专利名称：从紫杉属植物大量生产紫杉醇的方法
背景技术：
发明领域本发明涉及从紫杉属植物大量生产紫杉醇的方法，特别是涉及一种以高纯度和高收率大量生产紫杉醇的快速简单的方法，包括用甲醇、二氯乙烷和己烷从紫杉属植物溶剂萃取生物体(biomass)、吸附剂处理、在己烷中沉淀、分段沉淀和高色谱分离等步骤。
现有技术紫杉烷是含有紫杉烷骨架的二萜类化合物，例如，紫杉醇作为第一个鉴定具有紫杉烷环的化合物是从太平洋紫杉属短叶紫杉(Taxus brevifolia)的树皮中分离到的第一个已鉴定的带有一个紫杉烷环的化合物，其对于白血病和癌症有疗效。最近已报道紫杉醇能分别治愈约30％的卵巢癌病人，50％的乳癌病人和20％的肺癌病人。紫杉烷化合物也包括浆果赤霉素III、10-脱乙酰浆果赤霉素III、10-脱乙酰紫杉醇、头孢甘露醇(cephalomannine)和脱乙酰头孢甘露醇(deacetylcephalomannine)，它们可用于紫杉醇的半合成中。
紫杉烷化合物用下列通式(I)和(II)来表示 其中，如果R1＝AC，该化合物为浆果赤霉素III；如果R1＝OH，该化合物为10-脱乙酰浆果赤霉素III。 其中，如果R2＝AC，R3＝C6H5，该化合物为紫杉醇；如果R2＝OH，R3＝CH3CH＝CH(CH3)，该化合物为10-脱乙酰紫杉醇；如果R2＝AC，R3＝CH3CH＝CH(CH3)，该化合物为头孢甘露醇；以及如果R2＝OH，R3＝CH3CH＝CH(CH3)，该化合物为10-脱乙酰头孢甘露醇。
另一方面，全合成、半合成以及萃取方法已用于制备紫杉醇。
然而全合成的方法在本领域中尚未实际应用，因为它需要昂贵的化学试剂而且产率不高，这从紫杉醇复杂的化学结构便可以想象到。
使用诸如10-脱乙酰浆果赤霉毒III前体的半合成方法已表现出某些缺点，因为它实际上需要复杂而繁多的从紫杉属植物分离和提纯紫杉醇前体并将紫杉醇前体转化为紫杉醇的步骤，因而妨碍了该方法的普遍应用。
因此，用一种直接的方式从紫杉属植物分离紫杉醇的萃取方法在本领域便具有优点，因为它们具有经济上的优势，并且有许多的研究在现有技术中进行了描述。
WO94/12268描述了一种采用一种半透膜和反渗透装置分离紫杉醇的方法。但是该方法表现出一系列问题，它实际上需要昂贵的半透膜和反渗透装置，同时需要复杂的操作技术。
EP553780A提出了一种分离紫杉醇及其前体的方法，包括真空干燥紫杉属植物的甲醇萃取物，用环己烷和二氯甲烷进行溶剂萃取以得到粗紫杉醇，接着进行硅胶柱HPLC分离等步骤。
WO92/18492描述了一种纯化紫杉醇的方法，包括紫杉属植物的甲醇萃取，用二氯甲烷或乙酸乙酯分步分馏得到粗用醇和正相液相色谱分离等步骤。
WO94/13827提出了一种纯化紫杉醇的方法，包括用乙醇、甲醇和丙酮进行有机溶剂萃取、活性炭或木炭的吸附剂处理接着进行正相液相色谱分离等步骤。
JP6-157329A提出了一种获得低纯度粗紫杉醇的方法包括一系列用乙酸乙酯、乙醚、乙腈和丙酮的溶剂萃取步骤。
然而，所有现有的纯化方法的主要目标是通过用溶剂萃取和色谱技术获得低纯度的粗紫杉醇，它们实际上提供的是紫杉醇类化合物例如萜类化合物、类酯、叶绿素和醇，伴随有感兴趣的紫杉醇。因此，既使使用许多色谱柱，在纯化步骤中色谱上产生沉重的杂质负载，也没有能得到高纯度的紫杉醇。
此外，由于这样得到的紫杉醇的纯度不高，其在有机溶剂中的溶解度实际上很低，使得在色谱过程中的回收和产率不能控制，实际上需要附加结晶步骤才能得到高纯度的结晶的紫杉醇。因此，现有的纯化方法不能实际应用，需要发展一种以更简单和经济的方式分离高纯度紫杉醇和方法。
发明概述按照本发明，发明人开发了一种用一系列溶剂萃取、吸附剂处理、分步沉淀和高效液相色谱分离而从紫杉属植物提纯紫杉醇的方法。
因此，本的一个主要目的是提供一种从紫杉属植物大量生产紫杉醇的快速简单的方法，通过使用少量有机溶剂，不考虑生物体中的水含量，可以超过90％的收率得到纯度超过99％的紫杉醇。发明的详细描述本发明所提供的从紫杉属植物大量生产紫杉醇的方法包括下列步骤(i)对紫杉属植物的生物体进行有机溶剂萃取得到一种粗萃取物；(ii)将该粗萃取物用合成吸附剂处理并过滤得到滤液；(iii)向滤液中加入已烷以沉淀出粗紫杉醇；(iv)将粗紫杉醇在一种醇和水的混合物中进行分步沉淀，并干燥沉淀物以得到紫杉醇粉末；以及(v)将紫杉醇粉末进行高效液相色谱分离。
本发明中作为原料使用的生物体包括切碎或粉化的紫杉属植物的叶或皮以及在紫杉属植物的上或皮以及在紫杉属植物的细胞组织培养中得到的细胞体的饼，此处的紫杉属植物包括短叶紫杉，加拿大紫杉，东北紫杉，欧洲紫杉，Taxus globosa，佛罗里达紫杉，喜马拉雅紫杉，Taxus media和中国紫杉，不考虑生物体中的水份。
本发明的的大量生产紫杉醇的方法根据下述纯化步骤而进行详细的描述。
步骤1有机溶剂萃取作为本发明的一种优选的实施方案，溶剂萃取是使用甲醇和二氯甲烷按下述方法进行将紫杉属植物的生物体加入到甲醇中，于室温下搅拌20至60分钟，优选30至40分钟，并过滤，得到甲醇萃取物，其中植物优选的是以20-200％(W/V)，更优选的是40-140％(W/V)，最优选的是100％(W/V)的比例加入到甲醇中，并且该萃取重复至少3次，优选4次。然后，将每次得到的甲醇萃取物集中并在20-40℃的温度和1-30mmHg的减压条件下浓缩，直至将甲醇萃取物的体积减少到原来体积的20-30％为止。在此过程中，应特别注意控制温度在20-40℃范围内，因为当温度超过40℃时会加速紫杉醇和紫杉醇衍生物的差向立体异构作用。以10-50％，优选20-30％的体积比向该浓缩的甲醇萃取物中加入二氯甲烷，在室温下搅拌10-20分钟，并且让其静置以得到一种粗萃取物。萃取至少重复2次，优选3次，并将这样得到的粗萃取物汇集，在20-40℃和1-30mmHg的减压条件下干燥。
另一方面，溶剂萃取也可以用二氯甲烷/甲醇、甲醇和己烷按下述方法进行将紫杉属植物的生物体加入到一种二氯甲烷/甲醇的混合物中，于室温下搅拌20-60分钟，优选30-40分钟，并过滤，得到一种二氯甲烷/甲醇萃取物。此时，二氯甲烷与甲醇优选的是以7∶3到9∶1，更优选的是以8∶2到9∶1，最优选的是以9∶1的体积比混合，并且植物以10-100％(W/V)的比例加入到该混合物中。然后，以与上面的溶剂萃取中描述的类似的方法进行萃取和浓缩。将浓缩的萃取物以50-200％(W/V)，优选70-150％(W/V)，更优选90-110％(W/V)的比例溶解在甲醇中，得到甲醇萃取物。将甲醇萃取物以5-30％，优选7-20％，更优选8-15％的体积比加入到己烷中，在室温下搅拌10-20分钟并让其静置，接着移去己烷层得到一种粗萃取物。
步骤2吸附剂处理由于步骤1得到的干燥的粗萃取物中的杂质如焦油在后面的提纯步骤中起妨碍作用，故加入合成吸附剂以除去这些杂质。将该粗萃取物以5-100％(W/V)，优选10-50％(W/V)，更优选15-25％(W/V)的比例溶解在二氯甲烷中，接着以10-200％(W/V)，优选30-100％(W/V)，最优选50％(W/V)的比例加入合成吸附剂，在30-40℃搅拌10-40分钟，并用所说合成吸附剂过滤得到滤液。所用的合成吸附剂为活性白土，活性木炭和活性炭等，其中活性白土是最优选的。将得到的滤液用适量的二氯甲烷洗涤数次，并将洗涤液与滤液合并。然后，将该合并的滤液在30-40℃和1-30mmHg的减压条件下浓缩至等于吸附剂处理前的粗萃取物的150-200％。
步骤3在己烷中沉淀将步骤2得到的滤液加入到1500％体积，优选700-1200％，最优选1000％体积的己烷中得到沉淀物，并过滤得到紫杉醇含量大于23％的粗紫杉醇。
步骤4分步沉淀将前面步骤中得到的粗紫杉醇以1-10％(W/V)的比例溶解在一种乙醇与蒸馏水的混合物中，并让其于-20-10℃的温度下静置1-3天，得到紫杉醇沉淀物。然后将所得到的沉淀物过滤，并在真空条件下于20-40℃干燥1-3小时，得到紫杉醇粉末。此时，甲醇与蒸馏水优选的是以2∶1到1∶1的体积比混合。将该分步沉淀重复数次，优选的是至少2次，得到纯度大于85％的紫杉醇，这也保证了后面HPLC步骤中的高收率和高纯度同时减轻了色谱柱载荷负担。
步骤5高效液相色谱(HPLC)HPLC步骤由一个使用一种疏水性树脂柱如ODS(十八烷基甲硅烷基化，C18)柱以除去非极性杂质的HPLC和一个使用一种硅胶柱以去除极性杂质的HPLC所组成。
在使用疏水性树脂柱的HPLC中，溶解在有机溶剂中的紫杉醇粉末装填在疏水性树脂柱如ODS上并用甲醇和水的混合物洗脱。然后将洗脱物用紫外(LIV)检测器通过测定在227nm处的吸收值进行分析，汇集含有紫杉醇的活性部分并在真空条件下干燥以用于后面的硅胶HPLC。此时，紫杉醇粉未是以0.5-10％(W/V)，优选1-2％(W/V)的比例溶解在二甲亚砜(DMSO)或者甲醇中，甲醇和水是以1∶0.3到1∶0.8，优选1∶0.4到1∶0.7，更优选1∶0 5到1∶0.6的体积比混合。样品是以3-5cm/min的速度和以50-150mg/ml(在甲醇中)的浓度注射进HPLC中。
在使用硅胶柱的HPLC中，将含有经前面的HPLC的处理而得到的馏分的紫杉醇注射到硅胶柱中，并用二氯甲烷和甲醇的混合物洗脱。然后将洗脱物用紫外检测器通过测定在227nm处的吸收值进行分析，汇集活性部分并在真空条件下干燥，得到结晶紫杉醇。此时，样品是以50-150mg/ml(在CH2Cl2中)的浓度注射到HPLC中，并用以95∶5到99∶1，优选98∶2到99∶1，最优选99∶1的体积比混合的二氯甲烷和甲醇的混合物进行洗脱。HPLC步骤最后得到的紫杉醇晶体的纯度大于99％，收率大于90％。紫杉醇的定量分析根据本发明的方法从紫杉属植物提纯的紫杉醇用高效液相色谱在表1所列的特定条件下进行定量分析。
表1 紫杉醇定量分析的条件
下面的实施例将对本发明做进行进一步描述，但并不限制本发明的范围。实施例1 从紫杉属植物的细胞组织培养物提纯紫杉醇(I)向8kg从紫杉属植物的细胞组织培养获得的物质中加入8升95％(W/V)的甲醇，在室温下搅拌30分钟，过滤得到甲醇萃取物。该萃取步骤重复3次，将每次所得甲醇萃取物汇集，并在35℃和30mmHg的减压条件下浓缩，得到4升甲醇萃取浓缩物。在该甲醇萃取物中紫杉醇的纯度为0.24％，收率为100％。向该浓缩的甲醇萃取物中加入1.5升二氯甲烷，室温下搅拌15分钟，并让其静置，得到二氯甲烷萃取物，该萃取步骤重复3次。所得粗萃取的紫杉醇纯度为2.4％，收率为100％。
将该粗萃取物在35℃的温度和30mmHg的压力下干燥，将15克该萃取物溶解在56ml的二氯甲烷中。然后向所得溶液中加入35克活性白土合成吸附剂，在40℃下搅拌20分钟，过滤得到滤液。将所得滤液用285ml二氯甲烷洗涤3次，将洗涤液与滤液合并。然后将得到合并的滤液在35℃和20mmHg的压力下浓缩得到100ml浓缩液。该萃取物的纯度为3.1％，收率为97％。将100ml二氯甲烷萃取物加入到1升己烷中得到沉淀，过滤后得到纯度为23％的粗紫杉醇(收率95％)。
将1克所得粗紫杉醇溶解在28.27ml甲醇中，向所得溶液中加入17.25ml蒸馏水并让其在4℃静置2天，得到结晶紫杉醇。然后将所得溶液用0.4μm过滤器过滤并在真空条件下于35℃干燥2小时，得到299mg纯度为70％的紫杉醇粉末(收率91％)。
将299mg紫杉醇粉末溶解在3ml甲醇中并注射到一个ODS C18柱(φ50×500mm)中，并在表2所列条件下用65∶35(V/V)的甲醇/水混合物洗脱。然后将洗脱物用紫外检测器通过测定227nm波长处的吸收值进行分析，并收集停留时间(Rt)为40-70min的活惦部分。紫杉醇的纯度为90％，收率为90％。将含有各馏份的紫杉醇在35℃和10mmHg的减压条件下干燥。将209.3mg的样品溶解在2ml二氯甲烷中并注射到一个硅胶柱中，用100∶1.2(V/V)的二氯甲烷/甲醇混合物在表3所列条件下进行洗脱。然后将洗脱物用UV检则器分析并收集含有紫杉醇的活性部分，用旋转蒸发器干燥，并经真空干燥得到170.5mg结晶紫杉醇(纯度99.5％)。表2 采用ODS柱的HPLC条件
表3 采用硅胶柱的HPLC条件
实施例2 从紫杉属植物的细胞组织培养物提纯紫杉醇(II)与实施例1中的从紫杉属植物的细胞组织培养物提纯紫杉醇类似，所不同的是溶剂萃取采用二氯甲烷/甲醇、甲醇和己烷向10kg紫杉属植物的生物体中加入45升二氯甲烷/甲醇(9∶1，V/V)混合物，在室温下搅拌20至60分钟，优选30至40分钟，过滤，得到二氯甲烷/甲醇萃取物。然后按照与实施例1中溶剂萃取的类似方法进行萃取和浓缩。将100克浓缩的萃取物溶解在100ml甲醇中得到甲醇萃取物。该甲醇萃取物中紫杉醇的纯度为0.59％，收率为95％。将100ml该甲醇萃取物加入到1升己烷中，室温下搅拌15分钟，并让其静置，接着重复3次移去己烷，得到粗萃取物。在该粗萃取物中紫杉醇的纯度为2.8％，收率为100％。
最后得到的紫杉醇的HPLC分析表明纯度99.5％，收率为90％。实施例3 从紫杉属植物的叶或皮提纯紫杉醇(I)按照与实施例1的类似方法提纯紫杉醇晶体，所不同的是采用切碎和粉化的紫杉属植物的叶或皮作为原料。最后得到的紫杉醇的HPLC分析表明纯度为99.6％，收率为96％。实施例4 从紫杉属植物的叶或皮提纯紫杉醇(II)按照与实施例2的类似方法提纯紫杉醇晶体，所不同的是采用切碎和粉化的紫杉属植物的叶或皮作为原料。最后得到的紫杉醇的HPLC分析表明纯度为99.6％，收率为90.5％。实施例5-6按照与实施例1和3的类似方法提纯紫杉醇晶体，所不同的是在甲醇萃取步骤中使用32升甲醇并将搅拌时间延长至40分钟。HPLC分析表明纯度为99.6％。实施例7-8按照与实施例1和3的类似方法提纯紫杉醇晶体，所不同的是在甲醇/二氯甲烷萃取步骤中使用4升二氯甲烷并将搅拌时间延长至20分钟。HPLC分析表明纯度分别为99.5％和96％。实施例9-10按照与实施例1和3类似的方法提纯紫杉醇晶体，所不同的是在HPLC步骤中是用甲醇代替二氯甲烷作为溶解样品的溶剂。HPLC分析表明纯度分别为99％和97％，收率分别为91％和92％。对比例用与实施例1的类似方法得到紫杉醇粉末，所不同的是省去活性白土处理和分步沉淀的步骤。HPLC分析表明纯度为大约40％。
上面的实施例清楚地描述和证明，本发明所提供的从紫杉属植物大批量生产紫杉醇的方法通过采用一系列溶剂萃取、吸附剂处理、分步沉淀和高效液相色谱分离等步骤，可以得到大于99％的高纯度和大于90％的高收率。
权利要求
1.一种从紫杉属植物大量生产高纯度紫杉醇的方法，包括下列步骤(i)对紫杉属植物的生物体进行有机溶剂萃取得到一种粗萃取物；(ii)将该萃取物用合成吸附剂处理并过滤得到滤液；(iii)向滤液中加入已烷以沉淀出粗紫杉醇；(iv)将粗紫杉醇在一种醇和水的混合物中进行分步沉淀，并干燥沉淀物以得到紫杉醇粉末；以及(v)将紫杉醇粉末进行高效液相色谱分离。
2.按照权利要求1的方法，其中从紫杉属植物得到的生物体是切碎和粉化的叶或皮，或者是在紫杉属植物的细胞组织培养中得到的细胞体的饼。
3.按照权利要求1的方法，其中的紫杉属植物选自由短叶紫杉，加拿大紫杉，东北紫杉，欧洲紫杉，Taxus globosa，佛罗里达紫杉，喜马拉雅紫杉，Taxus media和中国紫杉组成的一组。
4.权利要求1的方法，其中的溶剂萃取步骤以下述方式进行，以20-200％(w/v)的比例将紫杉属植物的生物体加入到甲醇中，在室温下搅拌并过滤得到甲醇萃取物；以及，以10-50％的体积比向该甲醇萃取物中加入二氯甲烷，搅拌并让其静置得到一种粗萃取物。
5.按照权利要求1的方法，其中溶剂萃取按下列方式进行以10-100％(w/v)的比例将紫杉属植物的生物体加入到一种二氯甲烷/甲醇的混合物中，在室温下搅拌并过滤得到一种二氯甲烷/甲醇萃取物；将所说萃取物以50-200％(w/v)的比例溶解在甲醇中得到一种甲醇萃取物；以及，将该萃取物以5-30％的体积比加入到已烷中，搅拌和静置，通过移去已烷层得到一种粗萃取物。
6.按照权利要求5的方法，其中二氯甲烷与甲醇以7∶3到9∶1的体积比混合。
7.按照权利要求1的方法，其中的合成吸附剂处理通过以1 0-200％(w/v)的比例将合成吸附剂加入到粗萃取物中并搅拌和过滤得到滤液而进行。
8.按照权利要求1的方法，其中合成吸附剂选自由活性白土、活性木炭和活性炭所的组中。
9.按照权利要求1的方法，其中粗紫杉醇的沉淀通过将二氯甲烷滤液加入500-1500％体积的已烷中而进行。
10.按照权利要求1的方法，其中的分步沉淀通过将粗紫杉醇以1-10％(w/v)的比例溶解在甲醇和水的物中并在-20-10℃下静置1-3天而进行。
11.按照权利要求10的方法，其中的甲醇和水以2∶1到1∶1的体积比混合。
12.按照权利要求1的方法，其中的HPLC由一个采用一种疏水性树脂柱的HPLC和一个采用一种硅胶柱的HPLC而组成。
13.按照权利要求12的方法，其中HPLC分离采用一种疏水性树脂柱的HPLC通过将以0.5-10％(w/v)的比例溶解在有机溶剂中的紫杉醇粉末注射到ODS(十八烷基甲基硅烷化，C18)柱中而进行。
14.按照权利要求13的方法，其中的有机溶剂为二氯甲烷或甲醇。
15.按照权利要求13的方法，其中用一种以1∶0.3到1∶0.8的体积比混合的甲醇和水的混合物进行洗脱。
16.按照权利要求12的方法，其中在采用一种硅胶柱的HPLC的洗脱用一种以95∶5到99∶1的体积比混合的二氯甲烷与甲醇的混合物进行。
全文摘要
本发明涉及一种从紫杉属植物的细胞培养物高纯度高收率地大量生产紫杉醇的方法。本发明的从紫杉植物大量生产紫杉醇的方法包括的步骤有(i)对紫杉属植物的生物体进行有机溶剂萃取得到一种粗萃取物；(ii)将该粗萃取物用合成吸附剂处理并过滤得到滤液；(iii)向滤液中加入己烷以沉淀出粗紫杉醇；(iv)将粗紫杉醇在一种醇和水的混合物中进行分步沉淀，并干燥沉淀物以得到紫杉醇粉末；以及(v)将紫杉醇粉末进行高效液相色谱分离。按照本发明的方法，可以简单地从紫杉属植物得到纯度大于99％的紫杉醇并且收率高于90％。
文档编号C12P15/00GK1152339SQ96190420
公开日1997年6月18日 申请日期1996年4月27日 优先权日1995年4月29日
发明者洪承绪, 宋凤圭, 金镇铉, 林昌培, 李贤秀, 金光旭, 姜寅善, 朴兴福 申请人:(株)三养吉尼克斯