专利名称：羧肽酶g2的t细胞表位的制作方法
技术领域：
本发明涉及尤其是用于对人施用的、特别是用于治疗的多肽。所述的多肽是经修饰的多肽，其中所述的修饰使得上述多肽在施用于人类受试者时引起免疫应答的倾向减弱。本发明尤其涉及对细菌羧肽酶G2(CPG2)的修饰，该修饰使得体内使用时这些CPG2蛋白基本上无免疫原性，或比任一未经修饰的相应蛋白的免疫原性低。此外，本发明还涉及来源于所述的非修饰蛋白质的T细胞表位肽，通过它们使产生免疫原性降低的经修饰CPG2变体成为可能。
背景技术：
有许多例子表明治疗蛋白的效率受限于针对所述治疗蛋白的干扰性免疫反应。已有若干种小鼠单克隆抗体表现出治疗多种人类疾病的前景，但在某些情况下由于诱导出相当程度的人抗鼠抗体(HAMA)应答而未能成功应用[Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.1351530-1535]。对于单克隆抗体，已开发了多种技术以试图减弱HAMA应答[WO 89/09622；EP0239400；EP 0438310；WO 91/06667]。这些重组DNA方法通常是减少最终的抗体构建体中小鼠的遗传信息，同时增加最终构建体中人的遗传信息。尽管如此，在许多情况下，所得的“人源化”抗体仍然引起患者的免疫应答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 681417-1420]。
抗体不是唯一一类作为治疗剂施用的可引起免疫应答的多肽分子。即使是人源的并在人与人之间具有相同氨基酸序列的蛋白质仍可在人体中诱导免疫应答。明显的实例包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的治疗性应用(Wadhwa，M.等人(1999)临床癌研究(Clin.Cancer Res.)51353-1361)和干扰素α2的治疗性应用(Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein，R.等人(1988)新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)3181409-1413)。在这些人蛋白具有免疫原性的情况下，可能发生了对这些蛋白的免疫耐受的破坏，否则对这些蛋白的免疫耐受将在这些受试者体内运行。
当人蛋白被作为替代治疗，例如在蛋白的组成性缺乏如血友病A、血友病B、高歇氏病(Gauchers disease)和许多其他疾病的遗传性疾病中，情况就不同了。在这些情况下，治疗性替代蛋白可能一开始就作为外来分子而产生免疫应答，并且当个体能够产生针对该治疗剂的免疫应答时，该治疗的功效将大打折扣。
不管该蛋白治疗剂被宿主免疫系统视作外来分子还是本来存在的对该分子的耐受被克服了，对该蛋白的免疫反应的机理是相同的。诱导免疫应答的主要因素是在蛋白中存在可经由MHCII类分子的呈递作用激活T-细胞活性的肽(即所谓的T-细胞表位)。此类T-细胞表位通常定义为任何能够与MHCII类分子结合的氨基酸残基序列。隐含地，″T-细胞表位″是指当其与MHC分子结合时可被T-细胞受体(TCR)识别的表位，并且至少原则上，这种表位可以通过与TCR相互作用而激活这些T-细胞以促进T-细胞应答。
MHCII类分子为一组在T辅助细胞的选择和活化中起中心作用的高度多态性蛋白质。人类白细胞抗原群DR(HLA-DR)为该组蛋白质的主要同种型，但是，同种型HLA-DQ和HLA-DP行使相类似的作用。人群中的每一个体具有二至四个DR等位基因，两个DQ和两个DP等位基因。已解析了许多DR分子的结构，这些结构揭示了一个具有一些可结合肽的疏水残基(口袋残基)的疏水口袋的敞口肽结合沟[Brown等人，自然(Nature)(1993)36433；Stern等人(1994)自然(Nature)368215]。确定II类分子的不同同种异型的多态性促成了肽结合沟内用于结合肽的不同表面的大量多样性，并在群体水平上确保了在识别外源蛋白质并引起对病原生物体的免疫应答的能力方面有最大的灵活性。
针对治疗性蛋白的免疫应答通过MHCII类肽呈递途径进行。其间外来蛋白经吞噬和加工后与DR、DQ或DP型MHCII类分子结合以进行呈递。MHCII类分子由专门抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞、树突状细胞等表达。通过MHCII类肽复合体与T细胞表面的关联性T-细胞受体的相互作用，及与某些其他共受体，如CD4分子的交联结合可诱导T-细胞进入激活状态。上述激活作用可导致细胞因子释放，进一步激活其他淋巴细胞如B细胞产生抗体或激活T杀伤细胞形成完整的细胞免疫应答。
T细胞表位的鉴定是消除表位的第一步，然而，本领域中少有将表位鉴定和表位去除整合为一个方案的清楚的例子。因此，WO98/52976和WO00/34317中公开了鉴定具有与人MHCII类DR同种异型亚群结合的潜在能力的多肽序列的计算机穿线方法(computational threadingapproaches)。这些教导中，利用目的蛋白中合理的氨基酸置换除去预测的T细胞表位。然而，在该方案和其他基于计算的表位鉴定方法[Godkin，A.J.等人(1998)免疫学杂志(J.Immunol.)161850-858；Stumiolo，T.等人(1999)自然生物技术(Nat.Biotechnol.)17555-561]中，预测的能够结合MHCII类分子的肽可能不会在所有情况下(尤其是在体内由于加工途径或其他现象)都起T细胞表位的作用。此外，对T细胞表位预测的计算方法一般不能预测具有DP或DQ限制的表位。
同样，例如用限定的MHC同种异型B细胞系作为MHCII类结合表面的来源以测量合成肽结合MHCII类分子的能力的体外方法可以应用于MHCII类配体的鉴定[Marshall K.W.等人(1994)免疫学杂志(J.Immunol.)1524946-4956；O′Sullivan等人(1990)免疫学杂志(J.Immunol.)1451799-1808；Robadey C.等人(1997)免疫学杂志(J.Immunol)1593238-3246]。然而，这些技术不适于筛选各种MHC同种异型的多种潜在表位，也不能确定结合肽能够起T细胞表位的作用。
最近利用重组MHC分子与合成肽的可溶性复合体的技术已经得到应用[Kern，F.等人(1998)自然医药(Nature Medicine)4975-978；Kwok，W.W.等人(2001)免疫学趋势(TRENDS in Immunology)22583-588]。这些试剂和方法用于鉴定人或实验动物受试者的外周血样中能结合特定MHC-肽复合物的T细胞克隆的存在，但是这些试剂和方法不适于筛选各种MHC同种异型的多种潜在表位。
T细胞活化的生物学测定提供了一个解读试验肽/蛋白序列引起免疫应答的能力的实用选择。该类方法的例子包括Petra等人用对细菌蛋白葡萄球菌激酶的T细胞增殖进行测定，然后用合成肽刺激T细胞系的表位作图[Petra，A.M.等人(2002)免疫学杂志(J.Immunol.)168155-161]。类似地，使用破伤风毒素蛋白的合成肽进行T细胞增殖测定导致明确了该毒素免疫显性的表位区[Reece J.C.等人(1993)免疫学杂志(J.Immunol.)1516175-6184]。WO99/53038公开了一种方法，该方法利用分离的人免疫细胞亚型，促进它们的体外分化，在合成的目的肽存在时培养细胞，并测定培养的T细胞中任何诱导的增殖来确定受试蛋白的T细胞表位。同样的技术也被Stickler等人[Stickler，M.M.等人(2000)免疫治疗杂志(J.Immunotherapy)23654-660]描述过，在这两个例子中，该方法都用于检测细菌枯草杆菌蛋白酶的T细胞表位。这种技术需要小心应用细胞分离技术和补充多种细胞因子的细胞培养基以得到所需的免疫细胞亚型(树突状细胞、CD4+和/或CD8+T细胞)，并且无助于使用多种供体样品的快通量筛选。
根据上述描述，由此可能期望鉴定并去除或至少减少特定的原则上具有治疗价值但原本具有免疫原性的肽、多肽或蛋白中的T-细胞表位。羧肽酶G2(这里简写为CPG2)是这些有治疗价值的分子之一。
CPG2是最初从假单胞菌属菌株RS-16中分离得到的一种细菌酶(EC编号为3.4.17.11)。这种酶具有广泛的底物特异性并催化C-末端的谷氨酸残基从多种不同的N-酰基基团释放。编码该酶的基因已经得到描述[Minton，N.P.等(1984)基因(Gene)311-3]，并且该蛋白质的晶体结构也已经被阐明[Roswell，S.等(1997)结构(Structure)5337-347]。这种酶以前已经用于治疗癌症的抗体导向的酶前体药物治疗(ADEPT)策略，并且还被用于实验性基因导向的酶前体药物疗法(GDEPT)。在ADEPT方法中，酶分子被连接于靶向部分，如抗体或保留抗原结合特异性的抗体片段[Napier，M.P.等(2000)临床癌研究6765-772]。连接到抗体上可以通过化学交联剂实现或者将抗体CPG2酶作为融合蛋白在重组宿主生物如大肠杆菌(E.coli)中表达来实现连接。
因此本发明涉及到CPG2酶，并且这种蛋白质野生型的氨基酸序列以单字母密码描述于下QKRDNVLFQAATDEQPAVIKTLEKLVNIETGTGDAEGIAAAGNFLEAELKNLGFTVTRSKSAGLVVGDNIVGKIKGRGGKNLLLMSHMDTVYLKGILAKAPFRVEGDKAYGPGIADDKGGNAVILHTLKLLKEYGVRDYGTITVLFNTDEEKGSFGSRDLIQEEAKLADYVLSFEPTSAGDEKLSLGTSGIAYVQVNITGKASHAGAAPELGVNALVEASDLVLRTMNIDDKAKNLRFNWTIAKAGNVSNIIPASATLNADVRYARNEDFDAAMKTLEERAQQKKLPEADVKVIVTRGRPAFNAGEGGKKLVDKAVAYYKEAGGTLGVEERTGGGTDAAYAALSGKPVIESLGLPGFGYHSDKAEYVDISAIPRRLYMAARLIMDLGAGK尽管可以得到治疗用量的CPG2融合蛋白，但在施用于人类受试者时仍需要对它的体内特性进行加强。在这方面，非常希望提供具有减少或者没有可能在人类受试者中诱导免疫应答的CPG2。此类蛋白质预期在人体内的循环时间将增加。本发明提供了预期可在体内展现增强特性的CPG2蛋白的经修饰形式。
其他人已经提供了CPG2分子[WO88/07378]，包括经修饰的CPG2[US，6,004,550]，但是这些教导没有说明T细胞表位对于该蛋白免疫原性特性的重要性，也没有考虑根据本发明的方案以特异并受控的方式直接影响所述特性。
本发明的一个特定目的是提供经修饰的CPG2蛋白，这些蛋白质的免疫特性是通过降低潜在的T细胞表位数量的方式进行修饰的。
发明概述和描述本发明提供了CPG2的经修饰形式，其中免疫特性通过降低潜在的T细胞表位数量的方式修饰。本发明公开了在CPG2一级序列内鉴定到的由于具有与MHCII类分子结合的可能性而是潜在T-细胞表位的序列。该公开尤其涉及含有390个氨基酸残基的成熟CPG2蛋白。本发明公开了在人中具免疫原性的CPG2一级序列的主要区域，因此，本发明提供了对这些序列进行修饰以消除或者降低这些位点的免疫原性效力所需的关键信息。
在一个实施方案中，含有免疫原性区的合成肽可以在药物组合物中提供以促进对整个分子的耐受原应答。在另一个实施方案中，本文公开的在表位区内经修饰的CPG2分子可以用于药物组合物中。
总之，本发明涉及下述内容·在幼稚T细胞测定中使用一组合成肽以对CPG2的免疫原性区作图；·在幼稚T细胞测定中使用一组CPG2蛋白变体选择体外呈现最弱免疫原性的变体；·在幼稚T细胞测定中使用一组合成的CPG2肽变体选择体外呈现最弱免疫原性的肽序列；·使用T细胞刺激的生物学分析选择在幼稚T细胞测定中刺激指数低于野生型CPG2分子的刺激指数，且优选地低于2.0的CPG2蛋白变体；·在幼稚T细胞测定中最初测得的刺激指数大于1.8、优选大于2.0的CPG2衍生肽序列，其中所述肽被最小程度地修饰并在幼稚T细胞测定中检验发现其刺激指数有所降低；·CPG2衍生肽序列和野生型蛋白序列具有100％的氨基酸同一性，并且能够在T细胞测定中引起的刺激指数为1.8或者更大、优选大于2.0；·如上所述的CPG2肽序列，其被修饰而和野生型蛋白序列的氨基酸同一性小于100％，并且在T细胞测定中引起的刺激指数小于2.0；·一种含有经修饰的CPG2分子，该修饰使得在T细胞测定中测试时引起比未修饰的蛋白分子降低的刺激指数；·一种CPG2分子，其中用T细胞测定对免疫原性区进行了作图，然后对其进行修饰，使得在T细胞测定中重新试验时，经修饰的蛋白引起的刺激指数比亲本(未修饰的)分子小、最优选小于2.0；·一种经修饰的分子，其具有CPG2的生物学活性，且当其在体内应用时基本上无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物学活性但未经修饰的分子；·如上所述的CPG2分子，其中，所述的免疫原性丧失是通过从原始的未经修饰的分子中去除一个或多个T-细胞表位而实现的；·如上所述的CPG2分子，其中，所述的免疫原性丧失是通过减少能与来自所述分子的肽相结合的MHC同种异型的数量来实现的；·如上所述的CPG2分子，其中，去除了一个T-细胞表位；·如上所述的CPG2分子，其中，所述原本存在的T-细胞表位是MHCII类配体或通过呈递在II类分子上后有刺激或结合T-细胞的能力的肽序列；·如上所述的分子，其中该肽序列选自如表1或表2中所示的肽序列；·如上所述的分子，其中该分子包含一个或多个选自表4或表5的氨基酸替代；·如上所述的分子，其中在任何原本存在的T细胞表位中1-9个氨基酸残基，优选地1个氨基酸残基发生了改变；·如上所述的分子，其中，氨基酸残基的改变为在特定位点处用另外的氨基酸残基替代原本存在的氨基酸残基、向原本存在的氨基酸残基添加另外的氨基酸残基或将原本存在的氨基酸残基缺失；·如上所述的分子，如上所述的分子，其中，如果必要，一般可通过替代、添加或缺失特定氨基酸进行额外的进一步改变，以恢复所述分子的生物学活性；·如上所述的分子，其中改变是在任一或所有下面列出的序列(A)-(K)的连续残基串中一个或多个残基处进行的，其中所述序列来自CPG2野生型序列，此处用单字母代码表示；
A.＝VGKIKGRGGKNLLLMSHMDTVYLKGILAK；B.＝KAYGPGIADDKGGNAVILHTLKLLKEYG；C.＝LFNTDEEKGSFGSRDLIQEEA；D.＝KLADYVLSFEPTSAGDEKLSLGTSG；E.＝VNITGKASHAGAAPELGVNALVEASDL；F.＝KAKNLRFNWTIAKAGNVSNIIPASATLNAD；G.＝ADVKVIVTRGRPAFNAGEGGKKLVDKA；H.＝KKLVDKAVAYYKEAGG；I.＝YKEAGGTLGVEERTGGG；J.＝TDAAYAALSGKPVIESLGLPGFGYK.＝LEKLVNIETGTGDAE；·包含上述序列(A)-(K)中任一序列的至少9个连续残基的肽分子；·其序列与序列(A)-(K)中任一肽序列的氨基酸同一性大于90％的上述肽分子；·其序列与序列(A)-(K)中任一肽序列的氨基酸同一性大于80％的上述肽分子；·包含与上述序列(A)-(K)中的一个或多个序列相同或充分同源的序列元件的肽分子；·上述的能结合MHCII分子的肽序列；·药物组合物，其包含具有结合MHCII类活性的上面的肽或经修饰肽的任何一种；·DNA序列或分子，其编码如上或如下所定义的任何一种所述特异的经修饰分子；·含有具CPG2生物学活性的经修饰分子的药物组合物；·如上面和/或权利要求书中定义的药物组合物，其任选地还包含可药用载体、稀释剂或赋形剂；·用于制备此处定义的具有CPG2生物学活性的经修饰分子的方法，所述方法包括以下步骤(i)确定所述多肽或其中一部分的氨基酸序列；(ii)通过任意方法，包括利用体外或硅片上(in silico)的技术或生物学试验确定所述肽与MHC分子的结合，由此鉴定所述蛋白的氨基酸序列中潜在的一个或多个T-细胞表位；(iii)设计新的序列变体，其中，经鉴定的潜在T-细胞表位内有一个或多个氨基酸经过修饰，由此基本上减弱或去除了所述T-细胞表位的活性，这一效果可由体外或硅片上(in silico)的技术或生物学试验通过所述肽与MHC分子的结合来确定；(iv)通过重组DNA技术构建所述序列变体，并检测所述的变体以便鉴定一个或多个具有所需性质的变体；和(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)；·如上所述的方法，其中步骤(iii)是通过在任何原本存在的T-细胞表位中替代、添加或缺失1-9个氨基酸残基来进行的；·如上所述的方法，其中，所述的改变是参照同源蛋白质序列和/或硅片上(in silico)建模技术进行的；·由上述的13mer T-细胞表位肽中的至少9个连续的氨基酸残基组成的肽序列，及其在制备体内使用时基本上没有免疫原性或免疫原性低于具有相同生物学活性的任何未修饰分子的CPG2中的用途；·具有以下结构的CPG2分子X0QKRDNVLFQAATDEQPAVIKTLEKLVNIETGTGDAEGIAAAGNFLEAELKNLGFTVTRSKSAGLVVGDNIVGKX1KGRGGKNLX2LX3SHMDTVYX4KGILAKAPFRVEGDKAX5GPGX6ADDKGGNAX7IX8HTX9X10X11X12KEYGVRDYGTITVX13FNTDEEKGSFGSRDLX14QEEAKLADYX15X16SX17EPTSAGDEKX18SLGTSGIAYVQVNITGKASHAGAAPEX19GX20NAX21X22EASDLVLRTMNIDDKAKNX23RFNX24TX25AKAGX26X27SX28X29X30PASATX31NADVRYARNEDFDAAMKTLEERAQQKKLPEADX32KX33IVTRGRPAFNAGEGGKX34X35X36DKAX37AX38X39KEAGGTLGVEERTGGGTDAAYAALSGKPVIESLGLPGFGYHSDKAEYVDISAIPRRLYMAARLIMDLGAGK其中X0任选地为靶向部分，如抗体结构域；
X1为I，T；X2为L，A；X3为M，K；X4为L，I；X5为Y，T；X6为I，A；X7为V，A；X8为L，A；X9为L，T，A；X10为K，T；X11为L，M，A；X12为L，T，A；X13为L，G，T；X14为I，T，A；X15为V，A；X16为L，T，G；X17为F，A；X18为L，A；X19为L，A；X20为V，A；X21为L，A；X22为V，T，A；X23为L，A；X24为W，A，H；X25为I，A；X26为N，T，A；X27为V，T；X28为N，T，A；X29为I，T，A；X30为I，T，A；X31为L，T，A，I；X32为V，A；X33为V，A；X34为K，T；X35为L，A；X36为V，A；X37为V，S，T，A；X38为Y，T，A；X39为Y，S，T，A；且不包括同时为以下氨基酸残基的情况X1＝I，X2＝L，X3＝M，X4＝L，X5＝Y，X6＝I，X7＝V，X8＝L，X9＝L，X10＝K，X11＝L，X12＝L，X13＝L，X14＝I，X15＝V，X16＝L，X17＝F，X18＝L，X19＝L，X20＝V，X21＝L，X22＝V，X23＝L，X24＝W，X25＝I，X26＝N，X27＝V，X28＝N，X29＝I，X30＝I，X31＝L，X32＝V，X33＝V，X34＝K，X35＝L，X36＝V，X37＝V，X38＝Y且X39＝Y。
术语″T细胞表位″根据本发明的理解是指这样的氨基酸序列，其可以结合MHCII类分子、可刺激T细胞和/或也可在与MHCII类的复合体中结合(不必可测得地活化)T细胞。
此处及后附权利要求中所用的术语“肽”是指包含两个或多个氨基酸的化合物。氨基酸之间通过肽键(定义见下)相连。肽的生物生产中涉及20种不同的天然氨基酸，任意数量的所述氨基酸可按任意的顺序连接形成肽链或环。用于生物生产肽中的天然氨基酸全部具有L-构型。可应用常规的合成方法利用L-氨基酸、D-氨基酸或两种不同构型的氨基酸的各种组合制备合成肽。一些肽仅包含少量的氨基酸单元。例如含有不到10个氨基酸单元的短肽有时被称作“寡肽”。其他的包含大量氨基酸残基，例如达100个或更多个氨基酸残基的肽称作“多肽”。习惯上将含有3个或3个以上氨基酸的任何肽链看作“多肽”，而通常将“寡肽”视为特定类型的短“多肽”。因而本文所提到的“多肽”应理解为也包括“寡肽”。而且，所提到的“肽”包括多肽、寡肽和蛋白。不同的氨基酸排列形式形成不同的多肽或蛋白。因此，多肽的数量以及可形成的不同蛋白的数量实际上是无限的。“α碳(Cα)”是肽链的碳-氢(CH)组分中的碳原子。“侧链”是Cα的侧基，其可包含简单的或复杂的基团或部分，且具有与所述肽的大小相比可显著变化的外形大小。
本发明可应用于与此处公开的CPG2具有基本上相同的一级氨基酸序列的任何CPG2分子，因此包括利用基因工程手段或其他方法获得的、可能包含多于或少于390个氨基酸残基的CPG2分子。从其他来源(包括假单胞菌属的不同菌株和其它生物体)鉴定的CPG2蛋白共有本公开的许多肽序列，并且共有许多与所公开的序列基本相同的肽序列。这些蛋白序列因此同样都位于本发明范围之内。
本发明是为了克服实际应用中存在的下述问题，即将可溶性蛋白引入自体生物中可引发免疫应答，产生可与所述可溶性蛋白相结合的宿主抗体。本发明通过提供施用于人宿主时引起免疫应答的倾向发生改变的CPG2蛋白以试图解决这个问题。根据本文描述的方法，发明人已经发现了含有驱动对该蛋白产生免疫应答的关键性T细胞表位的CPG2分子区域。
本发明中形成经修饰CPG2的总方法包括下述步骤(a)确定多肽或其中一部分的氨基酸序列；(b)通过任意方法，包括利用体外或硅片上(in silico)的技术或生物学试验确定所述肽与MHC分子的结合，由此鉴定所述蛋白的氨基酸序列中潜在的一个或多个T-细胞表位；(c)设计新的序列变体，其中，经鉴定的潜在T-细胞表位内有一个或多个氨基酸经过修饰，由此基本上减弱或去除了所述T-细胞表位的活性，这一效果可由体外或硅片上(in silico)的技术或生物学试验通过所述肽与MHC分子的结合来确定。构建此序列变体以避免由所述的序列变体产生新的潜在T-细胞表位，否则所述的新的潜在T细胞表位又通过此种方式进行修饰以基本上减弱或消除T-细胞表位活性；和(d)根据已知的重组技术通过重组DNA技术构建所述序列变体，并检测所述的变体以便鉴定一个或多个具有所需性质的变体。
对于步骤(b)中对潜在T-细胞表位的鉴定可依照本领域已公知的方法进行。在WO 98/59244；WO 98/52976；WO 00/34317中也公开了适当的方法，并可用于鉴定从CPG2衍生的肽对MHCII类分子的结合倾向。
在实施例1中公开了另一种非常有效的通过计算鉴定T-细胞表位的方法，它是本发明的优选实施方案。
涉及CPG2蛋白序列的根据上述方案中步骤(b)的分析结果列于表1。
表1CPG2中具有潜在人MHCII类结合活性的肽序列DNVLFQAATDEQP，NVLFQAATDEQPA，VLFQAATDEQPAV，PAVIKTLEKLVNI，AVIKTLEKLVNIE，KTLEKLVNIETGT，EKLVNIETGTGDA，KLVNIETGTGDAE，VNIETGTGDAEGI，EGIAAAGNFLEAE，GNFLEAELKNLGF，NFLEAELKNLGFT，AELKNLGFTVTRS，KNLGFTVTRSKSA，LGFTVTRSKSAGL，FTVTRSKSAGLVV，AGLVVGDNIVGKI，GLVVGDNIVGKIK，LVVGDNIVGKIKG，DNIVGKIKGRGGK，NIVGKIKGRGGKN，GKIKGRGGKNLLL，KNLLLMSHMDTVY，NLLLMSHMDTVYL，LLLMSHMDTVYLK，LLMSHMDTVYLKG，SHMDTVYLKGILA，DTVYLKGILAKAP，TVYLKGILAKAPF，VYLKGILAKAPFR，KGILAKAPFRVEG，GILAKAPFRVEGD，APFRVEGDKAYGP，FRVEGDKAYGPGI，KAYGPGIADDKGG，PGIADDKGGNAVI，
NAVILHTLKLLKE，AVILHTLKLLKEY，VILHTLKLLKEYG，HTLKLLKEYGVRD，LKLLKEYGVRDYG，KLLKEYGVRDYGT，KEYGVRDYGTITV，YGVRDYGTITVLF，RDYGTITVLFNTD，GTITVLFNTDEEK，ITVLFNTDEEKGS，TVLFNTDEEKGSF，VLFNTDEEKGSFG，GSFGSRDLIQEEA，RDLIQEEAKLADY，DLIQEEAKLADYV，AKLADYVLSFEPT，ADYVLSFEPTSAG，DYVLSFEPTSAGD，YVLSFEPTSAGDE，LSFEPTSAGDEKL，EKLSLGTSGIAYV，LSLGTSGIAYVQV，SGIAYVQVNITGK，IAYVQVNITGKAS，AYVQVNITGKASH，VQVNITGKASHAG，VNITGKASHAGAA，PELGVNALVEASD，LGVNALVEASDLV，NALVEASDLVLRT，ALVEASDLVLRTM，SDLVLRTMNIDDK，DLVLRTMNIDDKA，LVLRTMNIDDKAK，RTMNIDDKAKNLR，MNIDDKAKNLRFN，KNLRFNWTIAKAG，LRFNWTIAKAGNV，FNWTIAKAGNVSN，WTIAKAGNVSNII，GNVSNIIPASATL，SNIIPASATLNAD，NIIPASATLNADV，ATLNADVRYARNE，ADVRYARNEDFDA，VRYARNEDFDAAM，EDFDAAMKTLEER，AAMKTLEERAQQK，KTLEERAQQKKLP，KKLPEADVKVIVT，ADVKVIVTRGRPA，VKVIVTRGRPAFN，KVIVTRGRPAFNA，VIVTRGRPAFNAG，PAFNAGEGGKKLV，KKLVDKAVAYYKE，KLVDKAVAYYKEA，KAVAYYKEAGGTL，VAYYKEAGGTLGV，AYYKEAGGTLGVE，GTLGVEERTGGGT，LGVEERTGGGTDA，AAYAALSGKPVIE，AALSGKPVIESLG，KPVIESLGLPGFG，PVIESLGLPGFGY，ESLGLPGFGYHSD，LGLPGFGYHSDKA，PGFGYHSDKAEYV，FGYHSDKAEYVDI，AEYVDISAIPRRL，EYVDISAIPRRLY，VDISAIPRRLYMA，SAIPRRLYMAARL，RRLYMAARLIMDL，RLYMAARLIMDLG，LYMAARLIMDLGA检测T细胞表位的另一个重要技术方法是通过生物学T细胞测定。对于检测CPG2分子内的T细胞表位，一个特别有效的方法将是为了检验全长CPG2序列而检验来自CPG2序列的重叠肽，或者备选地，检验CPG2肽序列亚组如表1中全部或任何肽序列。对合成肽的检验是在体外培养的人T-细胞中测定引起增殖反应的能力。这类方法可使用取自健康供体的人幼稚T-细胞进行测定。本发明人已经建立了这种测定的实施方法，其中等于或大于2.0的刺激指数可用以测量诱导的增殖。刺激指数通常为测得的受试(多)肽的增殖分值(例如如果用3H-胸腺嘧啶掺入，则为每分钟的计数)与没用受试(多)肽接触的细胞中测得的增殖分值的商。这种类型的合适方法在实施例2中详述。测定的结果示于表2和
图1，其中列出了用实施例2中的方法证明可在人T-细胞中引发增殖反应的CPG2衍生肽序列。
表2可体外刺激人T-细胞的CPG2肽序列
当在生物学测定中鉴定了多种潜在表位，尤其是发现许多肽序列能够刺激T细胞时，也可以进行该蛋白的结构特征与其通过MHCII类呈递途径引起免疫应答的倾向的认识。例如，当知道了目的蛋白的晶体结构时，可以分析晶体学B因子分值以证明该蛋白内的结构无序，该晶体学B因子分值参数被认为与邻近生物学相关的免疫显性肽表位相关[Dai G.等(2001)生物化学杂志(J.Biological Chem.)27641913-41920]。当在CPG2晶体结构上进行这种分析[PDB ID1CG2，Rowsell，S.等(1997)，结构(Structure)5337]时表明很可能存在多个免疫显性表位，在建模的CPG2晶体结构的4条不同链中，至少在3条链中的至少11个不连续区域绘制出高于B因子平均分值的区域中央位置。在这11个区域中，9个位于已表明能在实施例2的幼稚T-细胞测定中引发增殖反应的肽的N-末端边缘。
这个数据与来自大量对特定肽有反应的天然供体的数据一起能提供该分子最具免疫显性区域的预测的排列等级。但是在实践中认识到这些区域中的每一个在人体内都是免疫原性的，因而需要以本发明的方案对其进行修饰。于是，关于上面定义的序列串(A)-(K)，这些序列可以排成下列顺序(A)，{(B)，(E)}，{(D)，(G)，(F)，(H)}，{(I)，(J)，(K)}；其中(A)被认为是该分子中免疫原性最强的序列。括号中的序列归为相同等级。这些区域已经列于表3，并分为主要表位区A-H和次要表位区I和J。这种差别是根据幼稚T-细胞测定中具反应的供体出现的频率划定的，由此对于所谓的“次要”表位区，来源于一系列供体中的一个供体的T-细胞可与代表该序列区域的合成肽起反应。与此相反，大部分对来源于多个供体的T-细胞有刺激作用的刺激物是位于主要表位区域的肽。所用的供体系列是所有不同的MHCII类同种异型的典型代表。
表3CPG2表位区
在实践中，将产生许多的变体CPG2蛋白并且检验所需的免疫和功能特征。尽管可以考虑应用其他方法，包括化学合成CPG2片段，但最优选的是通过众所周知的重组DNA技术产生变体蛋白质。构建和表达CPG2蛋白(包括经修饰的CPG2蛋白)的适宜方法提供于实施例3-5中。
本发明涉及这样的CPG2类似物，其中至少一个氨基酸残基的替代在导致该蛋白的活性显著降低或一个或多个潜在T细胞表位被除去的位置处进行。最优选提供CPG2分子，其中氨基酸修饰(例如替代)在亲本分子的免疫原性最强区进行。本发明主要的优选实施方案包括这样的CPG2分子，其中改变任何MHCII类配体以消除肽对MHC同种异型的结合或者减少该肽结合MHC同种异型的数目。本发明人已经发现并在此处公开了人体内CPG2分子的免疫原性区。可以理解，在某些特定情况下，向此处公开序列添加的区域可能成为免疫原性表位，例如用表达含有本发明序列相似序列的蛋白质或肽的病原体感染的情况下。无论如何，对于序列元件而言，重要的是充当MHCII类配体，并且，表1中公开的任何序列基本上被认为是本发明范围内的免疫原性表位。
为了除去T细胞表位，优选在所预测的肽序列中合适的位点进行氨基酸替代以完成T细胞表位活性的减小或者消除。实践中，合适的位点优选等同于在MHCII类结合沟所提供的口袋之一中结合的氨基酸残基。最优选的是在所述肽的称作P1或P1锚的位置改变在裂缝的第一口袋内的结合。公认地，肽的P1锚残基和MHCII类结合沟的第一口袋之间的结合相互作用的质量是整个肽的总结合亲和性的主要决定因素。在所述肽的这一位置的适当替代是替代为不易容纳到所述口袋中的残基，例如替代为更亲水的残基。所述肽中处于如下位置的氨基酸残基也被认为是落入本发明的范围内，所述位置为与MHC结合裂缝的其他口袋区域结合的位置。
可以理解，由给定的潜在T-细胞表位内的单一氨基酸替代导致该表位去除的路线是最优选的。也可以在单一表位内进行组合替代，例如，这可能对于单独定义的表位间彼此重叠的情况特别适宜。此外，在给定的表位内的单氨基酸替代或在一个表位内的组合氨基酸替代也可以在非对应于MHCII类结合沟的″口袋残基″的位置，而是在所述肽序列内的任意位点上进行。替代可参照同源结构或由本领域已知的硅片上(insilico)技术产生的结构方法进行，也可以根据本发明分子的已知结构特征进行。所有此类替代均落入本发明的范围内。
尤其是当与所列出的肽内进行组合替代时，可以考虑对上面所鉴定的肽之外的氨基酸进行替代。例如可以进行能恢复变体分子的结构和生物学活性的变化。此类代偿性变化和对CPG2多肽的特定氨基酸残基进行删除或添加而形成具有目标活性变体的变化，以及在任意公开的肽中的变化组合均包括于本发明领域范围之内。
本发明方案中所设计的特别优选的一系列CPG2分子突变体列于表4。此类替代是用实施例1中的计算方法选择的。文中以上定义并列出的表位区内的每一个替代也列于表3。
表4CPG2中的替代
人们认为也能使用其他已知的方法，并且这些方法的应用可能导致产生了特定选择性替代的定义。在任何情况下，特别期望的替代都将是一种能同时满足并行目的的替代，即既保留分子的功能活性，而同时又破坏作为一个或多个人MHCII类分子配体的位点内的肽序列和/或停止刺激与其相匹配的T-细胞受体的能力。一个已知的适用的方案可包括此处公开的表位区域内的随机突变和酶促功能性变体的选择。然后通过免疫学分析对所选择的变体进行独立的第二轮筛选。例如，适宜的免疫学筛选是使用变体序列合成肽和体外培养的人T-细胞或T-细胞系进行的T细胞增殖测定法。
另一种方法可以利用分子模建技术硅片上选择可同时满足上面略述的并行双目的。CPG2分子的结构模型可以用任何适宜的软件包进行检查，并且可以筛选出高度期望的替代。此类特别优选的替代的例子列于表5；这些替代被认为广泛适于CPG2结构，并且含有任一所列出替代的CPG2分子变体也被认为是本发明优选的实施方案。
表5CPG2中优选的替代
因此，通过下面的结构给出了一个特别优选的经修饰CPG2分子X0QKRDNVLFQAATDEQPAVIKTLEKLVNIETGTGDAEGIAAAGNFLEAELKNLGFTVTRSKSAGLVVGDNIVGKX1KGRGGKNLX2LX3SHMDTVYX4KGILAKAPFRVEGDKAX5GPGX6ADDKGGNAX7IX8HTX9X10X11X12KEYGVRDYGTITVX13FNTDEEKGSFGSRDLX14QEEAKLADYX15X16SX17EPTSAGDEKX18SLGTSGIAYVQVNITGKASHAGAAPEX19GX20NAX21X22EASDLVLRTMNIDDKAKNX23RFNX24TX25AKAGX26X27SX28X29X30PASATX31NADVRYARNEDFDAAMKTLEERAQQKKLPEADX32KX33IVTRGRPAFNAGEGGKX34X35X36DKAX37AX38X39KEAGGTLGVEERTGGGTDAAYAALSGKPVIESLGLPGFGYHSDKAEYVDISAIPRRLYMAARLIMDLGAGK
其中X0任选地为靶向部分，如抗体结构域；X1为I，T；X2为L，A；X3为M，K；X4为L，I；X5为Y，T；X6为I，A；X7为V，A；X8为L，A；X9为L，T，A；X10为K，T；X11为L，M，A；X12为L，T，A；X13为L，G，T；X14为I，T，A；X15为V，A；X16为L，T，G；X17为F，A；X18为L，A；X19为L，A；X20为V，A；X21为L，A；X22为V，T，A；X23为L，A；X24为W，A，H；X25为I，A；X26为N，T，A；X27为V，T；X28为N，T，A；X29为I，T，A；X30为I，T，A；X31为L，T，A，I；X32为V，A；X33为V，A；X34为K，T；X35为L，A；X36为V，A；X37为V，S，T，A；X38为Y，T，A；X39为Y，S，T，A；且不包括同时为以下氨基酸残基的情况X1＝I，X2＝L，X3＝M，X4＝L，X5＝Y，X6＝I，X7＝V，X8＝L，X9＝L，X10＝K，X11＝L，X12＝L，X13＝L，X14＝I，X15＝V，X16＝L，X17＝F，X18＝L，X19＝L，X20＝V，X21＝L，X22＝V，X23＝L，X24＝W，X25＝I，X26＝N，X27＝V，X28＝N，X29＝I，X30＝I，X31＝L，X32＝V，X33＝V，X34＝K，X35＝L，X36＝V，X37＝V，X38＝Y且X39＝Y。
根据上述结构的经修饰CPG2蛋白是本发明的实施方案。已经产生了经修饰的CPG2蛋白，并且证明其在体外培养的人T-细胞中引发增殖反应的能力降低(详述于实施例6)。这些数据与在体内免疫原性潜能降低的经修饰CPG2蛋白是一致的。
已经认识到，天然CPG2酶会形成同型二聚体并且其活性需要锌离子。本发明的目的是产生这样的经修饰CPG2分子，它含有较少量的T-细胞表位或较少量的能结合MHCII类或与MHCII类分子相关的T-细胞上的序列，并且优选的是它也能够形成同型二聚体并结合锌离子。
同时还认识到，天然CPG2酶会形成同型二聚体并且其活性需要锌离子，因此最期望能提供一种经修饰的CPG2分子，即当其施用于人体时，诱导免疫反应的潜能降低或缺乏，并且所述的这种具有预期特性的经修饰CPG2分子可能会减弱其形成同型二聚体和/或结合锌离子的能力，但却保留了一定程度的酶活性从而仍具有将前体药物转化成活性药物的能力。此种分子包括于本发明领域范围之内。
本发明的经修饰CPG2分子可以不形成同型二聚体；并且那些能够导致形成具有预期酶活性的单体CPG2、并且不含或含有至少数量减少的T-细胞表位或能结合到MHCII类分子或与MHCII类分子相关的T-细胞上的序列的序列修饰同样也是本发明一个预期目的。
已经认识到，自身不能形成二聚体且在溶液中以单体形式存在的经修饰CPG2分子可能没有预期的酶活性，但是若将两个以上经修饰的CPG2分子相互靠近，则仍然可能部分或全部恢复其酶活性。若这种分子也包含较少数量的T-细胞表位或能结合到MHCII类分子或与MHCII类分子相关的T-细胞上的序列，则同样也包括于本发明领域范围之内。
将多个经修饰CPG2分子中的两个相互靠近从而重新产生酶活性的这种情况可以通过基因工程方法来实现，例如通过将CPG2分子融合到第二个蛋白质的结构域上，能够促进或参与形成二聚体及其他程度的结合相互作用。此类结构域的实例包括抗体恒定区，如IgG或其他免疫球蛋白同种型的Fc结构域。其他实例包括抗体V-区结构域或如FOS和JUN蛋白中的b-zip基序。同样也可以考虑其他公认的蛋白结构域。也可以期望使用能将两个CPG2连接成一个重组融合蛋白的蛋白质接头结构域将所述的CPG2分子适当地靠近到一起。
还可以考虑与非蛋白质化合物形成经修饰的CPG2复合体，非蛋白质化合物包括合成的水溶液聚合物，如羟丙基甲基丙烯酰胺或聚苯乙烯-共-马来酸或其他物质。同样，为了使该复合体恢复或提供一定程度的酶活性，也可以考虑用脂质体或碳水化合物制剂与经修饰的CPG2连接，否则，如果所述的CPG2部分不相互靠近或由外力迫使其靠近，复合体就不会恢复或提供一定程度的酶活性。
本发明的一个目的是产生当施用于人体时诱导免疫反应的潜能降低或缺乏的经修饰CPG2分子。本目的还目标能保留分子的功能活性，即催化前体药物向活性药物转化的能力。优选的是活性药物对所目标靶细胞的毒性比前体药物至少高一个数量级，并且最优选的是活性药物的毒性大于一个数量级。适宜的前体药物包括氮芥前体药物和其他描述于专利WO88/07378；WO89/10140；WO90/02729；WO91/03460；EP-A-540263；WO94/02450；WO95/02420；WO95/03830或US，6,004,550中的化合物，它们于此处引用作为参考。其它任何能够用本发明经修饰的CPG2进行转化和能够产生适合毒性特征的化合物均可考虑与本发明经修饰的CPG2组合使用。
就本发明涉及到的经修饰CPG2而言，包含此类经修饰的CPG2蛋白或经修饰CPG2蛋白片段的组合物及相关组合物也将位于本发明领域所考虑的范围之内。另一方面，本发明涉及编码经修饰CPG2实体的核酸。本发明另外一方面涉及用经修饰的CPG2蛋白进行人类治疗的方法。在这个方面，经修饰的CPG2蛋白可与抗体分子或抗体分子片段进行连接。这种连接可以借助于化学交联剂或CPG2-抗体可以作为重组融合蛋白产生。融合分子可包含具有定位于融合分子N-末端的抗体结构域的经修饰CPG2结构域，尽管相反的定位也可能被考虑到。
适于连接到本发明经修饰CPG2分子上的目标抗体包括那些能够导向癌胚抗原的抗体，包括MFE23[Chester，K.A.等(1994)柳叶刀(Lancet)343455]、A5B7[WO92/010159]、T84.66[US，5,081,235]、MN-14[Hansen，H.J.等(1993)癌症(Cancer)713478-3485]、COL-1[US，5,472,693]等。其他目标抗体包括针对非内化抗原的抗体，这些非内化抗原包括被抗体KS1/4[Spearman等(1987)药物实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Therapeutics)241695-703]和其他抗体识别的40kDa糖蛋白抗原。其他抗原如表皮生长因子受体(HER1)或相关受体如HER2是可以选择的，包括抗-GD2抗体，如抗体14.18[US，4,675,287；EP 0 192 657]，或可考虑针对前列腺特异膜抗原[US，6,107,090]、IL-2受体[US，6,013,256]、A33抗原[Heath，J.K.等(1997)美国国家科学院院报Proc.Natl，Acad.Sci U.S.A.]94469-474]、Lewis Y决定簇、粘蛋白糖蛋白等的抗体。
当经修饰的CPG2蛋白与抗体序列融合产生时，最期望使用的抗体序列是那些已经去除了T细胞表位或去除了能够结合MHCII分子或刺激T-细胞或结合与MHCII分子相关的T-细胞的序列的抗体序列。
在本发明的另一个实施例中，经修饰的CPG2蛋白连接到非抗体蛋白质上，而这种蛋白质能够指导对特殊靶细胞的特异性相互结合作用。此类蛋白质分子包括一系列具有特异细胞表面受体的多肽配体，因此它们包括大量细胞因子、肽和多肽激素及其他生物反应调节剂。重要的实例包括以下蛋白质，如血管上皮生长因子、表皮生长因子、heregulin、白介素、干扰素、肿瘤坏死因子及其他蛋白质和糖蛋白分子。这些分子或其他分子与本发明中的CPG2形成的融合蛋白质也可以被考虑，并且这种融合蛋白中可含有相对于蛋白质配基结构域而言定位于其N-末端或C-末端的经修饰CPG2部分。同样的，还可以考虑将纯化的配体化学交联到经修饰的CPG2蛋白上，并且这种方法也包括于本发明领域范围之内。
在另一个实施方案中，本发明的经修饰CPG2蛋白可以以含有如羟丙基甲基丙烯酰胺的水溶聚合物或其他聚合物的复合体的形式使用，其中经修饰的CPG2蛋白是共价连接到聚合物上的或者是以非共价结合与聚合物相互作用。该实施方案此外还包括一个与聚合的CPG2复合体组合的抗原结合结构域如抗体或抗体片段。
在本发明的另一个实施方案中，经修饰CPG2酶基因本身可以用作治疗实体，例如基因靶向酶前体药物策略，并且还可以包括与载体中的组织特异性启动子序列的连接，或者可从载体中病毒来源的启动子开始表达，或者载体自身可是病毒来源的，或者能够被包装于病毒颗粒内且能感染细胞。现在将用以下实施例进行阐述，但不限于这些实施例。实施例提及以下图表图1提供了根据实施例2的方法进行幼稚T-细胞增殖测定所用的合成肽的列表。ID#＝每一受测试肽的标识编号；供体#＝供体体PBMC培养物的标识，其中对特定肽的评分大于1.95的刺激指数；序列＝以单一字母代码表示的肽序列。
图2提供了描述当存在不同浓度野生型或经修饰的CPG2蛋白时，用幼稚人PBMC培养物进行免疫原性测定的结果的点图。该图显示了来自两个反应性供体PBMC样本的结果。A＝供体#1。B＝供体#16。SI＝刺激指数。
实施例1
用计算方法鉴定CPG2蛋白序列中潜在的MHCII类配体具有MHCII类结合配体潜能的肽序列的分析策略在以前已进行了详细叙述[WO 02/069232]。使用该方法的软件工具已被研发出来并用于CPG2蛋白序列的分析。简而言之，软件建立于大量组件，包括模建的MHCII类分子文库，该文库覆盖了人种群中大量的同种异型变体，并包括肽主链结构文库，该文库包含理论上和已知的主链构象。利用这些组件，基于每一模建MHC同种异型结合沟与每一主链构象的对接结果产生一个大的数据集合。该数据集合还包括所有可能的氨基酸在给定位置处最好的侧链构象。肽侧链(最适构象中)和MHC蛋白之间的原子间距离也存储于本数据集合中。通过将来自目的蛋白的受试肽侧链序列加入到所有主链中，然后检索上述数据集合寻找最适侧链构象并计算对于每个主链的“肽分值”，可以分析来自目的蛋白的受试肽。选择分值最高的肽用于显示，并且对于每个可获得的MHC模建结构均重复该过程。
这种算法已经用于全长CPG2蛋白序列的分析。分析鉴定出多条13mer肽序列，鉴于这些肽序列是预测的一种或多种同种异型的MHCII类配体，所以它们是潜在的T-细胞表位。这些肽示于表1，其中肽序列是用单字母代码表示的。
实施例2使用合成肽和幼稚人PBMC体外增殖测定法鉴定T-细胞表位。
MHC、肽和T细胞受体(TCR)的相互作用提供了T细胞识别的抗原特异性的结构基础。T细胞增殖测定检验肽与MHC的结合和TCR对MHC/肽复合体的识别。本实施例的体外T细胞增殖测定包括刺激含有抗原呈递细胞(APC)和T细胞的外周血单核细胞(PBMC)。用合成肽抗原进行体外刺激，在某些实验中使用完整蛋白抗原。用3H-胸苷(3H-Thy)测量刺激的T细胞增殖并对洗涤的固定细胞进行闪烁计数估计掺入的3H-Thy的存在。
从国家血液部门(National Blood Service，Addenbrooks Hospital，Cambridge，UK)得到捐赠的细胞。从Amersham Pharmacia Biotech(Amersham，UK)得到菲可帕克(Ficoll-paque)。含有L-谷氨酰胺、50μg/ml链霉素、10μg/ml庆大霉素和0.1％人血清白蛋白的用于培养原代人淋巴细胞的无血清AIM V培养基得自Gibco-BRL(Paisley，UK)。合成肽得自Eurosequence(格罗宁根，荷兰)和Babraham Technix(Cambridge，UK)。
对血沉棕黄层轻微离心从血浆和血小板中分离出红血球和白血球。除去并扔掉顶层部分(含有血浆和血小板)。在磷酸盐缓冲液(PBS)中1∶1稀释红血球和白血球并铺在15ml菲可帕克(Amersham Pharmacia，AmershamUK)上。根据生产商推荐的条件进行离心并从血清+PBS/菲可帕克界面收获PBMC。用PBS(1∶1)混合PBMC并通过离心收集。除去并扔掉上清液，将PBMC沉淀重新悬浮在50ml PBS中。通过离心再次沉淀细胞并抛弃PBS上清液。用50ml AIM V培养基重新悬浮细胞并在此时计数并用锥虫蓝染料排除估计存活率。再次离心收集细胞并抛弃上清液。细胞重新悬浮以低温保藏，密度为3×107/ml。保藏培养基为90％(v/v)热失活的AB人血清(Sigma，Poole，UK)和10％(v/v)DMSO(Sigma，Poole，UK)。将细胞转移到可调节冰冻容器(Sigma)并且在转移到液氮以长期保存前将其置于-70℃过夜。当需要使用时，在37℃水浴中快速解冻然后转移到10ml预热的AIMV培养基。
利用市售的试剂系统(Dynal，Wirral，英国)测定所有PBMC样本的组织类型。测定依照供应商所推荐步骤、标准辅助试剂和琼脂糖电泳系统进行。选择用于CPG2表位分析的20个供体PBMC样本系列的组织类型鉴定于表6(见下)，并且选择用于提供广谱的同种异型。
表6供体系列的组织类型
在平底96孔平底板(PBMC密度为2×105PBMC每孔)中用蛋白和肽抗原刺激PBMC。在37℃下将PBMC孵育7天后用3H-Thy(Amersham-Pharmacia，Amersham，UK)脉冲。对于本研究，制备了涵盖全部CPG2序列并含有附加的C-末端6-His标签的合成肽(15mer)。每条肽与序列上连续的肽彼此互相重叠12个残基，即每条肽比相邻的肽在序列上延伸3个残基。肽序列和标识编号示于图1。每条肽都分别用从20个天然供体分离的PBMC进行筛选。两条以前已经表明是免疫原性的对照肽C32(PKYVKQNTLKLAT)和C49(KVVDQIKKISKPVQH)，以及一种有效的非记忆抗原KLH被用于每个供体测定。将肽溶解于DMSO中使其终浓度为10mM，然后将这些贮存液在AIM V培养基中稀释到原来的1/500(终浓度20μM)。向平底96孔板中加入肽，使100μl体系中肽的终浓度为2和10μM。通过锥虫蓝染料排除估计解冻的PBMC的存活率。然后将细胞重新悬浮(密度为2×106个细胞/ml)，向每个含有肽的孔中移入100μl(2×105个PBMC/孔)。在每个肽浓度下测定一式三份的孔培养物。在5％CO2、37℃的潮湿空气中孵育平板7天。用1μCi3H-Thy/孔的脉冲细胞18-21小时后收获到过滤垫上。用WaHac微量培养板β顶层平板计数器(Perkin Elmer)测定CPM值。结果表达为刺激指数(SI)，其中SI＝受试肽的CPM/未处理对照的CPM。
使用幼稚T细胞增殖测定法对CPG2序列中T细胞表位进行绘图，鉴定了几个免疫原性区。在个体的供体中具有显著刺激指数的肽列于图1。幼稚T-细胞增殖测定的结果能够用于编辑CPG2蛋白的表位图。一般而言，在此类表位图的编辑中，SI＞1.95被视为阳性反应。
实施例3CPG2基因的产生CPG2原来的序列来自假单胞菌属RS-16菌株的基因(基因库登录号AE002078)。390个氨基酸的蛋白质序列经反向翻译后获得了一条含1170个核苷酸的DNA序列。反向翻译是利用商业化软件(DNAstar，麦迪逊，威斯康辛州，美国)进行的，并且序列编辑基于大肠杆菌(E.coli)最常用的密码子。该序列被用于设计一组24个合成的寡核苷酸。寡核苷酸的长度范围在50-83个核苷酸之间，并且经设计含有长约19-25个核苷酸的重叠末端。所设计的基因在5′末端含有Asc I位点而在3′末端含有Sac I位点，使其能够克隆进质粒载体。这些寡核苷酸列于表7。
表7合成的寡核苷酸序列
基因通过聚合酶链反应(PCR)组装。搜集4种不同的PCR混合物(A、B、C和D)，用于形成下面鉴定的特性不同的系列寡核苷酸。在所有情况下，每个混合物中驱动反应的引物均以高浓度存在(50pmol)，并且在下面用下划线表明混合物A)OL549+OL550+OL551+OL552混合物B)OL553+OL554+OL555+OL556+OL557+OL558混合物C)OL559+OL560+OL561+OL562+OL563+OL564混合物D)OL565+OL566+OL567+OL568+OL569+OL570利用上述反应中纯化的产物，并且通过两侧引物OL571和OL572导入克隆位点，通过连接反应，形成了完整的CPG2基因。使用高保真聚合酶(Promega，南安普敦，英国)和随酶提供的缓冲液进行PCR反应。用热循环仪进行循环反应，运行程序详述于下PCR循环条件阶段 步骤 温度(℃)时间(秒)循环数1 1 94 120 12 1 94 15 102 2 45-60(梯度) 60 102 3 72 45 103 1 94 15 253 2 60 30 253 3 72 45 254 1 72 420 14 2 4 保持在4℃ 1组装后的CPG2基因被亚克隆入pGEM，并通过测序分析确保序列的正确性。为了测试CPG2的活性，将含有CPG2基因的细胞铺到含0.1％叶酸的LB琼脂平板上(叶酸溶于1M NaOH并配成10％贮存液)。然后将其在37℃孵育，通过黄色晕环鉴定含有CPG2活性的菌落。晕环是当叶酸被水解时，所形成的蝶酸被沉淀。
实施例4
CPG2基因的定点诱变所克隆的活性CPG2基因可用作研发基因突变体的模板，研发基因突变体使用QuickChangeTM定点突变试剂盒(Stratagene，LaJolla，加利福尼亚)。使用高保真耐热聚合酶延伸成对的寡核苷酸引物，引物序列与载体的反链互补并含有预期的突变。引物的掺入导致形成含有交错切口的突变载体。用核酸内切酶DpnI消化亲本DNA，其中DpnI对甲基化的和半甲基化的DNA具有特异性，然后将含有预期突变的切口载体DNA转化入感受态大肠杆菌细胞。使用了十六对设计后的寡核苷酸引物以达到在每条模板中导入点突变。寡核苷酸序列示于表8。
表8用于将突变导入CPG2模板基因的寡核苷酸引物。列出了序列、长度和导入的突变。
实施例5重组CPG2的表达与纯化利用编码区外侧的限制性位点AscI/SacI，将CPG2基因突变体克隆进表达载体。用连接混合物转化大肠杆菌细胞。在含有50-100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，选择几个氨苄青霉素抗性克隆。分析这几个克隆中是否存在重组的插入片段及其插入方向，并且确保其与His-标签在同一读码框内。证明了正确的方向之后，将细胞培养于37℃，诱导表达并通过离心收获细胞。用SDS-PAGE凝胶电泳分析裂解后的细胞样本并用考马斯亮蓝染色以证实表达情况。为了后续的重组蛋白质的纯化，表达被扩大至50ml细胞培养物。
使用ProBondTM纯化系统(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚)，按照供应商推荐的步骤纯化具6×His标签的CPG2蛋白。简而言之，通过离心从50ml培养物中收获细胞，重悬于结合缓冲液并裂解细胞。轻轻振荡60分钟，使裂解液与纯化柱树脂结合。洗涤树脂并用洗脱缓冲液洗脱重组蛋白。用如前所述SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析样本。用分光光度测定法检测纯化的蛋白质浓度。
实施例6使用人PBMC体外增殖测定法证明经修饰的CPG2蛋白免疫原性潜能降低根据实施例3-5中的方法制备经修饰的蛋白质。所述经修饰的蛋白质包含来自野生型的多处替代。阳性对照蛋白质是野生型CPG2。对于T细胞增殖测定法，在2ml培养物(24孔板)中，用未修饰的和经修饰的抗体孵育取自健康供体的4×106PBMC(每孔)。用5和50μg/ml经修饰的和未修饰的CPG2处理每份供体培养物。此外，设置未处理的对照培养物，使刺激指数能够被检测。在第5、6、7和8天时，轻轻振荡每份培养物，并且取出50μl样本，平行取3份，用于增殖指数的测定。50μl样本等份分别被转移到U-形底96孔板的3个孔中。在96孔板的每个孔中加入新鲜的AIM V培养基(130μl)。用稀释于总体积20μl AIM V培养基中的lμCi[3H]胸苷脉冲(处理18-21小时)细胞。每份培养物总体积200μl。使用β-板读数仪收集CPM值并且按照实施例2的方法测定每个时间点的刺激指数。
每个时间点和处理的SI被制成曲线。在反应性供体中，用野生型CPG2处理引起了显著的增殖反应，并在7天时达到峰值。在同一供体中，用本发明的经修饰CPG2组合物处理没有产生显著的增殖反应。这些结果表明经修饰的CPG2蛋白免疫原性潜能降低。来自于反应性供体#1和#16的曲线提供于图2。
权利要求
1.经修饰的细菌羧肽酶G2(CPG2)，当其在体内应用时基本上无免疫原性或免疫原性低于任何具有基本相同的生物学特异性但未经修饰的CPG2，并且其含有与未经修饰的亲本酶相比有所改变的特定氨基酸残基，其中所述改变引起一个或多个T-细胞表位序列的减少或去除，其中所述T-细胞表位序列在亲本酶中为MHC II类结合配体并刺激T-细胞。
2.根据权利要求1所述的经修饰CPG2分子，其中所述改变在以下各串来自CPG2野生型序列的连续氨基酸残基中的一个或多个位点处进行A.＝VGKIKGRGGKNLLLMSHMDTVYLKGILAK；B.＝KAYGPGIADDKGGNAVILHTLKLLKEYG；C.＝LFNTDEEKGSFGSRDLIQEEA；D.＝KLADYVLSFEPTSAGDEKLSLGTSG；E.＝VNITGKASHAGAAPELGVNALVEASDL；F.＝KAKNLRFNWTIAKAGNVSNIIPASATLNAD；G.＝ADVKVIVTRGRPAFNAGEGGKKLVDKA；H.＝KKLVDKAVAYYKEAGG；I.＝YKEAGGTLGVEERTGGG；J.＝TDAAYAALSGKPVIESLGLPGFGYK.＝LEKLVNIETGTGDAE。
3.根据权利要求1所述的经修饰CPG2分子，其中所述T-细胞表位序列是13mer或15mer肽，并且是选自表1或表2中的任一序列。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的经修饰CPG2分子，其中所述改变是1-9个氨基酸残基的替代。
5.权利要求3的经修饰CPG2分子，其中所述替代选自表4或表5中的任意一种替代。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的经修饰CPG2分子，其还包含一个或多个氨基酸残基的改变，其中所述改变用于恢复该分子的生物学活性。
7.具有细菌羧肽酶G2(CPG2)生物学活性和以下氨基酸序列的分子X0QKRDNVLFQAATDEQPAVIKTLEKLVNIETGTGDAEGIAAAGNFLEAELKNLGFTVTRSKSAGLVVGDNIVGKX1KGRGGKNLX2LX3SHMDTVYX4KGILAKAPFRVEGDKAX5GPGX6ADDKGGNAX7IX8HTX9X10X11X12KEYGVRDYGTITVX13FNTDEEKGSFGSRDLX14QEEAKLADYX15X16SX17EPTSAGDEKX18SLGTSGIAYVQVNITGKASHAGAAPEX19GX20NAX21X22EASDLVLRTMNIDDKAKNX23RFNX24TX25AKAGX26X27SX28X29X30PASATX31NADVRYARNEDFDAAMKTLEERAQQKKLPEADX32KX33IVTRGRPAFNAGEGGKX34X35X36DKAX37AX38X39KEAGGTLGVEERTGGGTDAAYAALSGKPVIESLGLPGFGYHSDKAEYVDISAIPRRLYMAARLIMDLGAGK，其中X0任选地为靶向部分，如抗体结构域；且X1为I，T；X2为L，A；X3为M，K；X4为L，I；X5为Y，T；X6为I，A；X7为V，A；X8为L，A；X9为L，T，A；X10为K，T；X11为L，M，A；X12为L，T，A；X13为L，G，T；X14为I，T，A；X15为V，A；X16为L，T，G；X17为F，A；X18为L，A；X19为L，A；X20为V，A；X21为L，A；X22为V，T，A；X23为L，A；X24为W，A；H；X25为I，A；X26为N，T，A；X27为V，T；X28为N，T，A；X29为I，T，A；X30为I，T，A；X31为L，T，A，I；X32为V，A；X33为V，A；X34为K，T；X35为L，A；X36为V，A；X37为V，S，T，A；X38为Y，T，A；X39为Y，S，T，A；且不包括同时为以下氨基酸残基的情况X1＝I，X2＝L，X3＝M，X4＝L，X5＝Y，X6＝I，X7＝V，X8＝L，X9＝L，X10＝K，X11＝L，X12＝L，X13＝L，X14＝I，X15＝V，X16＝L，X17＝F，X18＝L，X19＝L，X20＝V，X21＝L，X22＝V，X23＝L，X24＝W，X25＝L，X26＝N，X27＝V，X28＝N，X29＝I，X30＝I，X31＝L，X32＝V，X33＝V，X34＝K，X35＝L，X36＝V，X37＝V，X38＝Y且X39＝Y。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的经修饰CPG2酶，其中当作为完整蛋白质测试时，在诱导人T-细胞细胞增殖的生物学测定中呈现的刺激指数小于利用来自同一供体的细胞进行平行测试时的亲本酶，其中所述指数表示为用蛋白质刺激后细胞增殖的分值并除以与不用蛋白质刺激的对照细胞的细胞增殖分值，并且其中细胞增殖是用任何适宜的方法测定的。
9.编码如权利要求1-8中任意一项所定义的CPG2分子的DNA序列。
10.药物组合物，其包含上述权利要求中任意一项所述的经修饰CPG2分子，并任选地还包含可药用载体、稀释剂或赋形剂。
11.肽分子，其由9-15个连续的氨基酸残基组成，具有潜在的MHCII类结合活性并且由未经修饰的CPG2酶的一级序列产生，此处所述肽分子在细胞增殖的生物学测定中刺激指数至少为1.8至2，其中所述指数表示为用肽刺激后细胞增殖的分值并除以不用肽刺激的对照细胞的细胞增殖分值，并且其中细胞增殖是用任何适宜的方法测定的。
12.根据权利要求11所述的肽分子，其中所述刺激指数大于2。
13.权利要求11或12的肽分子，其选自表1或表2中所描述的连续T-细胞表位序列。
14.对衍生自权利要求11-13中任意一项所述的肽分子通过氨基酸替代而得到的经修饰肽分子，其潜在的MHC II类结合活性降低或丧失，这通过刺激指数小于2表示，其中所述指数表示为用肽刺激后细胞增殖的分值并除以不用肽刺激的对照细胞的细胞增殖分值，并且其中细胞增殖是用任何适宜的方法测定的。
15.权利要求14的经修饰肽分子，其中所述刺激指数小于2。
16.根据权利要求11-15中任意一项所述肽的用途，用于制备体内使用时基本上无免疫原性或比任一未经修饰的亲本酶的免疫原性要低的经修饰CPG2酶。
17.根据权利要求11-13中任意一项所述肽的用途，用于接种患者以降低体内对CPG2的免疫原性。
18.编码权利要求11-15中任意一项所述肽的DNA序列。
19.药物组合物，其包含权利要求11-15中任意一项所述的肽，任选地还包含可药用载体、稀释剂或赋形剂。
全文摘要
本发明尤其涉及对细菌羧肽酶G2(CPG2)的修饰，该修饰使得体内使用时这些CPG2蛋白基本上无免疫原性，或比任一未经修饰的相应蛋白的免疫原性低。本发明也涉及来源于所述的非修饰蛋白质的T细胞表位肽，通过它们使产生免疫原性降低的经修饰CPG2变体成为可能。这些多肽特别适用于人类的治疗用途。
文档编号C07K7/00GK1592633SQ02823301
公开日2005年3月9日 申请日期2002年11月27日 优先权日2001年11月29日
发明者K·海伦多恩, M·贝克, S·威廉斯, F·J·卡尔 申请人:默克专利有限公司