专利名称：：用于hladr分型的探针系统和用该探针分型的方法
技术领域：
：本发明涉及测定个体的II类HLA基因型的方法，尤其是对多态性HLA-DR基因的检测。该方法特别可用于移植中的HLA分型、医学诊断、法医等。HLA(人淋巴细胞抗原)系统是由人体主要组织相容性复合物编码的，它通过区分自我和非自我在个体间器官移植中产生很大的限制。另外，大量疾病的素因中涉及HLA因子。因此HLA系统的抗原用于确定器官移植中供体和受体间的特征(F.H.BACH和J.J.VANROOD，《新英格兰医学杂志》，295，806-13页(1976))以及确定对某些疾病的个体素质的分型方法中。从遗传角度看HLA系统已被充分表征，它由位于6号染色体短臂上约2厘摩(CM)空间中的一系列有或多或少多态性的基因座组成。该系统中的三个基因座(HLA-A、HLA-B和HLA-C)编码一类共显性表达的同种抗原(I类)。另一区域(HLA-D)(它实际上含有几个基因)编码具有相当程度多态性的共显性表达的第二类同种抗原(II类)。特别控制补体系统C2、C4成分和Bf因子的几个其他基因座也属于HLA系统(III)类。器官移植的成功大多取决于受体和供体间的HLA一致性(I类和II类)，因此HLA的分型一定要尽量准确。这一要求主要涉及肾移植(P.J.Morris和A.Ting(1982)，《免疫学综述》66，103-G.Opelz(1989)《移植进展》，21，609-E.L.LAGAAIJ，P.H.Hennemann，M.Ruigrok等(1985)，《新英格兰医学杂志》，321，701)和骨髓移植(P.G.Beatty，R.A.Clift，E.M.Mickelson等(1985)《新英格兰医学杂志》313，765-J.M.Hows和B.A.Bradley(1990)《英国血液学杂志》76.1)。对于骨髓移植来说，II类HLA抗原的完全一致性是移植成功的关键因素，即避免移植物排斥或患移植物-宿主疾病(P.G.Beatty，J.Hanson，G.M.Long-ton等(1991)《移植》51，443-R.C.Ash，J.T.Casper，C.R.Chitamber等(1990)《新英格兰医学杂志》322，485-C.Anasetti，D.Amos，P.G.Beatty等(1989)《新英格兰医学杂志》320，197)。HLA-D区基因表达产物的多态性通常用血清学技术在分析HLA基因细胞表面表达产物的同种抗血清基础上来确定(J.J.VanRood和A.VanLeeuwen(1963)《临床调查杂志》42，1382-J.J.VanRood，A.VanLeeuwen，J.J.Koning，A.B.VanOudAblas(1975)《组织抗原》5，73)，其准确性和可重复性取决于所供血清的批次。但既使在最好的条件下，也有大量的等位基因不能由这些血清学技术检测到。血清学分析的这种局限性主要由以下原因造成缺乏单特异性同种抗血清，不能完全分辨紧密相关的特异性间的交叉反应性(例如DR3和DRw13)，或者II类HLA分子在细胞(例如白血病细胞)表面的表达改变。利用分子生物学现在了解到存在比以前设想的多得多的HLA基因，尤其是许多不同的等位基因。这种多样性现由不同基因和等位基因的DNA序列来表征。根据HLA命名委员会的最近报道(见，HLA系统因子的WHO命名委员会(1990)《免疫遗传学》31，131-和J.G.Bodmer，S.G.E.Marsh，E.D.Albert，W.F.Bodmer，B.Dupont，H.A.Erlich，B.Mach，W.R.Mayr，P.Parham，T.Sasazuki，G.M.T.Schrender，J.L.Strominger，A.Svejgaard和P.I.Terasaki(1991)《组织抗原》37，97)，II类HLA的多态性分布如下DRB1座47个等位基因，DRB3座4个等位基因，DRB4座1个等位基因，DRB5座4个等位基因，DQB1座17个等位基因，DQA1座13个等位基因，DPB1座21个等位基因，DPA1座4个等位基因。许多这些血清学分析遗漏的等位基因只有在DNA水平才能被识别。血清学分型的局限性可由DR4的血清特异性得到说明，它现在被分成11个亚型(DRB1*0401-0411)(见，J.G.Bodmer，S.G.E.Marsh，E.D.Albert，W.F.Bodmer，B.Dupont，H.A.Erlich，B.Mach，W.R.Mayr，P.Parham，T.Sasazuki，G.M.T.Schreuder，J.L.Stro-minger，A.Svejgaard和P.I.Terasaki(1991)《组织抗原》37，97)，这些只有在DNA序列水平才能识别。与之相似，DRw6的特异性可用几种同种抗血清进一步分为DRw13和DRw14，实际上它含有10个等位基因序列(DRB1*1301-1305和DRB1*1401-1405)(见上文引用的BodmerJ.G.的文章)，这些也只有用DNA序列进行基因型分析才能识别。基因型分析是一种在基因水平直接分析II类HLA系统多样性的新方法。基因型分析基于分子杂交的理论，提出的第一种方法是所谓的“RFLP”技术，即利用限制性酶将DNA切成片段，并分析由这些酶产生的特异DNA片段的大小(见，C.T.Wake，E.O.Long和B.Mach(1982)《自然》300，372-J.Bhme，M.Andersson，G.Andersson，E.Miller，P.A.Peterson和L.Rask(1985)《免疫学杂志》135，2149-J.L.Bidwell，E.A.Bidwen，D.A.Savage，D.Middle-ton，P.T.Klouda和B.A.Bradley(1988)《移植》45，640)。RFLP只能使部分血清学方法检不到的等位基因差异得以识别，这种技术仍有局限性。实际上，只有差别核苷酸位于分析中所用限制酶的识别位点时该方法才能识别带有不同序列的等位基因，因此将有大量II类HLA等位基因不能被这种分析方法所识别。而且，RFLP分析仅仅指出编码序列中的修饰，而不能提供关于这种修饰的确切性质的信息。最后，这一技术费时费力，因为它涉及相当大量的核酸用数种限制酶消化、电泳以及转移至滤膜。DR1、DR4、DRw8、DRw11或DRw13特异性的亚型不能由RFLP检测到，也可以说明RFLP技术的局限性。已提出了一种II类HLA基因型分析的新技术，该方法称为“用寡核苷酸分型”。由于对II类HLA基因的DNA序列的了解，尤其是迄今最具多态性的DRβ基因的DNA序列，人们可以利用对该基因序列中给定位置特异的寡核苷酸作为杂交方法分析多态性的示踪物。选择这些寡核苷酸使其具有最大可能的报道性，能根据序列不同鉴别不同的等位基因。实际上可以检测到任何序列差异，甚至单一核苷酸的差异。利用寡核苷酸的分型技术可以应用于DNA，如Angelini等的文章中所述，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83卷，4489-4493页(1986)，也可以应用于RNA(见，C.Ucla，J.J.VanRood，J.Gorski和B.Mach(1987)《临床调查杂志》80，1155)。这种新方法是基于利用核酸典型特征进行分子杂交的原理，这些特征是通过氢键与互补序列相互作用从而形成稳定的杂交体，其配对法则是已知的，即DNA中A-T，G-C和RNA中的A-U、G-C。这样，相应于已知等位基因DNA或RNA的合成寡核苷酸可用作探针，来检别样品中的含有与探针互补序列的称为靶标的核酸序列。标记靶标和探针间所形成的杂交体可以对样品中的靶标进行检测和定量。利用任何已知标记物，如酶的、化学的或放射活性的标记物进行这种标记。在这些原理的基础上，Angelini等在以上引用的文章中第一次提出了用寡核苷酸在II类HLA分型中的应用，其中利用所谓的“SOUTHERN”技术将靶DNA沉积在尼龙膜上，用标记的寡核苷酸探针进行检测。随后这一技术被用于检测常规血清法测不出的II类HLA等位基因(见，J.M.Tiercy，J.Gorski，M.Jean-net和B.Mach(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，198-J.M.Tier-cy，J.Gorski，H.Bétuel，A.C.Freidel，L.Gebhrer，M.Jeannet和B.Mach(1989)《人体免疫学》24，1)。对II类HLA分型的另一直接应用描述在专利申请PCTWO89/11547中，其中使用所谓的“斑点印迹”技术。所谓的“反向斑点印迹”法是这些技术的一种改良，它是将核苷酸探针结合在纸膜、硝基纤维素或两者的混合物上，用标记的靶标进行杂交检测。这一技术已用于HLA-DQA的分型和地中海1β-贫血突变的检测(R.K.Saiki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86卷，6230-6234页(1989))。如上文所述和以上引述的出版物和专利申请中解释的那样，细胞分型需要检测基因组中的点突变、涉及建立对检测和区分同源序列(单一核苷酸不同)足够敏感的探针，发现使用短探针是必需的，一般少于30个核苷酸，这些探针使试验具有很大的特异性同时保持良好的敏感性。短探针的使用使得具有广泛的选择性。对于涉及探针与固体载体结合的试验，存在小于30个核苷酸的短探针在这种固体载体上固定的问题。R.K.SAIKI等在上文所引述的文章中提出一种方法将400个碱基的多(dT)尾与含15-20个碱基探针的3′末端偶联，然后通过紫外线照射将探针借该尾固定在尼龙滤膜上，使胸腺嘧啶碱基与尼龙中存在的伯胺共价偶联。但这一方法还不能令人完全满意，因为存在特异性问题。事实上，探针的胸腺嘧啶碱基也能在紫外照射下与载体反应，从而使杂交的效力降低。另外，出于工业化原因，希望发展一种具有高特异性和良好灵敏性但操作简便、迅速、廉价、能够自动化并可用于个体分型的分型方法。现发现了一种测定个体HLA-DR基因型的新方法，该方法克服了上述缺点，但能检测并区分仅单一核苷酸区别的同源序列。利用一套选择的核苷酸探针实施本发明方法，使得用最小数目的探针实现分型。这一套探针尤其具有可以在单一温度下工作的优点，特别是在37℃下(如在下文实验部分将看到的，也可能在其他温度下工作)。这一套探针也形成本发明的一部分。本发明的该套探针(将在下文定义)可以以检测探针形式(用标准示踪剂标记)用于Southern类技术，或优选以捕捉探针形式(三明治或反向斑点印迹技术)使用并固定在固体载体上，固定方法为直接被动结合(吸附)或借助于配体如疏水性配体吸附(见，例如欧洲专利申请0,405,913)，或通过建立至少一个共价键，同样可为直接共价键或借助于能与载体共价结合的配体(见，例如专利申请PCTWO88/01,302)探针的固定化可用已知方法进行，或用以下文将描述的其他方法进行。本发明的探针(核苷酸探针)将主要以核苷酸序列的形式描述。本领域技术人员清楚，甚至对于在一定温度下检测点突变的探针，也可以设想一定范围内的各种长度(核苷酸数目)的探针，特别是借助于使用或多或少对杂交复合体稳定性有利的溶液和缓冲液。因而，本发明探针用一般认为是最长的序列来定义(特别是希望它在较低温度如37℃下工作时)，同时指明对在所述温度下仍可使用、甚至对点突变仍将敏感的最短序列。专业人员显然知道每个具体核苷酸探针有其相应的互补探针，后者自然能够起捕捉探针或检测探针的作用。因此本发明包括具有下文所述探针互补序列的探针。专业人员还清楚，一套探针中识别某一具体特异性X的某一探针一般可以由一个两探针系统来替代，其中之一识别特异性X和Y，另一个识别特异性X和Z，此时用XY探针和用XZ探针均为阳性反应则可推断存在特异性X。因此，本发明包括其中一个或多个探针被这种两探针或多探针的等价系统替代的探针系统，正如下文将要定义的。自然，这种系统组合可应用于两个以上的特异性。本发明涉及可用于HLADR类型测定的寡核苷酸分型技术的核苷酸探针，所述探针选自下列各种-TGGCAGCTTAAGTTT-CCTAAGAGGGAGTG-GCGAGTGTGGAACCT-AAGACAGGCGGGGC.上述四个序列分别编号为101、102、103和104。探针101识别DRB1*01型。探针102识别DRB1*02型。探针103识别DRB4*01型，及探针104识别DRB1*1305型。本发明进一步涉及包括选自探针101至104的至少一个探针的一套核苷酸探针或HLA分型试剂盒。本发明还涉及包括选自下列各种的至少一个探针的一套核苷酸探针-GTGGACAACTACTG-GATACTTCTATCACCAA-GCCTGATGAGGAGTAC-TGGCAGGGTAAGTATAAG-GGGCCCTGGTGGACA-TGCGGTATCTGCACA-GGAGGAGGTTAAGTT-CTGGAAGACGAGCG-TGGAAGACAAGCGG-TGCGGAGCACTGGA-AACCAGGAGGAGAACGTG-ACTCTACGGGTGAGTG-GACACCTATTGCAGAC-下划线的部分相当于最小序列。上述13个序列分别编号为105-117。在一优选实施方案中，探针111以其完全的形式使用，包括3′-末端的两个未划线的T。其特异性与探针45的相同。探针115优选以划线序列加上5′-末端未划线的两个A的形式使用。其特异性与探针28的相同。探针105-110、112-114、116和117优选以下文试验部分以编号43、9、10、14、17、44、46、48、47、24和27相称的探针形式使用。本发明特别涉及如上所定义的一套探针，其特征在于其还包括至少一种下列探针(划线部分相当于最佳序列)-GAGGAGGACTTGCGCT-TACGGGGCTGTGGAG-GGAGCTGCGTAAGT-TTCCTGGAGAGACAC-GGGAGAGATACTTCC.以上五个序列分别编号为118-122。所述序列特别以编号42、42bis、52、37和55的探针形式使用。上述特异探针尤其可用作捕捉探针或检测探针。它们优选以固定化或可固定在固体载体上的捕捉探针形式使用。本发明的主题还在于按标准寡核苷酸分型技术测定个体HLA-DRβ类型的方法，其中如上所定义的一套探针中至少部分探针相继地或同时用作捕捉探针或检测探针。在自动化方法中，同时使用这些成套探针。在其他情形下，显然可以一个接一个地使用这些探针，并在收集的信息足以分型时停止该方法。因而本发明的方法主要包括以下步骤--按照所选择的具体技术，使含有个体HLA-DR基因多态区的靶核酸样品与以上定义的一套探针中的至少一部分接触，--按已知方法在预定条件下保温，使每个探针的杂交只在靶标含有与所述探针完全互补的序列时才发生，及--按标准检测技术确定所用的每个探针杂交与否。然后用所收集的信息按预先建立的分型表确定类型，考虑所用探针和已知HLA-DR类型和/或相关亚型的列表来确定。使用分型表简化了这一工作，即按所观察到的阳性反应(杂交)，该表直接给出类型和/或亚型。对于本发明的此套探针，这种表在下文试验部分给出(见表6)。本发明尤其涉及其中所述探针用作捕捉探针的上述方法，该方法的特征在于其包括以下步骤a)将每个捕捉探针固定在固体载体上，b)在若靶标中存在与探针互补的序列则可杂交的条件下，使每个固定化捕捉探针与含有至少一种靶核酸片段的液体介质接触，及c)检测可能形成的任何杂交体的存在。当然，本发明探针可用于检测RNA和DNA的靶片段。而且显然可以使用上述探针以外的所有适当探针作为检测探针，尤其是下文实施例5中描述的探针之一。当捕捉探针非常短时，即小于20个核苷酸，特别是小于17个核苷酸，需要实施改善探针与固体结合的手段。这样探针与载体的结合是以探针与配体共价连接形成的衍生物形式进行的，所述配体能帮助与固体载体的结合。配体可以包含疏水部分，但尤其包含至少一种极性功能团，例如氨基。该功能团可通过建立共价键用于结合探针和固体载体。当极性功能团不与载体反应时，配体通过吸附于载体(甚至载体是疏水性的)来改进结合。配体例如选自蛋白质和分别由下式I和II代表的化合物其中Z代表含2-12个碳原子由一个或多个选自羟基和/或氨基的基团取代或未取代的直链或支链烷基或链烯基，M+尤其代表碱金属离子或铵离子。该配体优选与捕捉探针核苷酸序列的5′-末端连接；其中n为1-4的整数，优选n＝1或4。该配体优选与捕捉探针核苷酸序列的3′-末端连接。当配体为蛋白质时，例如选择白蛋白，优选牛血清白蛋白，它可以与捕捉探针核苷酸序列的5′或3′末端连接。本发明的载体可以是能使本发明的核苷酸序列或衍生物通过被动吸附或共价结合而固定化的任何载体。该载体可由常用材料制得，例如硝基纤维素、尼龙、纸、或优选使用疏水性材料，如苯乙烯聚合物或含10％(重量)苯乙烯单位的苯乙烯共聚物。本发明固体载体例如可以是如下形式微滴定板、片状、管状、锥形、孔状等。按照本发明方法，含核酸的样品得自其HLA-DR基因型待测的个体。含HLA-DR核酸的任何类型的组织均可用于本发明。例如可以使用个体样品中的核酸经化学方法、酶法或其他方法裂解后所得核酸(DNA或RNA)片段。但是增加先期进行的靶DNA或RNA扩增步骤对本发明的寡核苷酸分型法有利。虽然通过序列特异性寡核苷酸杂交分析HLA多态性的原理仍相同，但选择性的扩增步骤使靶序列富集，从而简化了该技术(R.K.Saiki，T.L.Bugawan，G.T.Horn，K.B.Mullis和H.A.Erlich(1986)《自然》324，163-J.M.Tiercy，M.Jeannet和B.Mach(1990)《欧洲免疫学杂志》20，237)。可以从DNA或从RNA进行扩增。本领域技术人员清楚，样品中HLA-DR靶序列的扩增可按任何已知方法进行，该方法使序列足量扩增以使得通过核酸与探针的杂交能够检测出靶序列。样品中核酸一般为DNA，通常为基因组DNA。但用其他核酸如信使RNA或克隆的DNA也可以实施本及明，而且个体样品中的核酸可以是单链或双链形式。当然，如果核酸是双链形式则需要进行变性步骤以获得单链核酸。本发明中所使用的探针是序列特异性寡核苷酸(SSO)，在适当条件下能与其互补序列特异性结合。如果一种具体探针可用于识别一种独特的等位基因，则称该探针为ASO，即等位基因特异性寡核苷酸。由于各种DRβ等位基因间的不同性质，单一探针自身可能无法识别一种DRβ特异性等位基因。根据本发明方法，从一套探针的结合模式来推断等位基因的身份，其中每个单一探针对HLA-DR基因的不同部分特异。选择对应于已知等位基因DNA序列的多个探针的结果是，本发明寡核苷酸分型方法的特异性使得可以识别DRB1、DRB3和DRB5基因座的所有等位基因。当然，本发明方法可能用于识别其他极端多态性基因座如DQB1和DPB1的等位基因。因为等位基因差异主要位于编码HLA分子第一功能区(aa5-94)的外显子中，选择与该区域中特异序列互补的探针。如果有新的等位基因被发现，就立即将其列在II类HLA序列的登记表中，这使得报道性示踪物的集合不断更新，因而本方法适于检测任何新的等位基因。为了使II类HLA完全分型法合理化，已提出首先用有限数目的探针进行第一步DR属分型，这可以识别主要HLA-DR特异性，即HLA-DR1-DRw18。这一步骤对许多临床应用已经足够了(见B.Mach和J.M.Tiercy(1991)《人体免疫学》30，278)。在这第一步结果的基础上，第二步可能选择出产生DRβ微多态性、检测DQB1多态性和需要时鉴定DPB1等位基因所需的特异性探针。用寡核苷酸分型技术对HLA-DR1-DRw18特异性的分析，可以代替DR血清学方法用于组织相容性实验室进行常规的DR分型，特别是进行肾移植等待者名单中病人的DR分型或潜在肾提供者的分型，计划进行骨髓移植的白血病病人、其家庭成员或无关的潜在提供者的DR分型，对登记志愿捐献骨髓者的大量DR分型，用于在例如胰岛素依赖性糖尿病中确定疾病与HLA系统的联系，应用于预见医学或者用于亲子鉴定试验中和其他法医鉴定中。以下是本申请中所用几个术语的定义“基因型”指个体的一系列基因方面的特征，与“表现型”相反，后者包括分析基因表达产物(尤其是蛋白质)而呈现的个体特征。“等位基因”指相同基因的不同形式，它们在核酸序列中存在差异。这些差异表现在DNA、RNA和蛋白质中。“多态性”表示由于相同基因存在不同等位基因而引起的人群中的多样性。本文所用“寡核苷酸”指引物、探针、待检测的核酸片段等。可用任何适当的已知方法制备这些寡核苷酸。“核苷酸探针”指天然DNA或RNA片段，或天然或合成的寡核苷酸，或合成的DNA或RNA片段，可以是未修饰的也可以含有一人或多个修饰碱基如肌苷(用字母I代表)、5-甲基脱氧胞苷、5-(二甲氨基)-脱氧尿苷、脱氧尿苷、2，6-二氨基嘌呤、5-溴脱氧尿苷或其他能杂交的修饰碱基。另外，在本申请中，当捕捉探针的序列有下划线时，这代表用于本发明分型方法的最佳序列。当然，这些最佳序列可以在3′和/或5′末端延长至少一个碱基。这种情况下，这些可以任意增加的碱基示于括号中，这例如可以在阅读以下的描述时看到。最后，本领域技术人员可以根据工作条件(诸如杂交和洗涤温度、杂交缓中液和/或洗涤缓冲液的性质)和分型表来改变所用序列的长度。以下非限定性实施例说明本发明方法的优选实施方案，在阅读了以下参照实施例的详细说明后将会更好地理解本发明。实施例1这里举例给出的本发明所用配体可以是市售的化合物，如下表1中所示表1NMTr＝单甲氧基三苯甲基DMTr＝二甲氧基三苯甲基Fmoc＝9-芴基甲氧基羰基CPG＝控孔玻璃珠LCAA＝长链烷基胺(间隔臂)按照下述一般操作方法进行氨基磷酸酯(phosphoramidite)配体与寡核苷酸的连接按照制造商的说明，在应用生物系统公司(APPLIEDBIOSY-SEMS)自动合成仪381A上用氨基磷酸酯化学方法合成寡核苷酸。将氨基磷酸酯配体溶解在无水乙腈中达0.2M的浓度，并置于合成仪的X位，当寡核苷酸的合成结束时，按照标准的自动合成方法在寡核苷酸的5′-端加上配体。当配体带有二甲氧基三苯甲基保护基时(如对于化合物d)，合成结束后还需要用三氯乙酸脱去三苯甲基的脱保护步骤。在33％NH4OH中55℃脱保护过夜，然后在-20℃乙醇中沉淀后，真空干燥寡核苷酸并溶于1ml水中。对于代号为b和c的化合物，脱保护后按制造商(分别为CLONTECH和GLEN)的说明另外进行一步单甲氧基三苯甲基的裂解步骤。对于代号为e和f的化合物，按标准方法从与二氧化硅连接的配体开始自动合成。配体与寡核苷酸的连接通过寡核苷酸的3′-末端进行。在5′或3′末端修饰的寡核苷酸均在BrownleeRP18柱(10mm×25cm)上经反相高压液相色谱(HPLC)纯化。条件流速4.6ml/分梯度30分钟内10％-30％的缓中液B。3分钟内35％-100％的缓冲液B。缓中液A和B的性质如下缓冲液A0.1M醋酸三乙基铵(TEAA)，pH7.00缓冲液B50％缓中液A+50％CH3CN。实施例2寡核苷酸与牛血清白蛋白(BSA)的连接如实施例1中所述合成了带有氨基连结臂2(在表1中代号为a)的寡核苷酸将3×10-8mol寡核苷酸真空干燥并溶解在0.1M硼酸钠缓中液(pH9.3)25μl中，加入含30mg/mlDITC(1，4-亚苯基二异硫氰酸酯，Fluka78480)的DMF溶液500μl。加入3ml水后室温下搅拌该混合物1.5小时。用丁醇(3×3ml)提取该溶液后，将剩余水相(500μl)真空干燥，然后与400μl硼酸盐缓中液(0.1M，pH9.3)中的1×10-7mol(6.6mg)BSA(Pierce30444)混合。室温下搅拌过夜后，偶联物在AX300柱(BROWNLEE4.6×100mm)上用NaCl梯度进行离子交换HPLC而纯化(表1)。将偶联物峰洗脱液对水(2×1升)透析，真空浓缩，溶于1ml水中于-20℃保存。色谱条件梯度25分钟内10％-56％缓冲液B′2分钟内56-100％缓冲液B′。缓冲液A′和B′的性质A′＝20mM磷酸钠，pH7.00/20％CH3CNB′＝缓冲液A′+1MNaCl或2MNaCl。实施例3表2显示DRβ基因不同等位基因的氨基酸排列对比，以表明突变氨基酸相对于选定保守序列(称为“DRCONS”)的位置。这些突变相应于DNA中的非沉默突变，即引起氨基酸变化的突变。实际上已知DNA中三联碱基将要编码的氨基酸。在第三位的突变一般不引起氨基酸的变化，而第二碱基的改变很可能引起氨基酸的改变，第一碱基的突变总是引起氨基酸的变化。因而在不同等位基因的分型中，相应于非沉默突变的DNA突变最常用。但检测沉默型突变也是可能的，例如为了区分两个密切相关的等位基因。表3显示了所有迄今已知和文献中出版的等位基因的DRβ基因核苷酸排列对比(相对表2中的相同保守序列)。用于指称不同等位基因的命名规则是由第五次组织相容性会议上提出的(Leiden，荷兰，1991)。表2中括号中的代号是以前的命名。表2102030405060708090*****************DRCONSPRFLEQxKSECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEEYVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQRRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRDRB1*0101(Dw1)----W-L-F------------L-E-CI-----S----------------------------------------------------------DRB1*0102(Dw20)----W-L-F------------L-E-CI-----S------------------------------------------------AV--------DRB1*0103(DwBON)----W-L-F------------L-E-CI-----S------------------------------I--DE-----------------------DRB1*1501(Dw2)----W-P-R-----------------------S----------F-------------------I---A--------------V--------DRB1*1502(Dw12)----W-P-R-----------------------S----------F-------------------I---A-----------------------DRB1*1601(DW21)----W-P-R-----------------------S------------------------------F--D------------------------DRB1*1602(Dw22)----W-P-R-----------------------S------------------------------L--D------------------------DRB1*0301(DRw17)-----YST-------------Y-----H----N----------F-----------------------K-GR--N--------V--------DRB1*0302(DRw18)-----YST---------------E---H----N----------------------------------K-GR--N-----------------DRB1*0401(Dw4)------V-H-------------------H--------------------------------------K-----------------------DRB1*0402(Dw10)------V-H-------------------H----------------------------------I--DE--------------V--------DRB1*0403(Dw13TAS------V-H-------------------H-----------------------------------------E-----------V--------DRB1*0404(Dw14)------V-H-------------------H-----------------------------------------------------V--------DRB1*0405(Dw15)------V-H-------------------H-----------------------S--------------------------------------DRB1*0406(KT2)------V-H-------------------H---S-------------------------------------E-----------V--------DRB1*0407(Dw13JHA------V-H-------------------H-----------------------------------------E--------------------DRB1*0408------V-H-------------------H--------------------------------------------------------------DRB1*0409------V-H-------------------H-----------------------S--------------K-----------------------DRB1*0410-----------------H-----------------------S-----------------------------V-DRB1*0411-----------------H-----------------------S-----------------E-----------V-DRB1*0701(Dw17)----W-G-YK----------Q--E-L------F-------------------V--S------I--D--GQ---V-----------------DRB1*0702(DB1)----W-G-YK----------Q--E-L------F-------------------V--S------I--D--GQ---V-----------------DRB1*0801(MADURA)-----YSTG--Y----------------------------------------S---------F--D---L-------------DRB1*0802(SPL)-----YSTG--Y--------------------------------------------------F--D---L---------------------DRB1*0803(TAB)-----YSTG--Y----------------------------------------S---------I--D---L---------------------DRB1*0804-----YSTG--Y--------------------------------------------------F--D---L-------------V-------DRB1*0901(Dw23)--------Y-H-GI-----N-------------------V--S------F--R---E---V-----------------DRB1*1001-----EV-F------------L-E-RVH-----A-Y-----------------------------R-------------------------DRB1*1101(SVEIG)-----YST----------------------------------F----------E--------F--D-------------------------DRB1*1102(JVM)-----YST----------------------------------F----------E--------I--DE---------------V--------表2(续)102030405060708090*****************DRCONSPRFLEQxKSECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEEYVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQRRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRDRB1*1103(UA-S2)-----YST-----------------------------------F----------E--------F--DE--------------V--------DRB1*1104(TUBO)-----YST-----------------------------------F----------E--------F--D---------------V--------DRB1*1201(HERLUF)-----YSTG--Y--------------H-H----LL--------F---------V--S------I--D--------------AV--------DRB1*1202-----YSTG--Y--------------H-H----LL--------F---------V--S------F--D--------------AV--------DRB1*1301(HHK)-YST--------------------H----N---------F-------------------I--DE--------------V--------DRB1*1302(WT46)-----YST--------------------H----N---------F-------------------I--DE-----------------------DRB1*1303(HAG)-----YST---------------------------------------------S---------I--DK-----------------------DRB1*1304YST-----YST-----------------------------------F---------S---------I--DE--------------V--------DRB1*1305(DES.DI)-----YST--------------------H----N---------F-------------------F--D------------------DRB1*1401(TEM)-----YST--------------------H----F-------------------A--H---------R---E-----------V--------DRB1*1402(AMALA)-----YST----------------E---H----N---------------------------------------------------------DRB1*1403(J×6)-----YST----------------E---H----N--------------------------------D---L--------------------DRB1*1404-----YSTG-------------------H----F-------------------A--H---------R---E-----------V--------DRB1*1405---YST---Q----------------H----F--------------------------------R---E-----------V-DRB3*0101(52a)-----LR---------------Y-----H----FL------------------V--S----------K-GR--N-----------------DRB3*0201(52b1)-----LL-----------------E-H-H-----A------------R-------------------K-GQ--N--------V--------DRB3*0202(52b2)-----LL-----------------E-H-H-----A------------R-------------------K-GQ--N-----------------DRB3*0301(52c)-----LL-----------------E---H----F-------------------V--S----------K-GQ--N--------V--------DRB4*0101------A-C----L-------WN-I--I------A-YN--L---Q---------------------R---E------Y----V--------DRB5*0101(Dw2)----Q-D-Y---------------H-DI-----DL----------------------------F--D------------------------DRB5*0102(Dw12)----Q-D-Y---------------H-GI-----N-----------------------------F--D------------------------DRB5*0201(Dw21)----Q-D-Y---------------H-GI-----N-----------------------------I---A-------------AV--------DRB5*0202(Dw22)----Q-D-Y---------------H-GI-----N-----------------------------I---A-------------AV--------表31015202530354045RFLEQXKSECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEEYVRFDSDVGEYRADRconsCACGTTTCTTGGAGCAGxxTAAGTCTGAGTGTCATTTCTTCAATGGGACGGAGCGGGTGCGGTTCCTGGACAGATACTTCTATAACCAGGAGGAGTACGTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTACCGGGCGDRB3*0101---------------T-CG----------------------------------------------A----------------C---------------T-C---------------------------------DRB3*0201---------------T-CT-----------------------------------------------------G---C-----C------------------CDRB3*0202---------------T-CT-----------------------------------------------------G---C-----C------------------CDRB3*0301---------------T-CT-----------------------------------------------------G---------C---------------TDRB1*0301--------------T-CTC--C-------------------------------------------A----------------C--------------A------------------------------T-----DRB1*0302--------------T-CTC--C--------------------------------------------------G---------C--------A------------------------------------DRB1*1101--------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A----------------------------------------T-----DRB1*1102--------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A----------------------------------------T-----DRB1*1103--------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A----------------------------------------T-----DRB1*1104--------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A----------------------------------------T-----DRB1*1201--------------T-CTC--C-GG-------T--------------------------------A------G---C------------------CT-C-----------------------------T-----DRB1*1202--------------T-CTC--C-GG-------T--------------------------------A------G---C------------------CT-C-----------------------------T-----DRB1*1301--------------T-CTC--C-------------------------------------------------------------C-----------A--------------------------------T-----DRB1*1302--------------T-CTC--C-------------------------------------------------------------C-----------A--------------------------------T-----DRB1*1303--------------T-CTC--C--------------------------------------------------------------------A-------------------------------------------DRB1*1304--------------T-CTC--C--------------------------------------------------------------------A-------------------------------------------DRB1*1305--------------T-CTC--C-------------------------------------------------------------C-----------A--------------------------------T-----DRB1*1401--------------T-CTC--C-------------------------------------------------------------C------------T-------------------------------------DRB1*1402--------------T-CTC--C--------------------------------------------------G----------C-----------A--------------------------------------DRB1*1403--------------T-CTC--C--------------------------------------------------G----------C-----------A--------------------------------------DRB1*1404--------------T-CTC--C-GG-------T--------------------------------------------------C------------T-------------------------------------DRB1*1405--------------T-CTC--C------------A------------------------------------------------C------------T-------------------------------------DRB1*0801--------------T-CTC--C-GG-------T-----------------------------------------------------------A-----------------------------------------DRB1*0802--------------T-CTC--C-GG-------T-----------------------------------------------------------A-----------------------------------------DRB1*0803--------------T-CTC--C-GG-------T-----------------------------------------------------------A-----A-----------------------------------DRB1*0804--------------T-CTC--C-GG-------T-----------------------------------------------------------A-----------------------------------------DRB1*04-----------------GT---ACA------------------C-------------------------------------------C----A-----------------------------------------DRB1*0406-----------------GT---ACA------------------C-------------------------------------------C----A-------C---------------------------------DRB4*0101-----------------GC-----G-------------C-----------------A---T--AA----AT-------A-------------A---------C-----A-A----T---C-----------A--DRB1*07--------C--TG----GG-----A-A----------------C-----------------A---------A---CT----------------------T----------------------------------DRB1*0901-----C--------------------AT---C-----GG-A-------------A-----A-----------------------------------DRB1*1001--------------G--GT-----T------------------C---------------------G-----A---CG-G--C----------A---------C-----A---------------DRB1*0101-----------TG----CT-----T---A------------------------------------G-----A----G-A-------------A------C------------------------DRB1*0102-----------TG----CT-----T---A------------------------------------G-----A----G-A-------------A------C------------------------DRB1*0103-----------TG----CT-----T---A------------------------------------G-----A----G-A-------------A------C------------------------DRB5*0101-----------C-----GA-----A------------------C-------------------------C-----G--A-------------A-----G--T----------------------DRB5*0102-----------C-----GA-----A------------------C-------------------------------GG-A-------------A-----A-------------------------DRB5*0201/02-----------C-----GA-----A------------------C-------------------------C-----GG-A-------------A-----A-------------------------DRB1*1501-------C--TG-----CC----AGG-------------------------------------------------------------------C------------------------T-----DRB1*1502-------C--TG-----CC----AGG-------------------------------------------------------------------C------------------------T-----DRB1*1601-------C--TG-----CC----AGG-------------------------------------------------------------------C------------------------------DRB1*1602-------C--TG-----CC----AGG-------------------------------------------------------------------C------------------------------表3(续)505560657075808590VTELGRPDAEYWNSQKDLLEQ×RA×VDTYCRHNYGVGESFTVQRRDRconsGTGACGGAGCTGGGGCGGCCTGATGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGACCTCCTGGAGCAGA×GCGGGCCG×GGTCGACACCTACTGCAGACACAACTACGGGGTTGGTGAGAGCTTCACAGTGCAGCGGCGADRB3*0101----------------------TC-------C--------------------------------A------G-CG---------AT------------------------------------------------DRB3*0201----G-----------------------------------------------------------A------G-CA---------AT-------------------------TG---------------------DRB3*0202----G-----------------------------------------------------------A------G-CA---------AT------------------------------------------------DRB3*0301----------------------TC-------C--------------------------------A------G-CA---------AT-------------------------TG---------------------DRB1*0301----------------------------------------------------------------A------G-CG---------A--------------------------TG---------------------DRB1*0302----------------------------------------------------------------A------G-CG---------A-------------------------------------------------DRB1*1101-------------------------AG------------------------T-------AG-C-G---------C-----------------------------------------------------------DRB1*1102-------------------------AG------------------------A-------AG-CGA---------C------------------------------------TG---------------------DRB1*1103-------------------------AG------------------------T-------AG-CGA---------C------------------------------------TG---------------------DRB1*1104-------------------------AG------------------------T-------AG-C-G---------C------------------------------------TG---------------------DRB1*1201----------------------TC-------C-------------------A-------AG-C-G---C-----C------------T--------------------C--TG---------------------DRB1*1202----------------------TC-------C-------------------T-------AG-C-G---C-----C------------T--------------------C--TG---------------------DRB1*1301---------------------------------------------------A-------AG-CGA---------C------------------------------------TG---------------------DRB1*1302---------------------------------------------------A-------AG-CGA---------C-----------------------------------------------------------DRB1*1303---------------------AGC---------------------------A-------AG-C-A---------C-------------------------------------------------G---------DRB1*1304---------------------AGC---------------------------A-------AG-CGA---------C------------------------------------TG---------------------DRB1*1305---------------------------------------------------T-------AG-C-G---------C-----------------------------------------------------------DRB1*1401----------------------C---G---C------------------------------G--G---------A------------T-----------------------TG---------------------DRB1*1402----------------------------------------------------------------G---------C-----------------------------------------------------------DRB1*1403---------------------AGC-----------------------------------AG-C-G---------CT----------------------------------------------------------DRB1*1404----------------------C---G---C------------------------------G--G----------A-----------T-----------------------TG---------------------DRB1*1405--------------------------T----------------------------------G--G----------A-----------T-----------------------TG---------------------DRB1*0801---------------------AGC---------------------------T-------AG-C-G---------CT----------------------------------------------------------DRB1*0802---------------------------------------------------T-------AG-C-G---------CT------------------------------------------------G---------DRB1*0803---------------------AGC---------------------------A-------AG-C-G---------CT----------------------------------------------------------DRB1*0804---------------------------------------------------T-------AG-C-G---------CT-----------------------------------TG---------------------DRB1*0401----------------------------------------------------------------A----------C----------------------------------------------------------0402---------------------------------------------------A-------AG-CGA----------C-----------------------------------TG---------------------0403----------------------------------------------------------------G----------A-----------------------------------TG---------------------0404----------------------------------------------------------------G----------C-----------------------------------TG---------------------0405---------------------AGC----------------------------------------G----------C----------------------------------------------------------0406----------------------------------------------G----------A-----------------------------------------------------TG---------------------0407----------------------------------------------------------------G----------A----------------------------------------------------------0408----------------------------------------------------------------G----------C----------------------------------------------------------DRB4*0101-----------------------C--T----------------------------------G--G----------A-------------------T---------------TG---------------------DRB1*07-----------A----------TC-------C--------------A-------------G-C-G-------G-CA----------GTG---------------------------------------------DRB1*0901----------------------T--------C--------------T--------------G--G----------A----------GTG------------------------------------------A--DRB1*1001-------------------------------------------------------------G--G---T------C----------------------------------------------------------DRB1*0101----------------------------------------------------------------G----------C----------------------------------------------------------DRB1*0102----------------------------------------------------------------G----------C--------------------------------C--TG---------------------DRB1*0103----------------------------------------------A------------AG-C-G----------C----------------------------------------------------------DRB5*0101-----------------------C--T-------------------T------------AG-C-G---C------C-------------------------------------------------------------DRB5*0102-----------------------C--T-------------------T------------AG-C-G---C------C-------------------------------------------------------------DRB5*0201/02-----------------------C--T-------------------A----------------GC----------C-----------------------------------C--TG---------------------DRB1*1501-----------------------C--T-------------------A----------------GC----------C--------------------------------------TG---------------------qDRB1*1502-----------------------C--T-------------------A----------------GC----------C-------------------------------------------------------------DRB1*1601-----------------------C--T-------------------T------------AG-C-G---C------C-------------------------------------------------------------DRB1*1602-----------------------C--T--------------------------------AG-C-G---C------C-------------------------------------------------------------实施例4利用上述两种途径，合成的寡核苷酸要么如实施例1中所述带有配体并列在表4中，要么如实施例2中所述与BSA连接并列在表5中。表4</tables>**X代表按前文表1中所用命名系统的配体，**tr表示在实施例1中所述条件(BROWNLEERP18柱(4.6mm×25cm)，流速1m1/分)下，寡核苷酸的HPLC保留时间(分)。***序列33，34和34bis中的字母I代表肌苷。表5*TR表示在实施例2中所述条件下与BSA相连寡核苷酸的HPLC保留时间(分)。(1M)指缓中液B含1MNaCl(2M)指缓冲液B含2MNaCl。**按应用生物系统(APPLIEDBIOSYSEMS)公司的说明，通过测定260nm处的吸光度用紫外光度法以皮可摩尔对寡核苷酸定量。用BRADFORD法(BRADFORDM.M.，分析生物化学，72，248(1976))以皮可摩尔测定BSA。oligo/BSA比是这两个值之比。在本实施例中建立了捕捉探针寡核苷酸，它们可以以不带配体或带有配体或与例如BSA连接的形式来合成。这种合成寡核苷酸序列的选择要考虑实施例3表3中所述不同等位基因DNA序列的排列对比。利用选择用作例如捕捉探针的这些寡核苷酸能够建立一种分型表，如表6中所示。对本领域技术人员来说，很显然用其他寡核苷酸可以建立其他分型表。表6<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="1284">探针1543910141744454648472824275237554242bis类别DRB1*0101DRB1*0102DRB1*0103+++++DRB5*0101DRB5*0102DRB5*0201/0202+++++DRB1*0301DRB1*0302+++ou+++++DRB1*0401-0412DRB1*0402+++DRB1*1101/1104DRB1*1102/1103+++++DRB1*12001/1202++++DRB1*1301DRB1*1302DRB1*1303DRB1*1304DRB1*1305+++ou++++++++++DRB1*1401DRB1*1402DRB1*1403DRB1*1404DRB1*1405++++++++++++++++DRB1*0701/0702+DRB1*0801-0804++DRB1*0901+DRB1*1001+</table></tables>表6中括号中的代号是1991年组织相容性会议前对DRB5等位基因亚型的命名。十号意指表6中该行的亚型与相应列中的探针杂交。利用表6可以很容易地解析各种探针所得结果(杂交或不杂交)，例如用探针43、14、28和37得阳性反应的靶标相应于DRB1*0301/DRB1*07型。实施例5检测探针的制备按照实施例2，活化并真空干燥的寡核苷酸与0.1M硼酸钠缓冲液(pH9.3)200μl中的1.25×10-7mol(5mg)辣根过氧化物酶(BOEHRINGERMANHEIM413470)混合。纯化方法相同偶联物保存在-20℃50mMTris-HCl缓中液，pH7.0，40％甘油中。表7中列出了用于HLA-DR检测的不同偶联物。</tables>*Tr表示在实施例2中所述条件下与辣根过氧化物酶(HRP)相连寡核苷酸的HPLC保留时间(分)。(2M)指缓冲液B含有2MNaCl。**按应用生物系统公司的说明，通过测定260nM处的吸光度用紫外光度法以皮可摩尔定量寡核苷酸。按ATORM.A.，《生物学化学杂志》，31，14954(1987)的方法在402nM处检测辣根过氧化物酶。oligo/HRP比是这两个值之比。***序列D2中的字母I指肌苷。序列D1中的(GT)指在该位置存在G和T两种碱基的等摩尔混合物。实施例6遗传材料的制备按以下实验方法在应用生物系统仪器上从全血提取核酸将2-6ml全血加在TE缓中液(10mMTris-HCl，pH8.00，1mMED-TA)(加足至6m1)中并置于30ml萃液漏斗中。加入蛋白酶K的溶液(840单位，20mMTris-HCl，pH8.5中)。整个混合物在55℃搅拌保温1小时。用苯酚/氯仿混合物同时萃取(8.5ml)2次除去存在的过量蛋白。于60℃搅拌混合物20分钟，除去有机相后再进行苯酚萃取。37℃下用氯仿(9.5ml)提取10分钟除去过量的苯酚。加入0.5ml3M醋酸钠(pH5.5)和13.5ml异丙醇沉淀水相中的DNA，然后回收在滤膜上。然后将DNA溶在1ml蒸馏水中，在260nM处分光光度法检测。实施例7DNA扩增按照下述步骤用聚合酶链反应(PCR)技术(MULLIS和FALOONA《酶学方法》155卷，335-350页)进行酶法扩增将总体积100μl下述缓冲液中的0.1-0.2μg纯化或未纯化的DNA加入Eppendorf管中-10倍浓缩的PCR缓冲液10μl(500mMKCl、100mMTris-HCl、pH8.3(20℃)、15mMMgCl2、0.1％明胶)-0.5μMdNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)2μl-相当于25pmol的每种引物2μl-Taq聚合酶(PerkinElmerCétus)1.5单位-蒸馏水(加足至100μl)-石蜡油50μl将此管置于热循环仪(Thermocycler，PerkinElnerCétus)中，在其中进行如下温度循环35个-95℃变性0.5分钟-55℃杂交0.5分钟-72℃延伸0.5分钟所用引物具有下列序列引物1＝5′-CCGGATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3′引物2＝5-TCGCCGCTGCACTGTGAAG-3′实施例8将给定DR特异性的捕捉探针寡核苷酸在3×PBS(0.45MNaCl、0.15M磷酸钠，pH7.0)中的0.15μM浓度的溶液100μl置于聚苯乙烯微滴定板(Nunc439454)的一个孔中。填充的孔数等于分型所需数目。每次都应加入阳性对照以检验扩增步骤以及检测步骤的效力。用作阳性对照的捕捉探针存在于迄今已知的所有等位基因上，并具有下述序列5′-GGGGAGTACCGGGCGGTGACGGAGCTGGGGCGGCCT-3′用PBS/吐温300μl(0.15MNaCl、0.05M磷酸钠、pH7.0；0.5％吐温20(Merek822184))洗板3次。如实施例7中所述的扩增产物(100μl)与2NNaOH10μl室温下搅拌5分钟进行变性。向此溶液中相继加入2N醋酸10μl和体积等于n×50μl(n是分型所需捕捉探针的数目)的PEG缓中液(0.1M磷酸钠，pH7.0，0.5MNaCl，0.65％吐温20，0.14mg/ml鲑鱼精子DNA(SigmaD9156)，2％PEG4000(Merck807490))。每孔中分配该溶液50μl，然后加入PEG缓中液中15nM浓度的检测探针(寡核苷酸-过氧化物酶偶联物)50μl。该板在37℃下保温1小时，用3×300μlPBS/吐温洗涤。向每孔中加入OPD缓冲液(0.05M柠檬酸，0.1MNa2HPO4，pH4.93)中4mg/mlOPD底物(邻苯二胺，剑桥医学生物技术货号/456)100μl(临用前向其中加入30体积稀释度为1/1000的H2O2)。反应20分钟后，用1NH2SO4100μl封阻酶活性，在Axia微读数器(bioMérieux)上读取492nm处的读数。实施例9按实施例6中描述的方法制备的6种DNA用实施例7中所述方法扩增。分型操作中包括下列捕捉探针5′a-GATACTTCTATCACC3′＝在5′末端带有配体的DR3特异性的寡核苷酸(编号545)，5′GATACTTCTATCACC3′＝不带配体的相同序列的寡核苷酸(编号545nu)，5′a-TGGACAACTACTG3′＝5′-末端带有配体的DR4特异性的寡核苷酸(编号546)，5′TGGACAACTACTG3′＝不带配体的相同序列的寡核苷酸(编号546nu)。按照实施例8中所述一般方法进行分型操作。探针D1和D2(表7)的50％/50％混合物用作检测探针。结果示于下表8中表8不带配体的两个探针没能区分这些DNA的特异性，而带有配体a的相同序列能够鉴别这些DNA的DR2和DR4特异性。实施例10按实施例6所述方法制备的24种DNA用实施例7中所述方法扩增。按照实施例8中所述一般方法进行分型操作。探针D1和D2(表7)的50％/50％混合物用作检测探针。在分型操作中包含下表9中所列的捕捉探针。表9</tables>分型结果示于表10中表10探针154391014174445464847OLIGON°563603571-BSA545398591595574-BSA556-BSA555-BSA867-BSA756-BSADNA编号580,0170,0250,7180,0130,0291,0060,0720,0330,0220,0180,0150,016590,5090,0240,0360,0160,0290,9290,0720,0310,0250,0180,0370,018630,0140,0210,0300,0110,0240,0500,0300,0330,023＞2,5000,0160,024660,0120,0270,0660,0150,0230,9920,0980,0310,0240,0220,0600,016670,4680,0890,0350,042＞2,5000,0540,0300,0320,028＞2,5000,0420,015680,0170,0490,0370,0250,0170,8260,0680,0310,024＞2,5000,1200,016700,5040,0180,0270,0200,0760,0160,0170,0330,0310,0170,0701,674710,0110,0170,0310,025＞2,5000,0190,0300,0320,030＞2,5000,0200,021720,4591,3730,0460,0250,0310,0850,0150,0440,0370,0170,0170,019730,3530,8900,0340,0180,0160,0480,0210,0440,0340,0190,0150,017750,0190,0520,6251,1130,0440,0430,0230,0330,0380,0190,0180,017780,0150,0370,6250,0150,0320,5890,0460,0340,0310,0150,0480,019790,0140,0120,4250,0130,0300,0100,0150,0330,028＞2,5000,0390,017800,0180,7520,0410,0250,0160,4480,0400,0450,0300,0210,0360,016830,0140,9590,0300,0220,0170,0420,5360,0500,0280,0730,0230,021840,0070,0130,0230,3990,0150,0130,0140,0310,0281,2100,0420,016850,0150,0130,4680,0140,0100,0180,0160,0760,034＞2,5000,0120,019860,0190,7470,0350,9390,0230,0560,0180,0410,0290,0210,0700,021870,0161,1900,0350,0160,0130,0460,0140,0430,029＞2,5000,0250,019890,0120,0320,0260,9560,0150,0210,0180,0320,0280,0170,0140,019900,3550,0350,0311,0280,0420,0380,0230,0350,0360,0170,0160,022910,8660,0080,0160,0140,0400,0360,0150,0140,0320,0200,0180,019920,4010,0150,0190,0130,0100,0120,0260,0210,0190,0180,0140,025950,0100,0110,0480,0370,0100,0170,0230,0420,0161,9311,9730,024</table>表3Δn×d(μm)反射率(％)比较例0.3020.80.3222.20.3423.2实施例0.3623.70.3824.10.4024.30.4224.30.4424.20.4624.00.4823.90.5023.5比较例0.5223.20.5422.90.5622.7</table></tables>所述方法使我们对24种试验DNA进行了清楚无疑的分类。实施例11本发明中所述HLA-DR分型方法中的优选杂交温度为37℃。但这一杂交温度可以改变。下述实施例与实施例10相同，只是杂交温度从37℃改为45℃。对11种DNA进行分型。所用的捕捉探针示于下表11中表11</tables>分型结果示于表12中</tables>实施例12如实施例8中所述，HLA-DR分型中所用的优选杂交缓冲液(称为PEG缓冲液)具有如下组成0.1M磷酸钠，pH7，0.5MNaCl，0.65％吐温20，0.14mg/ml鲑鱼精子DNA(SigmaD9156)，2％PEG4000(Merck807490)。使用了含有甲酰胺(终浓度10％)的相同缓中液。已知甲酰胺能使杂交温度降低。如果在甲酰胺存在下仍在37℃下进行杂交，则检测特异性应提高。对实施例10中所述的24种DNA进行分型。所用的捕捉探针和所得值示于下表13中。表13表13(续)<tablesid="table13"num="013"><tablewidth="1215">探针282427523742OLIGON°80210661068997-BSA10331060对照+DNA编号DNA编号分类580,0360,0050,0010,0040,2070,009＞2,50058DRB1*0301/DRB1*07DRB1*0101-0102/DRB1*07DRB1*12/DRB1*1301DRB1*07/-DRB1*01/DRB1*11DRB1*07/DRB1*1302DRB1*1401/DRB1*0101-0102DRB1*11/DRB1*1301DRB1*0101/DRB5*0101DRB1*0101/DRB5*0101DRB1*0301/DRB1*04DRB1*0301/DRB1*07DRB1*0301/DRB1*1301DRB1*07/DRB5*0101DRB1*08/DRB5*0101DRB1*04/DRB1*1302DRB1*03/DRB1*13DRB1*04/DRB5*0201-0202DRB1*1301/DRB5*0201-0202DRB1*04/DRB1*12DRB1*0101/DRB1*04DRB1*0101/-DRB1*0101/DRB1*1402DRB1*1302/DRB1*1303590,0020,0060,0080,0040,0090,010＞2,50059630,0260,1150,0580,0290,2610,011＞2,50063660,0070,0050,0070,0080,0120,010＞2,50066670,0090,0050,0080,0090,2510,024＞2,50067680,0360,0060,0090,0100,0160,011＞2,50068700,0080,0040,0550,0080,1990,009＞2,50070710,0340,0030,0050,0090,5390,008＞2,50071720,0100,0090,0060,0040,0090,130＞2,50072730,0100,0090,0050,0050,0100,150＞2,50073750,0380,0080,0080,0210,0140,010＞2,50075780,0410,0070,0040,0070,2540,015＞2,50078790,0640,0070,0060,0280,3150,012＞2,50079800,0070,0080,0090,0080,0110,142＞2,50080830,0100,1660,0070,0090,0170,159＞2,50083840,0500,0060,0080,0100,0140,009＞2,50084850,0630,0090,0070,0360,0090,011＞2,50085860,0140,0080,0040,0110,0100,010＞2,50086870,0420,0070,0050,0280,0070,004＞2,50087890,0080,0680,0390,0050,2010,006＞2,50089900,0080,0110,0090,0060,0100,009＞2,50090910,0100,0100,0060,0080,0090,011＞2,50091920,0400,0070,0120,0280,0180,012＞2,50092950,0350,0080,0090,0300,0170,009＞2,50095</table></tables>优选的杂交温度为37℃、优选的杂交缓冲液是PEG缓中液，但如实施例11和12中的结果所示，杂交温度和杂交缓冲液都可以改变。从以上描述可以清楚看出，本发明综合了下列优点可以分辨所有等位基因的最佳特异性，实施简便，比血清分析的费用低，操作迅速，扩增后约90分钟得到结果，相当于总时间少于12小时，这对肾提供者是至关重要的，与个体分型的相容性，这对急诊分型和在小实验室中的应用很重要，信号可用光密度定量，适当时可用简单的计算机化系统处理结果，适应于自动化系统。实施例13类似于上述方法，制备了相应于编号为101、102、103、104、115和111的寡核苷酸的捕捉探针。当这些探针用作捕捉探针时，它们识别说明书中指出的那些特异性。另外，本发明的捕捉探针可与下列检测探针一起使用-GCGGTGACGGAGCTGG-GAACAGCCAGAAGGAC.权利要求1.选自下组的核酸探针-TGGCAGCTTAAGTTT-CCTAAGAGGGAGTG-GCGAGTGTGGAACCT-AAGACAGGCGGGC，或其互补序列。2.能进行HLRDR分型的一套寡核苷酸探针，其包括至少一种选自下组的探针-TGGCAGCTTAAGTTT-CCTAAGAGGGAGTG-GCGAGTGTGGAACCT-AAGACAGGCGGGC，或其互补序列。3.根据权利要求2的一套探针，其还含有至少一种选自下组的探针-GTGGACAACTACTG-GATACTTCTATCACCAA-GCCTGATGAGGAGTAC-TGGCAGGGTAAGTATAAG-GGGCCCTGGTGGACA-TGCGGTATCTGCACA-GGAGGAGGTTAAGTT-CTGGAAGACGAGCG-TGGAAGACAAGCGG-TGCGGAGCACTGGA-AACCAGGAGGAGAACGTG-ACTCTACGGGTGAGTG-GACACCTATTGCAGAC，下划线部分相当于最小序列，或其互补序列。4.根据权利要求3的一套探针，其含有选自下组的至少一种探针-TGGACAACTACT-GATACTTCTATCACC-CCTGATGAGGAGTA-GGCAGGGTAAGTATAAG-GGCCCTGGTGGA-GCGGTATCTGCACA-GGAGGAGGTTAAGTT-TGGAAGACGAGC-GGAAGACAAGCG-GCGGAGCACTGG-AACCAGGAGGAGAACGT-CTCTACGGGTGAGT-ACACCTATTGCAGA，或其互补序列。5.根据权利要求2或3的一套探针，其还含有选自下组的至少一种探针-GAGGAGGACTTGCGCT-TACGGGGCTGTGGAG-GGAGCTGCGTAAGT-TTCCTGGAGAGACAC-GGGGAGAGATACTTCC，或其互补序列。6.根据权利要求5的一套探针，其含有选自下组的至少一种探针AGGAGGACTTGCGC-ACGGGGCTGTGGA-GAGCTGCGTAAGTTCCTGGAGAGACAC-GGAGAGATACTTC，或其互补序列。7.根据权利要求2-6任一项的一套探针，其含有探针-AACCAGIAGGAGAACGT.或其互补序列。8.根据权利要求2-7任一项的一套探针，其还含有下列探针的至少一种GCGGTGACGGAGCTGGGAACAGCCAGAAGGACCCGGGCGGTGACIGAGCTGGGGC，或其互补序列。9.按标准寡核苷酸分型技术从个体样品测定个体HLA-DR类型的方法，其特征在于使用权利要求2-8任一项定义的一套探针的至少一部分作为捕捉探针或检测探针。10.根据权利要求9的方法，其特征在于所述探针选自权利要求2-7任一项中提到的那些。11.根据权利要求10的方法，其特征在于所述探针用作捕捉探针。12.根据权利要求11的方法，其特征在于它包括下列步骤--将每种捕捉探针固定在固体载体上，--在若靶标中存在与探针互补的序列则可发生杂交的预定条件下，使每种固定化捕捉探针与含有至少一种核酸靶片段的液体介质接触，和--检测可能形成的杂交体的存在。13.根据权利要求12的方法，其特征在于在37℃温度下进行每种固定化捕捉探针与含至少一种核酸靶片段的液体介质接触的步骤。全文摘要选自下组的核酸探针TGGCAGCTTAAGTTT，CCTAAGAGGGAGTG，GCGAGTGTGGAACCT，AAGACAGGCGGGC或其互补序列。这些探针可用于尤其在器官转植前进行个体的HLADR分型。文档编号C12N15/09GK1159211SQ9619078公开日1997年9月10日申请日期1996年6月3日优先权日1995年6月7日发明者P·A·阿里伯特,P·克洛斯,B·F·梅彻,B·F·曼德兰德,J-M·蒂尔西申请人:比奥美希奥公司