专利名称：紫杉醇溶剂化物的制作方法
技术领域：
本发明涉及带有有机溶剂的紫杉醇的新晶态溶剂化物，其可用作用于治疗性处理的紫杉醇的来源。本发明的概念进一步包括由包含紫杉醇的物质形成该类溶剂化物的方法、以及由这些溶剂化物获得紫杉醇的方法。
相关现有技术的描述紫杉醇，一种具有显著抗肿瘤活性的具有如下结构的二萜紫杉烷(taxane)化合物 是一种最初由短叶紫杉树，Taxus brevifolia的树皮提取的天然产物。其可以以Taxol(Bristol-Myers Squibb Co)的形式通过商业途径获得。已经表明Taxol在体内动物模型中具有极佳的抗肿瘤活性，并且最近的研究已经阐明了其独特的作用方式，其涉及细胞循环期间微管蛋白的异常聚合和有丝分裂的破坏。已批准Taxol用于治疗难治的晚期卵巢癌、乳癌、非小细胞肺癌和与AIDS有关的卡波济氏肉瘤。
在科学期刊上对紫杉醇临床研究的结果进行了报道，许多作者已经对其进行了综述，如Rowinsky等人，Pharmac.Ther.，52，35-84(1991)；Spencer等人，Drugs，48(5)，794-847(1994)；K.C.Nicolau等人，Angew.Chem.，Int.Ed.Eng.，33，15-44(1994)；F.A.Holmes等人，“紫杉烷抗癌剂-基础研究和目前的状态”，由GundaI.Georg等人所编辑，31-57 American Chemical Society，Washington，D.C.(1995)；S.G.Arbuck等人，“Taxol科学和应用”，由Matthew Suffness所编辑，379-416，CRC Press，Boca Raton，Florida(1995)，和其中所引用的参考资料。
专利文献对许多将紫杉醇从植物来源中分离出来的方法进行了描述，这些方法中的许多方法包括用各种有机溶剂系统进行提取，然后进行色谱分离。
例如，Rao在US 5,380,916、5,475,120、和5,670,673(还有PCT公开号为WO 92/07842的申请)中使用了一系列先使用乙醇、氯仿、轻石油、苯和甲醇进行溶剂提取，然后用使用HPLC柱和乙腈洗脱剂的反相色谱进行处理的方法。
Naie在US 5,279,949和5,478,736(也是公开号为WO 97/09443的申请)中所描述的方法是用活性炭对最初的70％乙醇/水提取物进行脱色并用Celite(硅藻土)进行早期过滤。随后，将进行了脱色的提取物用乙酸乙酯进行萃取，然后蒸发至沉淀出紫杉烷类物质。将紫杉烷类物质重新溶解于乙酸乙酯中并将其装填到用己烷/乙酸乙酯梯度洗脱的第一根硅胶柱上，然后通过串联的硅胶柱进行进一步纯化，或者用反相色谱来进行纯化。
US 6,136,989公开了一种制备包含紫杉醇的丙酮混合物的方法，其包括用甲醇对包含紫杉醇的物质进行提取从而得到一种甲醇提取物；通过使用二氯甲烷和水进行的液-液萃取来对该甲醇提取物进行分配，从而形成一种具有包含甲醇/水的甲醇相和包含二氯甲烷和紫杉醇的二氯甲烷相；从二氯甲烷中除去甲醇和水从而获得一种包含紫杉醇的浓缩的提取物；将该浓缩的提取物与硅石基质进行接触，然后对该硅石基质进行洗脱，从而获得包含至少5％(w/w)紫杉醇的洗脱液，向该洗脱液中加入丙酮，得到一种丙酮混合物。根据该发明，包含至少5％紫杉醇的丙酮混合物的丙酮/水沉淀将提供一种包含至少20％紫杉醇的沉淀物，包含至少10％紫杉醇的丙酮混合物的丙酮/水沉淀将提供一种包含40％至50％紫杉醇的沉淀物。
虽然上面的这些专利涉及紫杉醇的分离，但是这些专利文献中没有任何文献对新的、先前未知的紫杉醇溶剂化物从紫杉醇和一种或多种有机溶剂的溶液中结晶进行描述。
在药物制剂的研制中，在现有技术中已经将紫杉醇与有机溶剂一起使用。已知紫杉醇在水中的溶解性很差，其限制了将紫杉醇给药于患者的制剂的获得。常用的制剂包含50％(v/v)的醇和88-倍过量的聚氧乙烯化蓖麻油(CremophorEL)。
已经进行了各种努力来寻找用于将紫杉醇给药于患者的其它媒介。例如，US 5,877,205描述了将紫杉醇溶解于第一种有机溶剂(例如N，N′-二甲基乙酰胺或二甲基亚砜)中，然后用第二种溶剂，如聚乙二醇400来进行在水性溶剂中的最后稀释。
US 6,017,948公开了据称适于给药于患者的紫杉醇制剂，其包含在水可溶混的非水性溶剂中的紫杉醇溶液，所说的溶剂如N-甲基吡咯烷酮、丙二醇、乙酸乙酯、二甲基亚砜、N，N′-二甲基乙酰胺、苯甲醇、2-吡咯烷酮、或苯甲基苄醇。
上述的两篇专利都涉及通过输入来进行给药的液体制剂。上面的专利中没有任何专利公开紫杉醇溶剂化物从其各自制剂的结晶。
发明概述已知紫杉醇存在不同的结晶形式。本发明一方面涉及紫杉醇的新型生物学活性有机溶剂化物，所说的物质以结晶形式存在并且可以从其中分离出高纯度的紫杉醇。
这里所描述的紫杉醇的新溶剂化物是之前未知的紫杉醇分子的三维结晶排列，其包括用于适宜有机溶剂分子的部位。适宜的有机溶剂是具有可以被混入到该溶剂部位而不会改变这里所述的紫杉醇分子的独特排列的分子的这些物质。
已经发现该类紫杉醇的新溶剂化物可以在紫杉醇的纯化中用作中间体。已经发现该溶剂化物本身具有生物学活性。
在某些实施方案中，这里所描述的新型溶剂化物可得自包含紫杉醇的物质如粗制紫杉烷混合物，其中紫杉烷类物质衍生自例如天然来源。在其它实施方案中，该新型溶剂化物可以得自半合成的紫杉醇，或者可以由通过将相对纯的紫杉醇溶解于一种或多种有机溶剂中而制得的混合物来获得。
在另一方面，本发明包含一种用于由一种混合物来制备晶态紫杉醇溶剂化物的方法，混合物含有包含紫杉醇的物质和一种有机溶剂，有机溶剂具有可以与上文所述紫杉醇分子的独特晶态排列中的溶剂部位相容的溶剂分子。将固态的、包含紫杉醇和位于晶体结构内的溶剂分子的晶态紫杉醇溶剂化物从该混合物中分离出来。
本发明进一步包含一种从这里所描述的溶剂化物中回收紫杉醇的方法，其包括从该晶态溶剂化物结构中除去溶剂分子。这种方法在这里被称为“去溶剂化”步骤，其可以用现有技术中公知的任何溶剂除去手段来完成。
本发明另一方面还涉及用于抑制人和/或其它哺乳动物肿瘤的方法，其包括给荷瘤主体使用抗肿瘤有效量的这些新紫杉醇形式。
附图简要说明
图1是观测到的散装的D型粉末X-射线衍射(PXRD)图，所说的D型是一种以前未知的晶态紫杉醇溶剂化物，其中NMPO、乙腈和水被混入到晶体结构中。所观测到的上部图案(在室温下由在最初溶剂混合物中的浆液所测得的)与在-43℃下由得自单晶的完全X-射线分析的原子坐标所模拟的下部图案相一致。
图2是模拟的E型粉末X-射线衍射(PXRD)图，E型是一种以前未知的晶态紫杉醇溶剂化物，其中DMF和水被混入到该晶体结构中。这种模拟图是由在-53℃下得自完全单X-射线分析的原子坐标来进行计算的。
图3是对在D型溶剂化物的一部分中紫杉醇分子和溶剂分子的固态排列的描述。其是以所观测的原子坐标为基础的。没有表示出乙腈分子。
图4是对在D型溶剂化物的另一部分中不依赖于对称的紫杉醇和溶剂分子的固态排列的描述，其是以所观测的原子坐标为基础的。没有表示出乙腈分子。
图5是对在E型溶剂化物的一部分中紫杉醇分子和溶剂分子的固态排列的描述，其是以所观测的原子坐标为基础的。
图6是对在E型溶剂化物的另一部分中不依赖于对称的紫杉醇和溶剂分子的固态排列的描述，其是以所观测的原子坐标为基础的。
图7是表示得自紫杉醇的细胞毒性(IC50值)的表格。
图8是表示得自本发明所制备的紫杉醇NMPO溶剂化物的细胞毒性(IC50值)的表格。
优选实施方案的详细描述商品Taxol所用的紫杉醇是以无溶剂的结晶粉末(在这里被称为A型)的形式被制造的。在对本发明的特性进行描述的过程中，已经通过单晶X-射线衍射研究测得A型是正交晶、并且其晶胞包含两个用氢键相连从而形成一种氢键键合的“二聚物”的晶体学独立的紫杉醇分子，并且不包含溶剂分子。这里所用的短语“紫杉醇二聚物”和术语“二聚物”指的是彼此氢键键合的两个紫杉醇分子。十一个氢键的网络将两个紫杉醇分子连接成对称相关的邻居。这种排列的另一个特征是存在埋在两个独立的紫杉醇分子间裂缝中的大溶剂部位；但是，该晶体结构、以及由此而获得的A型中紫杉醇分子的排列与这里所公开的新形式中的任何一种都完全不同。
A型紫杉醇(伸长的薄片)主要以高度水不溶的结晶、颗粒状的、不含溶剂的形式存在。其在正常的实验室条件(相对湿度(RH)约为50-60％；20-30℃)下基本不吸湿。但是，当与相对湿度高于约90％的大气相接触、或者在水性混悬液、分散体或乳液中时，A型转换成(受时间、温度、搅拌等等影响)一种热力学更稳定的形式(在这里被称为B型)。B型是一种每两个独立的紫杉醇分子(一种紫杉醇“二聚物”)具有六个水部位的三水合物正交晶型。这些水合的结晶是细的发丝状外观的物质，并且其水溶性比A型更差。
B型三水合物是在水性混悬液中形成的或者是通过在存在大量过量水的情况下由水性溶剂进行结晶来获得的。在专利申请EP 717,041中公开了这种形式，其在这里被全部引入作为参考。在对本发明的特性进行描述的过程中，已经通过单晶X-射线衍射研究测得B型是正交晶、并且其晶胞包含两个用氢键相连从而形成一种“二聚物”的晶体学独立的紫杉醇分子。该晶体结构、和由此而获得的B型中紫杉醇分子的排列与A型和这里所公开的新形式中的任何一种都完全不同。
Mastropaolo，等人公开了一种通过从Taxol在二噁烷、水和二甲苯的溶液中蒸发掉溶剂而获得的新的晶态紫杉醇溶剂化物。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，6920-24(1995年7月)。这种溶剂化物在这里被称为C型，但是表明其不稳定，并且无论如何，与本发明的新溶剂化物不同，C型一直没有表明完成粗紫杉醇的纯化。据报道，该薄片状的结晶中每两个紫杉醇分子包含五个水分子和三个二噁烷分子。该晶体结构、以及由此而形成的C型中紫杉醇分子的分子排列与这里所公开的新型物质中的任何一种都完全不同。
根据本发明的实施方案，新型、相对稳定的紫杉醇溶剂化物是以受控的方式从包含位于一种或多种有机溶剂中的含有紫杉醇物质的溶液中结晶的。该结晶是通过以受控的方式加入作为逆溶剂的水并联合温度振动来完成的。在这方面，以等分试样的方式加入水从而使得该新型溶剂化物的结晶优于三水合物的沉淀。这种控制优化了收率和晶态紫杉醇溶剂化物的质量并且基本避免了三水合物的形成。
优选地，有机溶剂选自二甲基亚砜(DMSO)、N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N′-二甲基乙酰胺(DMAC)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMPO)、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMEU)、1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、和乙腈以及其混合物。但是，也可以使用与本发明所公开的溶剂化物的晶体结构中的溶剂部位相容的其它溶剂。在下面对由这些溶剂中的一种或多种所形成的溶剂化物的各种实例进行了描述。
例如，在E型的一个实施方案中，从包含紫杉醇和水性DMF的溶液中进行的结晶产生了DMF∶紫杉醇表观分子比为约0.5∶1的溶剂化物。在E型的一个优选实施方案中，从位于水性DMF的紫杉醇溶液中进行的结晶产生了一种三元晶体结构，其每个紫杉醇“二聚物”包含一个DMF溶剂分子和约两个水分子。
在D型的一个实施方案中，从包含紫杉醇和水性NMPO的溶液中进行的结晶产生了NMPO∶紫杉醇表观分子比为约1∶1的溶剂化物。在D型的优选实施方案中，从包含紫杉醇、乙腈(CH3CN)、醋酸、和NMPO的水性溶液中进行的结晶产生了一种D型溶剂化物，其特征为每两个紫杉醇分子(“二聚物”)具有约三分子水、约两分子NMPO、和约一分子乙腈。
在另一个实施方案中，从包含紫杉醇和水性水性DMPU的溶液进行的沉淀产生了一种包含分子比为约1∶1的DMPU和紫杉醇的结构未知的固体。
在另一个实施方案中，从包含紫杉醇和DMSO的溶液中进行的沉淀产生了一种包含分子比为约1-2∶1的DMSO和紫杉醇的结构未知的固体。
本发明的溶剂化物应被解释为包括具有相似晶体结构、性质和大约相同的溶剂紫杉醇比例的等同物。
制备该溶剂化物的方法包括将得自各种来源的包含紫杉醇的物质与一种或多种有机溶剂的水性溶液相结合。该混合物可包括或不包括用于抑制形成异构体——7-表-紫杉醇的酸化剂。任何合适的酸化剂都可以使用。这些酸化剂的非限制性实例包括稀醋酸或枸橼酸。然后可以通过过滤将紫杉醇与溶剂相结合所形成的固体分离出来，然后用现有技术中公知的任何方法除去过量的未结晶的溶剂。所得的被分离出来的产品包含一定比例的位于该晶态溶剂化物形式中的溶剂。在随后的步骤中，被分离出来的溶剂化物可以被“去溶剂化”，即，用现有技术中公知的溶剂除去方法来从晶体结构中除去溶剂分子并完成溶剂化物的转化，例如转化成A型紫杉醇。还可以任选地通过去溶剂化将本发明的E型溶剂化物转化成B型。
这里所描述的溶剂化物，并且特别是紫杉醇的D型NMPO溶剂化物出乎意料地改善了得自粗产品管流的紫杉醇的纯度。当被溶解时，该溶剂化物还具有与A型相似的生物学活性。此外，可以通过在真空下进行加热来将其转化成A型。甚至在相对高湿度的条件下D型也能转化成A型。
在一个实施方案中，本发明包含一种将紫杉醇溶剂化物分离出来的方法，其包括将包含紫杉醇的物质如得自植物来源的紫杉烷类物质的粗混合物与有机溶剂进行接触，可任选地进行加热以促进紫杉醇的溶解。紫杉烷类物质的粗混合物一般是通过用溶剂对植物原始物质进行提取而获得的位于有机溶剂中的紫杉烷类物质的混合物。优选地加入酸化剂。然后，可以如这里所述的这样使该溶剂化物从该混合物中沉淀出来。在沉淀后，对浆液进行过滤以将该溶剂化物分离出来。
如果先将温度升至浆液在该温度下变稀的温度，然后将温度降低直至该浆液变稠，然后将这种操作重复多次，则可以增加由给定数量的粗紫杉烷混合物和有机溶剂所获得的浆液的质量。本领域技术人员可以不需要进行过多试验就能调节和优化给定溶剂系统的温度设定点的上限和下限。
该分离操作还可有效地对包含粗和半合成紫杉醇的物质进行纯化，并且大概还可以有效使用全合成的紫杉醇。
在下面的详细说明中，特定量和处理条件(包括时间、温度等等)仅是为了进行举例说明，并且应被理解为包括等值的范围。不管是否进行了这种清楚的说明，所有该类数值性实例应被理解为可以被术语“约”所修饰，并且术语“约”是本领域技术人员可以不需要进行过多试验就能决定值的范围。
用于紫杉醇分离的适宜的包含紫杉醇的物质可以选自包含高紫杉醇含量的任何组织，所说的高含量优选地为干基重的至少约0.005％重量。适宜的包含紫杉醇物质的实例包括来自各种紫杉植物的组织，包括红豆杉属植物，最优选地是短叶红豆杉或云南红豆杉的树皮，以及观赏性红豆杉植物如东北红豆杉、直立杂种红豆杉、暗绿垂直红豆杉和中国红豆杉、西藏红豆杉、加拿大红豆杉、T.globosa、T.sumatrana、和佛罗里达红豆杉的根和针叶。其它的适宜物质包括得自红豆杉属类植物的植物组织培养物。用于获得所培养的组织的方法在例如Cociancich和Pace的US 5,744,333、EP 553,780 B1以及Strobel等人的US 5,451,392中进行了全面描述。
该包含紫杉醇的物质还可以得自半合成的或其它天然的来源。例如，US 5,451,392对用于对细胞进行培养的培养基进行了描述，其也适用于本发明的操作。表达可提取的紫杉醇的微生物也是适用的，例如在细胞糊或发酵肉汤中进行表达。适宜微生物的实例是如Page等人在US 5,451,392中所描述的与一些紫杉属类物质有关的欧文氏菌属类的微生物。另外的实例包括Taxomyces属的微生物，并且特定地是Taxomyces andreanae，其能产生紫杉醇。其它的实例还包括被设计为用重组DNA技术来产生紫杉醇的微生物。
在其它的实施方案中，通过由包含相对纯的紫杉醇和有机溶剂或有机溶剂混合物的水性溶液进行沉淀来获得该溶剂化物。虽然并不会对本发明构成限制，但在这种方法中所用的相对纯的紫杉醇一般具有高于约90％的纯度。
在对该溶剂化物进行沉淀时，可以使用或不使用晶种来使得结晶开始。在这一方面，可以向该溶液中引入所需溶剂化物的晶种以诱导溶剂化物的形成。
本发明另一方面提供了一种将新的晶态紫杉醇溶剂化物转化成A型紫杉醇的方法，其可用于商业上。优选地，该转化包括将该溶剂化物在升高的温度下在真空下进行干燥。在优选的实施方案中，将本发明的晶态紫杉醇溶剂化物去溶剂化并在真空和温度的适宜组合情况下，在真空干燥的过程中将其转化成A型紫杉醇。
本发明的化合物既表现出体外抗肿瘤活性又表现出体内抗肿瘤活性。对于各种肿瘤的治疗而言，可以以与使用A型紫杉醇的方法相似的方法来使用本发明的化合物；例如，见Physician′s Desk Reference，第49版，Medical Economics，682页，1995。对本发明化合物的给药剂量、方式、和时间表并没有特别的限制。癌症治疗现有技术中的肿瘤学普通技术人员将可以不进行过多试验就能确定将本发明化合物进行给药的适宜治疗方案。因此，可以通过任何适宜的给药途径如胃肠外或口服将该活性化合物进行给药。胃肠外给药包括静脉内给药、腹膜内给药、肌内给药、和皮下给药。
用于实施本发明的治疗方法的给药剂量是使其可以进行预防性处理或引起最大的治疗响应的给药剂量。可以根据给药的类型、所选择的特定产品、和被治疗个体的个人特性对该给药剂量进行变化。一般而言，该剂量对于由异常细胞增生所造成的病症而言是治疗有效的。可以根据需要来对本发明的化合物进行给药以获得所需的治疗作用。一些患者可能对相对高或低的剂量迅速响应，然后需要温和的维持剂量或根本不需要维持剂量。通过静脉内途径给药时，该剂量可以为例如在1至100小时期间约20至500mg/m2。通过口服途径进行给药时，该剂量可以为5-1000mg/kg体重/天。所用的实际剂量将根据所制备的特定组合物、给药途径、和被治疗肿瘤的特定部位、主体、和类型来进行变化。在决定剂量时将考虑许多改变药物作用的因素，包括患者的年龄、体重、性别、饮食和身体情况。
本发明还提供了包含抗肿瘤有效量的活性化合物和一种或多种可药用载体、赋形剂、稀释剂、或助剂的药物组合物。可以用常规方法来制备该组合物。可以按照在US4,960,790和4,814,470中的实施例来制备本发明的组合物。例如，可以将活性化合物制备成片剂、丸剂、粉状混合物、胶囊、注射剂、溶液、栓剂、乳剂、分散体、食品预混合料、以及其它适宜形式。其还可以被制备成无菌固体组合物的形式，例如，冷冻干燥的形式，并且如果需要的话可以与其它可药用的赋形剂合用。在用于胃肠外给药前可以立即将该类固体组合物用无菌水、生理盐水、或水和有机溶剂的混合物、或一些其它的无菌可注射介质进行重组，所说的有机溶剂如丙二醇、乙醇等等。
典型的可药用载体有例如甘露醇、脲、葡聚糖、乳糖、马铃薯和玉米淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、植物油、聚亚烷基二醇、乙基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、碳酸钙、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、苯甲酸苄酯、碳酸钠、明胶、碳酸钾、和硅酸。
该药物制剂还可以包含无毒的辅助物质如乳化剂、防腐剂或润湿剂等等，如脱水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、聚氧乙烯单硬脂酸酯、甘油三棕榈酸酯、和二辛基磺基琥珀酸钠等等。
下面的实施例对制备和使用本发明物质的方式和过程进行了描述并且只是为了进行解释而不是要进行限制。
实施例1D型紫杉醇溶剂化物(NMPO)将533mg紫杉醇溶解于26.6mL NMPO中。向其中加入13.3mL乙腈，然后向其中加入13.3mL 0.1％的水性醋酸。将该溶液加热至40℃，并以分成两份的形式向其中加入0.1％醋酸水溶液(26.6mL)。然后将其在90分钟内冷却至20℃并将其进行超声。然后将该浆液加热至58℃，然后在90分钟内将其冷却至20℃。然后将该浆液加热至58℃，搅拌1小时并在4.5小时内将其冷却至20℃。然后，将该浆液进行超声处理，在30分钟内将其重新加热至58℃并在58℃下搅拌1小时。然后，将该浆液在4.5小时内冷却至20℃，并缓慢搅拌16小时。然后将该浆液倒出和过滤。将滤饼用25％位于0.1％水性醋酸(2mL)中的乙腈进行洗涤。然后将该滤饼在真空下在40℃下进行干燥，得到一种无色的固体(450mg)。由1H NMR获得的NMPO与紫杉醇比例为1.0∶1，其与D型的单晶结构相一致(效力＝855μg/mg；面积％为99.7)。(D型晶体理想地以3∶2∶1∶2的摩尔比包含H2O、NMPO、CH3CN、和紫杉醇)。
D型NMPO溶剂化物晶体由在-43℃下具有下面晶胞参数的伸长的薄片所组成。(在Stout & Jensen的第3章，X-射线结构测定实际指导，MacMillan Co.，纽约(1968)中可以找到对晶胞的详细描述，其在这里被引入作为参考。)晶胞大小a＝9.541(1)b＝28.456(4)c＝37.238(5)体积10,1103空间群P212121正交晶晶胞的理想组成8紫杉醇，8NMPO，4CH3CN，12H2O密度(所计算的)1.315g/cm3在图3和4中对D型中紫杉醇和溶剂分子的独特排列进行了说明，并且是以在下面表1-2中所列的小数级的原子坐标为基础的。
在表1-3中所报告的各型的近似小数级坐标包含另外的由紫杉醇和除所举例的溶剂之外的溶剂所组成的同晶型晶态溶剂化物形式。在表中，原子数小于40表示紫杉醇“二聚物”的分子“b”中的原子。分子“a”中的相应原子具有高于分子“b”中的相应原子数的数目。因此，例如，表1中的“N44′”是在分子“a”中，并且与分子“b”的N4′相对应。分子“a”和分子“b”是在图中所标出的紫杉醇“二聚物”的两个分子。原子0111、0112、和0113是三个水分子。原子N101、C102、和C103是乙腈分子。原子N91、092、和C93-C96是两个NMPO溶剂分子中的一个。除一些轻微的天然晶格膨胀外，该晶体结构在环境条件下仍然相同。因此，表1中的近似坐标将根据测量温度而变化。这些坐标中的统计学变量也可以与所报告的误差值相一致的存在。
表1
下面的坐标表示一种NMPO溶剂分子和分子A的侧链苯基。
表2
实施例2D型向A型的转化将实施例1的NMPO-溶剂化的紫杉醇样品在82℃下在高真空下进一步干燥16小时以得到一种包含0.05摩尔当量NMPO的物质并且通过X-射线粉末衍射证明其是A型。
实施例3紫杉醇的纯化包含10.66g紫杉醇的粗紫杉烷混合物(在227nm下，紫杉醇面积％＝56)以在1.055L由比例为2∶1∶1(v∶v∶v)的NMPO/乙腈/0.1％醋酸所组成的溶剂混合物中的溶液形式存在。在搅拌的同时将该溶液加温至40℃，然后在80分钟内向其中加入0.1％带有晶种的醋酸水溶液(520mL，以分成4份的形式)。在将其40℃下放置30分钟后，使该浆液在90分钟内冷却至20℃，然后将其在20℃放置30分钟。然后将该浆液加热至58℃，将其搅拌30分钟，然后使其在90分钟内冷却至20℃。将该浆液在20℃搅拌30分钟，然后将其重新加热至58℃。在达到58℃后，以一份的形式向其中再加入另外的0.1％水性醋酸(520mL)。然后进行如下的温度振动循环设定值1＝58℃；时期1＝45分钟。
设定值2＝58℃；时期2＝180分钟。
设定值3＝20℃；时期3＝30分钟。
设定值4＝20℃。
将其在20℃的最后温度下进行放置后，将该浆液搅拌4小时，过滤，然后连续用各自为80mL的25％在0.1％水性醋酸中的乙腈和然后的0.1％水性醋酸进行洗涤，最后进行干燥。
干燥后的滤饼产生了含有10.52g晶态紫杉醇溶剂化物的13.47g物质。由1H NMR确定的NMPO与紫杉醇的比例为1.0∶1。产物在227nm下的紫杉醇面积％是92。母液在227nm下的紫杉醇面积％为9.5。
实施例4E型紫杉醇溶剂化物(DMF)将252mg紫杉醇溶解于12.5mL DMF和6.25mL CH3CN中并将其在20℃下进行搅拌。以一份的形式向其中加入6.25mL 0.1％醋酸。将该溶液加热至40℃，并在1分钟内以三份的形式向其中再加入12.5mL 0.1％的水性醋酸。将该溶液在40℃下放置1小时，在这时没有观察到结晶。将该混合物在90分钟内在进行最小程度搅拌的情况下冷却至20℃，在这时观察到形成一种浆液，将其在20℃下放置1小时。其后，将该混合物在30分钟内加热至58℃以使得该浆液变稀。在搅拌的同时将该混合物在58℃下加热30分钟，然后将其在90分钟内冷却至20℃。将其在20℃下放置16小时后(在此期间，该浆液变稠)，在搅拌的同时将该混合物加热至58℃(并且观察到该浆液变稀)。将该浆液在58℃下放置1小时。然后在1分钟内以3份的形式向其中加入12.5mL0.1％的醋酸，在这时该浆液显著变稠。将该浆液在58℃下搅拌30分钟，然后在3小时内将其冷却至20℃并在搅拌的同时将其在20℃下进行放置。观察到该浆液稍微有些沉淀(约20％)。取出约2mL的浆液并在约5分钟的时间内将其进行过滤。将滤饼用25％CH3CN/0.1％醋酸(2mL)进行洗涤，然后将其在40℃下在高真空干燥16小时，得到210.0mg固体。由1H NMR光谱测得的DMF与紫杉醇的摩尔比为约0.5∶1.0，其与E型的单晶结构相一致。
E型DMF溶剂化物的单晶(针状)在-53℃下具有下面的晶胞参数晶胞大小a＝9.512(1)Ab＝27.787(4)c＝34.788(5)体积9,1953空间群P212121正交晶晶胞的理想组成8紫杉醇，4DMF，8H2O密度(所计算的)1.312g/cm3图5和6对E型中紫杉醇和溶剂分子的独特排列进行了说明，其是以下表3中所列的小数级原子坐标为基础的。除一些轻微的天然晶格膨胀外，该晶体结构在环境条件下保持相同。因此，表3中的近似坐标将根据测量温度而变化。这些坐标中的统计学变量也可以与所报告的误差值相一致的存在。
表3
实施例5紫杉醇的DMAC溶剂化物将250mg紫杉醇溶解于12.5mL DMAC和6.25ml乙腈中并将其在20℃下进行搅拌。向其中加入6.25mL 0.1％的醋酸并将所得的混合物加热至40℃。在1分钟内以3份的形式再向其中加入12.5mL0.1％的醋酸溶液并将所得的混合物在40℃下加热1小时，在此时观察到开始出现沉淀。在最小程度搅拌的情况下在90分钟内将该混合物冷却至20℃并将其在该温度下放置1小时，在该时间结束时该混合物是一种浓稠的浆液。然后将该浆液在30分钟内加热至58℃并将其在搅拌的情况下在该温度下再放置30分钟，观察到该浆液变稀。将该变稀了的浆液在90分钟内冷却至20℃并将其在20℃下放置16小时。在搅拌的条件下，将所得的混合物加热至58℃。观察到一些沉淀。将该浆液在58℃下放置1小时。在1分钟内以3份的形式向其中加入12.5mL 0.1％的醋酸。将该浆液在58℃下再放置30分钟。将该混合物在3小时内冷却至20℃并将其在进行搅拌的情况下在该温度下进行放置。在约10天后，80％的混合物被沉积。取出2mL浆液，迅速过滤并用2mL 25％乙腈和0.1％醋酸的溶液对其进行洗涤。得到一种结构未知的固体。但是，1H NMR光谱分析表明DMAC与紫杉醇的摩尔比为1.0∶1.0。在洗涤后固体出现这种数量的溶剂表明形成了一种晶态的溶剂化物。
实施例6紫杉醇的DMSO溶剂化物将253mg紫杉醇溶解于12.5mL DMSO和6.25mL CH3CN和6.25mL 0.1％醋酸水溶液中。将所得的混合物加热至40℃并再向其中加入12.5mL 0.1％的醋酸。将该混合物在40℃下加热30分钟，观察到了显著的沉淀。将该浆液在90分钟内冷却至20℃并将其在20℃下搅拌1小时。然后将该浆液在30分钟内加热至58℃并将其在58℃下放置30分钟，迅速搅拌5分钟，然后在3小时内将其冷却至20℃并将其在20℃下放置30分钟。将该溶液在30分钟内加热至58℃并将其在该温度下放置30分钟，然后迅速搅拌5分钟。将该溶液暂时性地加热至67℃并向其中加入12.5mL 0.1％水性醋酸。然后使该溶液在3小时内冷却至20℃，然后将其在20℃下放置18小时。在观察到沉淀完全后，观察到一些沉积物(约20％至30％)。将该浆液用滤纸进行过滤，用2mL25％ CH3CN/0.1％醋酸进行洗涤。将滤饼在40℃下在高真空下干燥18小时，产生230mg结构未知的固体。但是，根据1H NMR分析，测得的DMSO与紫杉醇的摩尔比为约1.3∶1。在洗涤后固体中出现这种数量的溶剂表明形成了一种晶态的溶剂化物。
实施例7紫杉醇的DMPU溶剂化物将258mg紫杉醇溶解于12.5mL DMPU、6.25mL CH3CN和6.25mL0.1％醋酸中。再向其中加入12.5mL 0.1％的醋酸。进行上面实施例1所述的温度振动方案。在将其放置10至20小时后，对浆液进行分析并测得沉淀完全。没有观察到沉淀。将浆液在15分钟内进行过滤并用3mL 0.1％醋酸/25％CH3CN溶液对其进行洗涤。将滤饼在40℃下在高真空下干燥18小时，得到235mg结构未知的固体。但是，1H NMR光谱分析表明DMPU∶紫杉醇的摩尔比为约1.0∶1.0。在固体中出现这种数量的溶剂表明形成了一种晶态溶剂化物。
比较实施例1将1.062g粗紫杉醇物质的样品溶解于4ml丙酮中并通过向其中加入0.1％水性醋酸来进行沉淀，使其沉淀至基本与上面所述方法相一致的浊点。循环加热和冷却该混合物并向其中加入更多的丙酮(2mL)和水。观察到缓慢进行沉淀。将该混合物搅拌一整夜(16小时)并将该物质倒出。HPLC分析测得沉淀物的纯度没有增加至用酰胺(amidic)有机溶剂或DMSO进行结晶时所获得的相同程度。通过显微镜检查，观察到针形结晶，但是没有进一步对溶剂含量进行定性或检查。但是，注意到当根据实施例1或4-7的操作使用纯紫杉醇和丙酮时，1H NMR分析观察到为1∶10的相对较低的溶剂紫杉醇比。
实施例8细胞毒性用T.L.Riss，等人在“MTT、XTT、和一种新型四唑鎓化合物——MTS用于体外增殖和化学敏感性试验的比较，”Mol.Biol.Cell3(Suppl.)184a，1992年中所报道的MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-硫苯基)-2H-四唑鎓，内盐)试验用细胞系对实施例1的NMPO溶剂化物的细胞毒性进行评估。将细胞以4,000个细胞/孔的数量接种在96孔微量滴定板中，24小时后向其中加入药物并将其连续稀释。将细胞在37℃下培养72小时，在这时以333μg/ml(终浓度)向其中加入四唑鎓染料MTS和25μM(终浓度)的电子偶联剂甲基硫酸吩嗪。活细胞中的脱氢酶降低了MTS，从而在492nm下形成了吸收光，可以用分光光度法对其进行定量。吸收越多，活细胞的数目越多。将结果表示为IC50，其是将未进行处理的对照细胞的细胞增殖(即，在450nm下的吸收)抑制50％所需的药物浓度。图7和图8中所示的数据表明NMPO的紫杉醇溶剂化物具有可以与紫杉醇相媲美的体外生物活性。
权利要求
1.一种包含紫杉醇和水性溶剂的晶态溶剂化物，所说的水性溶剂选自二甲基亚砜、N，N′-二甲基甲酰胺、N，N′-二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮、1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮、和乙腈以及其组合。
2.如权利要求1所述的溶剂化物，其中所说的溶剂是N-甲基-2-吡咯烷酮和乙腈。
3.如权利要求1所述的溶剂化物，其中每两个紫杉醇分子包含约三个水分子、约两个N-甲基-2-吡咯烷酮分子、和约一个乙腈分子。
4.如权利要求1所述的溶剂化物，其中所说的溶剂是N，N′-二甲基甲酰胺。
5.如权利要求4所述的溶剂化物，其中每两个紫杉醇分子包含约一个N，N′-二甲基甲酰胺分子。
6.如权利要求1所述的溶剂化物，其中所说的溶剂是N，N′-二甲基乙酰胺。
7.如权利要求6所述的溶剂化物，其中每一个紫杉醇分子包含约一个N，N′-二甲基乙酰胺分子。
8.如权利要求1所述的溶剂化物，其中所说的溶剂是1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮。
9.如权利要求1所述的溶剂化物，其中每一个紫杉醇分子包含约一个1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮分子。
10.如权利要求1所述的溶剂化物，其中所说的溶剂是二甲基亚砜。
11.如权利要求10所述的溶剂化物，其中每个紫杉醇分子包含约1-2个二甲基亚砜分子。
12.D型晶态的如权利要求1所述的紫杉醇溶剂化物。
13.D型晶态的如权利要求3所述的紫杉醇溶剂化物。
14.E型晶态的如权利要求1所述的紫杉醇溶剂化物。
15.E型晶态的如权利要求5所述的紫杉醇溶剂化物。
16.一种制备紫杉醇的方法，其包括将如权利要求1所述的晶态溶剂化物转化成A型紫杉醇。
17.如权利要求16所述的方法，其中所说的转化包括将所说的溶剂化物在升高的温度下在真空下去溶剂化从而获得A型紫杉醇。
18.一种用于制备晶态紫杉醇溶剂化物的方法，其包括a)形成一种包含下面物质的混合物(i)包含紫杉醇的物质；和(ii)一种或多种有机溶剂，每种所说的溶剂具有可以与该溶剂化物的晶态排列中的溶剂部位相容的溶剂分子；和b)将溶剂从该混合物中除去以回收一种固体的、在晶体结构内具有紫杉醇和溶剂分子的晶态紫杉醇溶剂化物。
19.如权利要求18所述的方法，其中每种所说溶剂是有机溶剂的水性溶液。
20.如权利要求19所述的方法，其中所说的有机溶剂选自二甲基亚砜、N，N′-二甲基甲酰胺、N，N′-二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮、1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮、和乙腈以及其组合。
21.如权利要求18所述的方法，其中所说的晶态紫杉醇溶剂化物包含由约两个紫杉醇分子所形成的二聚物和约0.5至约2个有机溶剂分子。
22.如权利要求18所述的方法，其在开始步骤(b)前进一步包含将步骤(a)的混合物进行温度振动。
23.如权利要求18所述的方法所形成的晶态紫杉醇溶剂化物。
24.如权利要求20所述的方法所形成的晶态紫杉醇溶剂化物。
25.如权利要求20所述的方法所形成的晶态紫杉醇溶剂化物，其由约两个紫杉醇分子、约三个水分子、约2个N-甲基-2-吡咯烷酮分子和约一个乙腈分子所组成。
26.如权利要求20所述的方法所形成的晶态紫杉醇溶剂化物，其由约两个紫杉醇分子、约两个水分子和约一个N，N′-二甲基甲酰胺分子所组成。
27.一种包含约两个紫杉醇分子、约三个水分子、约2个N-甲基-2-吡咯烷酮分子和约一个乙腈分子的晶态紫杉醇溶剂化物。
28.一种包含约两个紫杉醇分子、约两个水分子和约一个N，N′-二甲基甲酰胺分子的晶态紫杉醇溶剂化物。
29.一种对包含紫杉醇的物质进行处理以获得紫杉醇的方法，其包括a)形成一种包含下面物质的混合物(i)包含紫杉醇的物质，和(ii)包含一种或多种有机溶剂的水性溶液；和b)从该混合物中除去溶剂从而分离出一种晶态紫杉醇溶剂化物；和c)将该晶态固体去溶剂化。
30.如权利要求29所述的方法，其中在步骤(c)中将晶态溶剂化物进行加热。
31.如权利要求29所述的方法，其中在步骤(b)中，将所说的混合物进行温度振动。
32.如权利要求29所述的方法，其中在步骤(a)中，向该混合物中加入酸化剂。
33.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含a)抗肿瘤有效量的根据权利要求16的方法所获得的紫杉醇；和b)一种或多种选自载体、赋形剂、稀释剂和助剂的组分。
34.如权利要求33所述的组合物，其包含A型紫杉醇。
35.一种治疗人类肿瘤的方法，其包括使用抗肿瘤有效量的根据权利要求16的方法所获得的紫杉醇。
36.具有由a)紫杉醇分子；和b)位于晶体结构的溶剂部位中的溶剂分子所组成的晶态排列的D型紫杉醇溶剂化物。
37.具有由a)紫杉醇分子；和b)位于晶体结构的溶剂部位中的溶剂分子所组成的晶态排列的E型紫杉醇溶剂化物。
38.一种包含溶剂的正交晶的紫杉醇溶剂化物晶体，其特征为晶胞参数a为约9.54，b为约28.46，和c为约37.24；和空间群对称P 212121；该晶体在与表1所表示的小数级原子坐标相一致的排列和构象中包含8个紫杉醇分子；其中紫杉醇分子的排列形成了溶剂部位，所说溶剂部位的具体尺寸根据其中所包含的溶剂而变化。
39.一种包含溶剂的正交晶的紫杉醇溶剂化物晶体，其特征为晶胞参数a为约9.51，b为约27.79，和c为约34.79；和空间群对称P 212121；该晶体在与表1所表示的小数级原子坐标相一致的排列和构象中包含8个紫杉醇分子；其中紫杉醇分子的排列形成了溶剂部位，所说溶剂部位的具体尺寸根据其中所包含的溶剂而变化。
全文摘要
用极性、质子惰性有机溶剂使生物学活性的紫杉醇晶态溶剂化物沉淀。还公开了一种药物组合物以及该新型溶剂化物的制备以及其用作抗肿瘤剂的应用。
文档编号C07D409/12GK1596250SQ02823790
公开日2005年3月16日 申请日期2002年11月25日 优先权日2001年11月30日
发明者D·A·贝尼尼, J·Z·古古塔斯, J·D·迪马科 申请人:布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司