专利名称：一种简单快速检测产紫杉醇真菌的方法
一种简单快速检测产紫杉醇真菌的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种简单快速检测产紫杉醇真菌 的方法。
背景技术：
紫杉醇(paclitaxel,商品名Taxol)是一种复杂的天然的抗癌药物，属于二萜 生物碱，其基本结构由浆果赤霉素III (baccatinIII)和连接其13位碳上一苯丙氨酸衍生物构 成。
工业生产紫杉醇的早期策略，是采用从红豆杉树木原料中直接提取的方法，由于紫杉醇 含量极低，水溶解性差，生产l公斤紫杉醇， 一般需要7000公斤、相当于2000-2500棵红豆 杉树木的原料，这给红豆杉资源带来严重威胁，造成生态环境的严重破坏。
化学法全合成紫杉醇，已于1994年在实验室里取得了成功。伹是，紫杉醇手性基团较多， 合成路线复杂，成本高、产率低，至今无法应用于工业生产。
Christen首次利用植物细胞悬浮培养技术生产紫杉醇后，研究吸引了众多的实验室跟进， 这方面的研究也取得了一定的进展。但是这项技术同样存在一些问题，如培养细胞的褐化问 题，虽有该技术进入生物反应器放大阶段的试验，但未见实际应用的报道，短期内成功应用 的可能性较小。
国际制药公司当前较普遍采用的生产技术则是生化半合成法。半合成法虽然提高了紫杉 醇产量，但与直接提取紫杉醇的办法并无本质上区别，仍然需要消耗大量红豆杉树木。
由于紫杉醇的市场供应受制于原料来源和制备技术两方面的制约，使得药价昂贵。为此，
制药界和学术界一直在寻找新的更好的原料及方法，来代替现有的生产技术，以提高紫杉醇 的产量、满足临床需求。过去十余年中取得的最有意义的进展，是发现了与红豆杉等裸子木 本植物共生的一些真菌产生紫杉醇，并且其化学结构和生物活性与红豆杉所产紫杉醇完全相 同。
1993年，Stierle等从太平洋红豆杉的韧皮部分离到l株内共生真菌-安德烈紫杉菌 (roxomyce so"^ea"fle)，经培养，采用质谱、色谱(TLC/HPLC)和放射性化学标记等方法，发 现该菌的发酵液中存在紫杉醇，尽管产量较低，每升发酵液仅含紫杉醇24-50ng。同时还证实， 这些真菌产生的紫杉醇与红豆杉中紫杉醇结构和性质完全一样。随后，许多人分离到不同的 产紫杉醇的内共生真菌。据统计，国内外己报道的产生紫杉醇真菌种类已超过三十种，这些
真菌绝大多数是子囊菌或半知菌，而且都是内共生真菌。但目前这些真菌发酵产物中紫杉醇 的含量很低，不能达到工业发酵生产的水平，因此远远地不能满足市场的需求。解决这一问题的关键方法就是筛选得到紫杉醇的高产菌株。但目前常用的筛选方法是使 用有机溶剂如甲醇等抽提微生物的发酵样品，再利用TLC和HPLC等进行检测，不仅费时、费 力，而且需要大量有机溶剂和HPLC等设备。
Mu等人(1999)报道终端腐霉(/ yA&m M加mwm)对紫杉醇非常敏感，低浓度(ICs。0.1 pM) 紫杉醇处理，其生长被抑制，相比Hela细胞(IC5Q0.25 ^M)更敏感。分析终端腐霉的|3-微管 蛋白氨基酸序列表明终端腐霉的p-微管蛋白与动物细胞的同源性非常高，终端腐霉也以同 样的方式受到紫杉醇的抑制。因此利用终端腐霉作为测试菌是可行的，可以替代培养动物细 胞来检测紫杉醇的生物活性。
发明内容为了克服现有技术的不足，本发明目的在于提供一种简单快速检测产紫杉 醇真菌的方法。
本发明提供的一种对紫杉醇敏感的微生物，终端腐霉(i^^u'www/"m,)。 本发明所述微生物终端腐霉的P-微管蛋白(p-tubulin)基因编码区序列长657bp,其核苷 酸序列如序列表所示。
本发明提供的一种简单快速检测产紫杉醇真菌的方法，其包括在培养基中培养终端腐 霉，利用终端腐霉对紫杉醇的敏感，在平板上能形成抑菌圈的方法，检测真菌的发酵产物中 是否含有紫杉醇。其包括产紫杉醇真菌发酵粗提物的制备、紫杉醇粗提物溶剂的选择，终端 腐霉的接种方式和抑菌圈形成的培养条件等。
所述培养基为PDA培养基(g/L):马铃薯200 g，蔗糖20 g，自然pH，固体补加20g 琼脂粉。
所述终端腐霉的接种方式采用块状菌丝体(约O.lmmxO.lmm)的直接接种方式。 所述的培养可以在本领域的常规或已知的条件下进行。所述的培养可以在需氧条件下，
其特征在于所述的培养温度为25°C，培养PH值为PDA培养基自然PH，培养时间为2—3天。
所述产紫杉醇真菌发酵粗提物的制备包括以下步骤(1)从所得培养液分离出发酵菌体 和发酵上清液；(2)用有机溶剂提取所得发酵菌体，与发酵上清液一起进行浓縮。
为了从培养基分离出紫杉醇，可以使用本领域常规或已知的用于从微生物的培养基中分 离代谢物的任何分离方法。所述第(1)步中，菌丝体可以通过离心或过滤从发酵液中分离出 来。
所述第(2)步中可将所得发酵菌体干燥粉碎后，再用有机溶剂提取，所述干燥可按照本 领域常规或已知的方法进行，例如真空冷冻干燥法。所述从发酵菌体中提取紫杉醇用的第一有机溶剂可以是本领域常规或已知的溶剂，例如甲醇。所述浓縮方法可按照本领域常规 或己知的方法进行，例如减压浓縮。 所述紫杉醇粗提物溶剂为甲醇。
所述抑菌圈形成的培养条件包括将终端腐霉接种到PDA平板的中心位置上，在其周边 均匀摆放适当数目的牛津杯，培养过夜；分三次将真菌发酵粗体物加到牛津杯中，每16小時 加样一次，每次加样量是50pL; 25。C恒温培养2-4天；观察抑菌圈形成。
本发明提供一株能产紫杉醇的腐生真菌拟盘多毛孢户esto/orio戸"/m'cro^ora NK-17(菌种 保藏号CGMCCNo.2694)作为测试菌。
采用本发明的检测产紫杉醇真菌的方法，可以快速筛选出高产紫杉醇真菌。
本发明的优点和积极效果
采用本发明提供的检测产紫杉醇真菌的方法，简单、灵敏、快速，能高效地筛选得到紫 杉醇的高产菌株
图1是产紫杉醇真菌NK-17发酵粗提物与紫杉醇标准样品的生物活性的检测。 A.为产紫杉醇真菌NK-17发酵粗提物;B.紫杉醇标准品；C.甲醇空白对照.。 本发明提供的能产紫杉醇的菌株是一株腐生真菌拟盘多毛孢，已于2008年10月8曰保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区大屯路，中 国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC No. 2694，分类命名尸esto/orio戸^ m&roipora 。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的 限定。本领域的技术人员应理解，对发明技术特征所作的等同替换、或相应的改进，仍属于 本发明的保护范围之内。
实施例l、产紫杉醇真菌的发酵培养
在固体PDA培养基上培养产紫杉醇真菌，在28'C培养15-30天之后，菌株产生丰富的 孢子。以块状菌丝体的接种方式将菌株的菌丝和孢子接种于装有200ml液体PDA培养基的 500mL三角瓶中发酵培养，培养温度为28。C，转速180rpm，培养时间一般为7—15天左右。 在液体培养过程中，由于产物紫杉醇在pH 4-8之间是稳定的，因此需要在发酵过程中监测pH，使其处于该范围之内。
实施例2、产紫杉醇真菌发酵产物前处理过程
将发酵产物进行抽滤，使得菌丝同发酵液分离开来；将抽滤后所得菌丝冷冻干燥，液氮 研磨破碎细胞之后使用甲醇浸提l-2天；将浸出液与之前的发酵液混合后再次进行抽滤，除去 沉淀物，并调节pH至7.0;使用旋转蒸发器对上步所得滤液浓縮后得到粗提产物。
实施例3、终端腐霉的接种、培养及抑菌圈的形成
将终端腐霉采用块状菌丝体(约0.1 mmxo.l mm)的接种方式接种到PDA平板的中心位 置上，在其周边均匀摆放适当数目的牛津杯，培养过夜；分三次将真菌发酵粗体物加到牛津杯 中，每16小時加样一次，每次加样量是50^L; 25。C恒温培养2-4天，观察抑菌圈形成。
将紫杉醇标准品和紫杉醇粗提物的溶剂一甲醇作为对照，操作完全一致，观察抑菌圈的 形成。(结果见图1) A为产紫杉醇真菌发酵粗提物;B为紫杉醇标准品(1.5mg/mL) ;C为甲 醇空白对照。由图1可见，甲醇作为紫杉醇粗提物的溶剂不影响终端腐霉的生长。产紫杉醇 真菌的发酵粗提物和紫杉醇标准品都能抑制终端腐霉的生长，形成抑菌圈。序列表
<110>南开大学
〈120〉一顺单鹏检测产膨鶴菌的方法 <160〉 1
<210> 1
<211〉 657
<212> DNA
<213〉终端腐霉(，/鹏utowwm)
<220>
<221〉 gene
<222〉 (1)…(657)
<400〉 1
tgcccatcgccaaaggtgtcggataccgtcgtcgasccatacaatgccacgctttcggtc60
caccagttggtcgaaaacgccgatgaagtcatgtgtttggataacgaggctctctacgat120
atctgcttccgtaccctgaagttgacgaccccaacgtacggtgacttgaaccacttggtg180
tgtgctgccatgtccggtatcacgacgtgcctgcgattcccaggtcaattgaattcggac240
ttgcgtaagctcgcggtgaacttgatcccgttcccacgtctccacttcttcatgattggt300
ttcgcgccattgacctcccgcagtaccgtgctttgaccgtcccagaattg360
acccagcaacaattcgacgcg站gaacatgstgtgcgccgccgatcctcgccacggtcgt420
tatttaactgctgcctgtatgttccgtggccgcatgagcacc33gg33gtcgatgaacaa480
stgctcaacgtgcagaacaagaaictcgtcgtactttgtggagtggattcc540
aaggccagcgtgtgtgatatccc3cc站agggtctgaagatgagtaccaccttcgttggt600
站ctcgactgcgatccaiggsgatgttcaagcgtgtgtcggagcagttcacggccatg657
权利要求
1、一株对紫杉醇敏感的微生物，终端腐霉(Pythium ultimum)。
2、 根据权利要求1所述的微生物菌株，其特征是该菌株的卩-微管蛋白(P-tubulin) 基因编码区序列长657bp，其核苷酸序列如序列表所示。
3、 一种简单快速检测产紫杉醇真菌的方法，其特征在于在培养基中培养权利要求 1所述微生物，利用权利要求1所述的微生物对紫杉醇的敏感性，在平板上能形成抑菌圈的 方法，检测真菌的发酵产物中是否含有紫杉醇。其包括产紫杉醇真菌发酵粗提物的制备、紫 杉醇粗提物溶剂的选择，终端腐霉的接种方式和抑菌圈形成的培养条件等。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述培养基为PDA培养基(g/L):马铃 薯180-220g，蔗糖20g，自然pH，固体补加20g琼脂粉。
5、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于权利要求1所述微生物的接种方式采用 块状菌丝体(约0.1mmx0.1mm)的直接接种方式。
6、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的培养温度为25-30°C，培养PH值 为PDA培养基自然PH，培养时间为2 — 3天。
7、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述产紫杉醇真菌发酵粗提物的制备包 括以下步骤(1)从所得培养液分离出发酵菌体和发酵上清液；(2)用有机溶剂提取所得发 酵菌体，与发酵上清液一起进行浓縮。
8、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于紫杉醇粗提物溶剂为甲醇。
9、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于在抑菌圈形成的培养条件包括将权利 要求1所述的微生物接种到PDA平板的中心位置上，在其周边均匀摆放适当数目的牛津杯， 培养过夜；分三次将真菌发酵粗体物加到牛津杯中，每16小時加样一次，每次加样量是50 叱；25°C恒温培养2-4天；观察抑菌圈形成。
全文摘要
本发明涉及一种简单快速检测产紫杉醇真菌的方法，即利用终端腐霉(Pythium ultimum)对紫杉醇的敏感性，在平板上能形成抑菌圈的方法。其包括产紫杉醇真菌发酵粗提物的制备、终端腐霉的接种方式、紫杉醇粗提物溶剂的选择和抑菌圈形成培养条件等。本发明可以替代培养动物细胞来检测紫杉醇的生物活性，可以快速筛选出高产紫杉醇真菌。该方法直观快速，简单经济。
文档编号C12N1/14GK101475911SQ20081015365
公开日2009年7月8日 申请日期2008年12月1日 优先权日2008年12月1日 公开号200810153656.发明者冰 严, 媛 徐, 朱旭东, 毕建男, 皎 潘, 元 纪 申请人:南开大学