基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒及其分型方法
【专利摘要】基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒及其分型方法，涉及单核苷酸多态性。试剂盒包括实时荧光定量PCR试剂、阳性对照及阴性对照；所述Glu504lys为NCBI所提供人12号染色体ALDH2基因中的SNP位点；分型方法：1)采用常规方法提取EDTA抗凝全血样本中的DNA；2)采用所述基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将DNA进行实时荧光定量PCR扩增；3)根据检测到的荧光信号对人ALDH2基因Glu504lys进行分型。AllGlo探针在保持高特异性和敏感性的前提下，检测价格比直接测序法更低廉，并且过程更简易耗时更短。
【专利说明】
基于AI IGI 〇探针的GI u5041 ys检测分型试剂盒及其分型方法
技术领域
[00011本发明涉及单核苷酸多态性(SNP)，尤其是涉及一种基于AllGlo探针的Glu5041ys 检测分型试剂盒及其分型方法。
【背景技术】
[0002] 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水 平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一 种。SNPs在人类基因组中广泛存在，平均每500~1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达 300万个甚至更多。作为第三代遗传标志，SNP与人体许多表型差异、药物易感性与疾病易感 性密切相关。SNP在基因组中的大量存在，使其成为一个强有力的工具，在疾病定位与克隆、 药物的设计和测试以及生物学的基础研究中起了非常重要的作用。
[0003] 个体化诊断治疗是未来医学发展的大方向。将个体化的靶点定位于某个基因，甚 至是单个核苷酸，发现疾病的遗传标志物，将有助于根据每个患者的不同遗传背景来开展 疾病预防、诊断和治疗。基因的SNP是形成个体间差异的重要遗传学基础，通过SNP与疾病和 药物治疗的关联性分析，使得医生不仅可以通过所检测出的SNP预测、确定与疾病有关的基 因，同时也将能够事先把握患者个体对于某种药物的反应特点，并根据这一特点选择治疗 效果最好，不良反应等危险性最小的药物对患者进行精准治疗。
[0004] SNP在疾病的预防、诊断、治疗及个体化医学发展中扮演着重要的角色，因此准确 快速的进行SNP检测分型具有重大的意义。
[0005] 目前，SNP分型的方法主要有直接测序技术法、限制性片段长度多态性技术 (RFLP)、Tagman荧光探针法、扩增阻滞突变系统(ARMS)、高分辨熔解曲线分析法(HRM)等。其 中，直接测序法是目前最直观，准确性相对而言最高的SNP分型方法，但其步骤多而分散，成 本较高，工作量大，周期长，价格昂贵，不适合大样本多位点检测;限制性片段长度多态性技 术(RFLP)作为一种最早的DNA标记技术，对仪器要求低，只需要一台PCR仪以及电泳仪器即 可进行实验，但其实验操作繁琐，检测周期长，不适合大样本检测;Tagman荧光探针法准确 度较好，但其设计合成程序复杂，并且不适合多位点少量样本的分型，尤其是频率偏低的位 点；扩增阻滞突变系统(ARMS法)快速、简便，但是不能闭管操作，对基因多态性分析难以实 现高通量、自动化;高分辨熔解曲线分析法(HRM)具有简单、快速等优点，但该方法特异性不 足，仪器选择少。
[0006] AllGlo探针作为新一代的荧光探针，在具备TaqMan-MGB探针优点的基础上，大大 提高信噪比，减少背景荧光信号。目前，AllGlo探针已经成功应用于检测疱疹病毒、乙型肝 炎病毒基因突变（Feng，Z.L.Yu，X.Y.Lu，Z.M.Geng，D.Y.Zhang，L.Chen，S.J.Rapid detection of the hepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo? probes[J].Clin Chim Acta，2011，412( 11-12) :1018-1021 )、侵袭性曲霉菌病（Wu，D.S.Shen，J. Z. Zhou, X.Q.Shen,S.F.ffu,X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AllGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke Za Zhi,2010,49(2):142-145)〇
[0007] 硝酸甘油是临床上广泛用于治疗及预防冠心病心绞痛的常用药，在治疗心绞痛方 面已有100多年的历史。虽然硝酸甘油是治疗心绞痛的一线药物，但其临床的治疗效果在不 同个体间却有很大的差异，尤其在中国汉族人群中含服硝酸甘油无效的比例可高达25%以 上。乙醛脱氢酶(ALDH2)是体内催化硝酸甘油生物转化的关键酶，其酯酶活性可以通过将硝 酸甘油脱硝形成一氧化氮，进而发挥作用。ALDH2第12外显子存在一个SNP位点一 Glu5041ys，该SNP位点会导致ALDH2活性发生改变，进而造成硝酸甘油无法产生一氧化氮， 丧失药效。Glu5041ys在白种人中少见，但是在东亚黄种人中却高达30%-50%(Goedde服， et al.Population genetic studies of aldehyde dehydrogenase isozyme deficiency and alcohol sensitivity .Am. J. Hum. Genet · 1983; 35:769-772)，因此在用药前对患者进 行Glu5041ys的检测分型，能够为患者选择更为合适的治疗药物，避免无效用药，为临床治 疗用药提供重要的参考依据。在个体化诊断与治疗快速发展的背景下，Glu5041ys与硝酸甘 油的紧密联系使其成为了一个极具医学潜力的SNP位点，因此急需一种更快速高效的SNP分 型方法来满足精准医学的发展。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的之一在于针对现有检测SNP方法中使用的试剂盒和检测方法存在的 上述缺陷，提供基于AllGlo探针的Glu5041ys检测分型试剂盒。
[0009] 本发明的目的之二在于提供基于AllGlo探针的Glu5041ys检测分型方法。
[0010]所述基于AllGlo探针的Glu5041ys检测分型试剂盒，包括实时荧光定量PCR试剂、 阳性对照及阴性对照；
[0011] 所述Glu5041ys为美国国家生物技术信息中心(NCBI)所提供人12号染色体ALDH2 基因中的SNP位点；
[0012] 所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10 X Taq缓冲液、10m mol的MgCl2、5ιι/μ L的Taq Hotstart DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLow R0X、100mL无核酶水、10μ mol/L Glu5041ys的特异正向引物、ΙΟμ mol/L Glu5041ys的特异反向引物和AllGlo探针;所 述lOXTaq缓冲液包括 100m mol Tris-HCl和500m mol KC1。
[0013] 所述Glu5041ys的特异正向引物的核苷酸序列为：
[0014] SEQ ID N0·1:5'-GGCTACAAGATGTCGGGGAG-3，；
[0015] 所述Glu5041ys的特异反向引物的核苷酸序列为：
[0016] SEQ ID NO^^^GCCACCAGCAGACCCTCA-S^
[0017] 所述AllGlo探针为Glu5041ys的特异探针，其核苷酸序列为：
[0018] SEQ ID N0.3：Glu5041ys-A:MAR-CAGGCATACACTAAAG-MAR；
[0019] SEQ ID N0.4：Glu5041ys-G:JUP-CAGGCATACACTGAAG-JUP；
[0020] 所述阳性对照包括：阳性纯合对照品1、阳性纯合对照品2、阳性杂合对照品。所述 阳性纯合对照品1为Glu5041ys分型为AA的DNA样品，所述阳性纯合对照品2为Glu5041ys分 型为GG的DNA样品，所述阳性杂合对照品为Glu5041ys分型为AG的DNA样品。
[0021 ]所述阴性对照为lmL的无核酶水。
[0022]所述基于AllGlo探针的Glu5041ys检测分型方法，包括以下步骤：
[0023] 1)采用常规方法提取EDTA抗凝全血样本中的DNA;
[0024] 2)采用所述基于AllGlo探针的Glu5041ys检测分型试剂盒提供的实时荧光定量 PCR试剂将DNA进行实时荧光定量PCR扩增；
[0025] 3)根据检测到的荧光信号对人ALDH2基因 Glu5041ys进行分型。
[0026] 所述AllGlo探针可米用美国AlleLogic Biosciences Corporation公司的焚光定 量探针，它拥有普通Taqman，Taqman_MGB及分子信标(molecular beacon)探针所有优点，克 服了目前这几种探针的最大弊端，它打破了传统Taqman-端报告基团一端淬灭基团的限 制，利用了美国AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的几种常见波长的特制焚 光染料，标记在寡核苷酸上面互为报告基团和粹灭基团，而且上面含有特殊的可以提高Tm 值(退火温度)的化学基团，提高探针特异性，杂交特异性大大提高，在杂交水解之后两端标 记的染料又全部变为报告基团，提高荧光增量。
[0027]所述AllGlo探针具有以下优势：①提高Tm值(可达10°C以上），探针更短可以达到 15~16个碱基，可以适用A，T含量比较高的序列设计探针;②加大了多重荧光定量的选择， 因为每种染料即是报告基团又是淬灭基团，打破传统Taqman探针因波长原因标记选择困 难，不受淬灭基团波长限制；③大大提高信噪比，无背景信号，空间距离近，更好的淬灭效 果;④成本较低，价格仅相当于Taqman-MGB探针的一半，具有MGB探针所有优势。
[0028] 本发明采用了 AllGlo探针技术，设计了特异性引物和相应的AllGlo探针，探针分 别标记2种特殊荧光基团(MAR、JUP)，并对该技术反应条件进行优化，建立了一种AllGlo探 针SNP检测分型方法，应用前景广阔。
[0029] 本发明的有益效果如下：
[0030] 本发明提供了一种基于AllGlo探针的SNP检测分型试剂盒和检测方法，其特异性 和敏感性高，可快速准确进行SNP分型，与现有的常见技术相比具有以下优势：
[0031 ] 1.与直接测序法相比，AllGlo探针在保持高特异性和敏感性的前提下，检测价格 比直接测序法更低廉，并且过程更简易耗时更短。
[0032] 2.与taqman-MGB探针相比，AllGlo探针采用相同的荧光基团，互为报告基团和淬 灭基团，一方面释放的荧光信号更强，另一方面本底信号更低;而且合成程序简单，价格仅 相当于Taqman-MGB的一半。
[0033] 3.与限制性片段长度多态性技术(RFLP)相比，基于AllGlo探针的SNP分型方法将 反应时间大大缩短，通量更大，并且敏感性与特异性要明显高于基于限制性酶切位点的SNP 分型方法。
[0034] 4.与扩增阻滞突变系统(ARMS)相比，基于AllGlo探针SNP分型方法检测灵敏度更 强，可以实现"闭管操作"，有效防止外界污染，具有良好的特异性和准确性。
[0035] 5 .与高分辨熔解曲线分析法(HRM)相比，基于A11G1 〇探针SNP分型方法特异性更 高，并且多种仪器可应用AllGlo探针进行SNP检测分型，可用仪器选择多，不需要特定技术 人员操作，应用范围更广阔。
[0036] 6.本发明建立了基于AllGlo探针进行Glu5041ys的检测分型方法，适合人群进行 个体化的SNP检测分型，推动了 SNP在临床药物研究及个体化用药的发展。
【具体实施方式】
[0037] 实施例1
[0038] 本发明基于AllGlo探针的Glu5041ys检测分型试剂盒包括以下组份：
[0039] 实时荧光定量PCR试剂、阳性对照及阴性对照。
[0040] ①实时荧光定量PCR试剂包括以下组份:10 X Taq缓冲液(10 X Taq缓冲液包括100m mol Tris-HCl和500m mol KCl)、10m mol的MgCl2、5u/yL的Taq Hotstart DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLow R0X、100mL无核酶水、10ymol/L Glu5041ys的特异正向引物、10 ymol/L Glu5041ys的特异反向引物和AllGlo探针。
[0041 ]②阳性对照包括：阳性纯合对照品1、阳性纯合对照品2、阳性杂合对照品。所述阳 性纯合对照品1为Glu5041ys分型为AA的DNA样品，所述阳性纯合对照品2为Glu5041ys分型 为GG的DNA样品，所述阳性杂合对照品为Glu5041ys分型为AG的DNA样品。
[0042]③阴性对照为lmL的无核酶水。
[0043] 实施例2
[0044] 外周血Glu5041ys的检测分型，包括以下步骤：
[0045] 1.收集EDTA抗凝外周血：
[0046] 抽取新鲜血液标本2mL装于EDTA抗凝管并分装多管，每管分装400~500yL，取200μ L用于DNA提取，其余全血标本置于-80 °C冻存。
[0047] 2.提取 DNA:
[0048]采用天根生物科技有限公司的生产的血液基因组DNA提取试剂盒(DP348)，按照操 作说明书进行样本(全血)DNA提取，200yLEDTA抗凝全血按照说明书操作进行，最后用50yL 的洗脱缓冲液TB溶解DNA，于核酸分光光度仪器Nano Drop2000上分别测定浓度和纯度，取 纯度A260/A280比值在1.7~1.9之间，取浓度10~50ng/yL的已提取的DNA用于SNP分型检 测，其余的DNA均于-80 °C冻存。
[0049] 3.实时荧光定量PCR扩增：
[0050] 3.1将荧光定量PCR的各组分置于室温溶解，混匀后置于冰上。
[0051] 3.2配制卩0?反应混合液如表1。
[0052] 表 1
[0054] 3.3于8联管中分装配制好PCR反应混合液，每管加入lyL的DNA，充分混匀，整个过 程在冰上进行，避免气泡的产生。每次实验设置一个阴性对照，设置一个阳性纯合对照品1， 一个阳性纯合对照品2和一个阳性杂合对照品。
[0055] 3.4检测在实时荧光定量PCR仪器上进行，可使用ABI7300,7500(美国Applied Biosystems公司）等多种仪器。
[0056] 3.5设置荧光定量PCR反应条件如表2。
[0057] 表 2
[0058]
[0059] 4.结果分析与处理:应用ABI仪器自带软件进行结果分析。根据对照扩增结果，分 型产生三种基因型：
[0060] 第一种基因型:AA，与阳性纯合对照品1在同一轴上；
[0061] 第二种基因型:AG，与阳性杂合对照品在同一轴上；
[0062]第三种基因型:GG，与阳性纯合对照品2在同一轴上。
[0063] 实施例3.组织样本SNP检测分型
[0064] 1 ·组织样本处理：
[0065] 组织(脾组织用量应少10mg)应打碎处理为细胞悬液，然后lOOOOrpm(~11200Xg) 离心lmin，倒尽上清，加200yL缓冲液GA(天根DNA提取试剂盒DP304)，震荡至彻底悬浮；
[0066] 2.组织样本DNA提取和富集：
[0067]采用天根生物科技有限公司的生产的DNA提取试剂盒(DP304)，按照操作说明书进 行组织样本的DNA提取，最后用50yL的洗脱缓冲液TE溶解DNA，于核酸分光光度仪器Nano Drop2000上分别测定浓度和纯度；
[0068] 3.组织样本的SNP检测分型。
[0069]后续步骤参照实施例2的步骤3~4。
[0070] 可应用范围：
[0071]基于AllGlo探针的Glu5041yS检测分型试剂盒及其检测方法可应用于人类组织样 本和血细胞Glu5041ys的检测分型，以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发 明的优点。
【主权项】
1. 基于AllGlo探针的Glu5041ys检测分型试剂盒，其特征在于包括实时荧光定量PCR试 剂、阳性对照及阴性对照； 所述Glu5041ys为美国国家生物技术信息中心所提供人12号染色体ALDH2基因中的SNP 位点。2. 如权利要求1所述基于AllGlo探针的Glu5041ys检测分型试剂盒，其特征在于所述实 时荧光定量PCR试剂包括以下组份：lOXTaq缓冲液、10m mol的MgCl2、5u/yL的Taq Hotstart DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLow R0X、100mL无核酶水、ΙΟμ mol/L Glu5041ys的特异正向引物、ΙΟμ mol/L Glu5041ys的特异反向引物和AllGlo探针;所述10 X Taq缓冲液包括 100m mol Tris-HCl和500m mol KC1。3. 如权利要求1所述基于AllGlo探针的Glu5041ys检测分型试剂盒，其特征在于所述 Glu5041ys的特异正向引物的核苷酸序列为： SEQ ID NO.1：5;-GGCTACAAGATGTCGGGGAG-3;； 所述Glu5041ys的特异反向引物的核苷酸序列为： SEQ ID NO·2:5，-GCCACCAGCAGACCCTCA-3，； 所述AllGlo探针为Glu5041ys的特异探针，其核苷酸序列为： SEQ ID N0.3：Glu5041ys-A:MAR-CAGGCATACACTAAAG-MAR； SEQ ID N0.4:Glu5041ys-G:JUP-CAGGCATACACTGAAG-JUP。4. 如权利要求1所述基于AllGlo探针的Glu5041ys检测分型试剂盒，其特征在于所述阳 性对照包括：阳性纯合对照品1、阳性纯合对照品2、阳性杂合对照品，所述阳性纯合对照品1 为Glu5041ys分型为AA的DNA样品，所述阳性纯合对照品2为Glu5041ys分型为GG的DNA样品， 所述阳性杂合对照品为Glu5041ys分型为AG的DNA样品。5. 如权利要求1所述基于AllGlo探针的Glu5041ys检测分型试剂盒，其特征在于所述阴 性对照为1 mL的无核酶水。6. 基于A1 lGlo探针的Glu5041ys检测分型方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 采用常规方法提取EDTA抗凝全血样本中的DNA; 2) 采用如权利要求1~5中任一所述基于AllGlo探针的Glu5041ys检测分型试剂盒提供 的实时荧光定量PCR试剂将DNA进行实时荧光定量PCR扩增； 3) 根据检测到的荧光信号对人ALDH2基因 Glu5041ys进行分型。7. 如权利要求6所述基于AllGlo探针的Glu5041ys检测分型方法，其特征在于所述 AllGlo探针采用美国AlleLogic Biosciences Corporation公司的焚光定量探针。
【文档编号】C12Q1/68GK105969842SQ201610083711
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年2月6日
【发明人】方宜臻, 林华月, 张忠英
【申请人】厦门大学附属中山医院, 张忠英