A亚型的阴性对照，绘制熔解曲线，见图2中的②号线。包括阴性对照在内的每例待测样 本做3个副孔，以阴性对照样本荧光强度的"均值+2X标准差"作为临界值，与被测样本荧 光强度的均值比较，凡荧光强度值高于临界值的被测样本视为该基因型检出阳性，荧光强 度值低于或等于临界值的被测样本视为该基因型检出阴性。
[0031] 进一步的，人工合成的两种基因型模板序列为：TTGTGATGGGCACTCTGACGGTGAGAGAA AACTTA「C/AlAGTTCTCAGCAGCTCTTCGGCTTGCAACAACTATGACG。该序列与 PCR产物序列相同。括 号内的碱基为突变位点的二等位基因。
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