耐高温木聚糖酶XynA2和编码该酶的基因与应用的制作方法

专利名称：：耐高温木聚糖酶XynA2和编码该酶的基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种木聚糖酶，特别涉及在嗜热脱氮芽孢杆菌(Ceo6acW7"st力e^K^e"^ri/Yca/^)NG80-2中对木聚糖酶XynA2基因进行克隆表达、功能鉴定以及构建大肠杆菌高效表达的耐高温木聚糖酶和编码该酶的基因与应用。
背景技术：
：随着当今社会的飞速发展，人口增长和资源消耗使得可再生资源的开发与利用成为国际社会和学术界共同关注的问题。木聚糖是半纤维素的主要组成成份，广泛分布于高等植物的细胞壁中，是自然界中一种巨大的可再生生物资源，也是最容易提取、降解和利用的一类半纤维素。木聚糖酶和0-木糖苷酶是降解木聚糖最主要的酶。在能源工业中，工农业废弃物中的木聚糖可被木聚糖酶和木糖苷酶转化为木糖，而木糖又可被细菌及真菌转化成酒精等有价值的燃料；在造纸工业的纸浆漂白中，e-木糖苷酶与木聚糖酶协同作用可以有效提高漂白性能；在医药行业中，木聚糖酶和木糖苷酶水解特定底物可产生在医药行业具有重要应用价值的中间转化产物。因此对于木聚糖酶和木糖苷酶的研究具有广泛而重要的用途。半纤维素是仅次于纤维素含量第二丰富的可利用自然资源，半纤维素中的木聚糖(xylan)根据来源不同，分枝程度不同，其主链和支链带有多种不同的取代基团。由于木聚糖结构的复杂性，它的完全降解需要多种水解酶的参与共同作用完成。其中的4-内切木聚糖酶(EC.3.2.1.8)是木聚糖降解酶中最关键的酶。该酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的e-1,4-木糖苷键，使木聚糖降解为短链的寡聚木聚糖，并有少量木糖生成；而e-D-木糖苷酶(e-xylosidase，EC.3.2.1.37.)则作用于短链的寡聚木聚糖，通过催化寡聚木聚糖的末端来释放木糖残基。木聚糖酶在生物转化、制浆造纸工业、食品工业、饲料工业上等都具有很大的应用潜力和价值。它在自然界广泛分布，海洋及陆地细菌、海洋藻类、真菌(包括酵母)、瘤胃和反刍动物细菌、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中都存在。由于微生物来源的木聚糖降解酶普遍存在于自然界且种类繁多应用领域广泛，因此对于微生物木聚糖酶研究报道很多。目前，人们研究和应用得最多的是细菌和霉菌来源的木聚糖酶。木聚糖酶来源不同，结构和性质不尽相同，且其pH适用范围和最适范围也各异。一般来说，真菌来源的木聚糖酶多在酸性条件下具有最大活力，pH最适范围为4.(f6.0，属于酸性木聚糖酶；细菌和放线菌木聚糖酶属中性或碱性木聚糖酶，其最适pH在6.08.0之间。同时，木聚糖酶的耐热性和最适作用温度也随其来源不同而不同。一般而言，真菌来源的木聚糖酶最适作用温度在50'C左右，而多数细菌和放线菌所产木聚糖酶的最适反应温度在5(T6(TC之间，耐热性比真菌木聚糖酶稍好一些。在木聚糖酶研究方面，涉及的嗜热菌种有白腐菌(Ceri/^ri叩w^5T/力mr历i5^ora)、(5a"'77wst力enz/a/7tarc"cus)、嗜热侦!j孢霉(S/arotrz'c/7"历t力er/nop力"e)、短梗霉(」"reo/7aw'di咖/"W〃Ja/AsATCC20524)、蓝色链霉菌(5Yr印t(9历ycescja/e〃5"SN32)、疏棉状嗜热丝孢菌(7力er历o历yce517a"〃^7770SfACAU44)、小单胞菌(CW7w7ow.肌'，Zj'咖sp.HY-12)、纤维单胞菌属(6W7i/7o历麵s、嗜热毛壳菌(C力aeto油"力er卿力ii咖)、肠杆菌(￡>tero6actarsp.MTCC5112)、丙酮丁醇梭菌(C7ostrW咖acetoZ"W，ATCC824)、高温单孢菌(T7e扁yz歸，rasp.)、(CaWAacj77i/sce/7w7oKor朋51)、热纤梭菌(c7osm't/f脂z^/er历。ce77咖)、芽孢杆菌(Saw'—7-7jassp.NG-27)、枯草芽孢杆菌(5aci'i7"s6'"力"7isC-01)、嗜热溶胞芽孢杆菌(feo6a"'77ussp.MT-1)、坚强芽孢杆菌(feci〃"s/Y」rMis)、耐热芽孢杆菌(7y/ermoac^z'"o/z7ycest/zaJ;o;力j'JiAs)。关于木聚糖酶基因最新的专利报道。国内专利有詹志春报道了一种木聚糖酶及其基因(第200510018452.3号，申请日期2005.03.25);袁建国等人报道了短小芽孢杆菌(fe^77"wmw'7m)木聚糖酶及其基因(第200510042557.2号，申请日期2005.03.10);董志扬等人分别报道了短小芽孢杆菌BP19的木聚糖酶及其基因(第02131439.X号，申请日期2002.10.14)和巴氏毕赤酵母(尸J'c力yaPGX722木聚糖酶及其基因(第200310103246.3号，申请日期2003.11.03);江正强等人报道了海栖热袍菌(7力e/7Ho^卵/Hari"鹏)MSB8木聚糖酶及其基因(第02156022.6号，申请日期2002.12.11);李颖等人报道了一种木聚糖酶及其基因(第200310113562.9号，申请日期2003.11.17);屠俊等人报道了酵母基因工程菌GS115/HB705木聚糖酶及其基因(第200510018574.2号，申请日期2005.04.19);宋永霖报道了里氏木霉(Trichodermareesei)木聚糖酶及其基因(第02823195.3号，申请日期2002.11.20);张桂敏等人报道了一种木聚糖酶及其基因(第200610020049.9号，申请日期2006.08.29);V格罗比尔等人报道了一种从厌氧嗜热细菌获得热稳定性木聚糖酶及其基因(第95190553.8号，申请日期1995.06.14)。国际专利有DeBuyl等人报道了一种从芽孢杆菌(5acy""ssp.)720/1获得的木聚糖酶及其基因(第09/909，207号，申请日期2001.7.19);Sung等人报道了一种热稳定性木聚糖酶及其基因(第09/856，025号，申请日期1999.11.16);Bhosle等人报道了一种从施氏假单胞菌(/^e^yo/Z7o/7asst""eri)获得的嗜热耐碱木聚糖酶及其基因(第10/223，852号，申请日期2002.8.20);Bentzien等人报道了一种嗜热耐碱木聚糖酶及其基因(第09/570，856号，申请日期2000.5.12);Dunlop等人报道了一种从枯草芽孢杆菌(^3w77mm力"7&)获得的嗜热耐碱木聚糖酶及其基因(第09/639，354号，申请日期2000.4.16);DeBuyl等人报道了一种从芽孢杆菌(5aw77"ssp.)720/1获得的宽pH范围的木聚糖酶及其基因(第08/470,953号，申请日期1995,6.6);Williams等人报道了一种从嗜碱性细菌中获得的嗜热耐碱木聚糖酶及其基因(第08/501，126号，申请日期1995.12.29);Morgan等人报道了一种从柔曲小四孢菌(Wor"etrs邵ora/7e;nyosa)获得的嗜热耐碱木聚糖酶及其基因(第08/732，242号，申请日期1997.4.7);Gronberg等人报道了一种嗜热木聚糖酶及其基因(第08/591,685号，申请日期1997.2.5);0uttrup等人报道了一种从嗜碱性芽孢杆菌(5a"77iASsp.)AC13获得的耐碱木聚糖酶及其基因(第08/470,398号，申请日期1995.6.6);Vehmaa叩era等人报道了一种从放线菌(v4cW/7o鹏^/raspp.)获得的热稳定性木聚糖酶及其基因(第08/468，812号，申请日期1995.6.6);Rele等人报道了一种从头胞菌(Ccp力Wo印oW咖)中获得的碱性木聚糖酶及其基因(第08/294,068号，申请日期1994.8.22);Casimir-Schenkel等人报道了一种从褐色高温单胞菌(r力e777o历oyKW/7ara/ksca)中获得的热稳定性木聚糖酶及其基因(第08/292，147号，申请日期1994.4.17);Rosenberg等人报道了一种从嗜热脂肪芽孢杆菌(泡"〃m"earot力er历叩/l7"s)NCIMB40221中获得的嗜热耐碱木聚糖酶及其基因(第08/063，551号，申请日期1993.5.18);Campbell等人报道了一种从环状芽孢杆菌(feci7^ascirc"7朋s)中获得的热稳定性木聚糖酶及其基因(第08/044,621号，申请日期1993.4.8);Yu等人报道了一种热稳定性木聚糖酶及其基因(第07/340，307号，申请日期1989.4.19)等等。尽管关于木聚糖酶基因的专利报道有多篇，但从嗜热脱氮芽孢杆菌中获得热稳定性木聚糖酶及其编码的基因尚未见文献报道。本发明人首次公开了在嗜热石油降解细菌中，采用嗜热脱氮芽孢杆菌(6^^aw7^^^e77zo(/e/7^ri/yca/7s)NG80-2对木聚糖酶基因进行克隆表达、功能鉴定以及构建大肠杆菌高效表达工程菌株。通过氨基酸序列比对和分析，证明本发明的木聚酶XynA2基因编码的蛋白与已知的嗜热脂肪芽孢杆菌(feo力a"77iAsWear"力e/m^/l7"WT6中的编码木聚糖酶XynA2的基因(GenBankaccessionno.ABI49937)相似性最高(氨基酸序列一致性为87%),但feoZa"77us"earot力erffl叩h7usT6中的木聚糖酶XynA2未进行酶活力测定。与其他已知的木聚糖酶最相似的为土壤芽孢杆菌(6^^a"77"ssp.)MT-1中的木聚糖酶，相似性为86%(GenBankaccessionno.AAZ74783)。该酶属于GH10族。本发明木聚糖酶XynA2的氨基酸序列第3位、128位、134位、330位是缬氨酸，第4位、31位、38位、115位、143位、148位、325位是丝氨酸，第5位、308位是谷氨酰胺，第12位、274位、288位、32位2是谷氨酸，第43位是亮氨酸，第60位、74位是精氨酸，第64位、236位是天冬氨酸，第65位、104位、160位、333位是异亮氨酸，第77位、168位、254位、304位是组氨酸，第119位、331位是丙氨酸，第145位是色氨酸，第166位是半胱氨酸，第187位、256位是赖氨酸，第263位是天冬酰胺，第193位、299位是酪氨酸，第194位、218位、278位是苏氨酸，第295位是甲硫氨酸，第315位是苯丙氨酸。这与6"eo力aw77^ssp.MT-1的木聚糖酶的氨基酸序列不同(见图12)，因此表现出更好的热稳定性。对这个XynA2基因进行了进一步功能鉴定，并与"eo力aw77"ssp.MT-1中的木聚糖酶活性进行了比较，实验结果表明本发明的木聚糖酶XynA2是一种新型的酶，这种酶不但耐高温，而且热稳定性优良，从而完成了本发明的工作。
发明内容本发明一个目的是公开了一种耐高温重组木聚糖酶XynA2。本发明另一目的是公开了编码本发明的木聚糖酶XynA2基因。本发明再一目的是公开了一种表达木聚糖酶的重组质粒，其中至少包括上述的木聚糖酶XynA2的编码基因。本发明还一目的是公开了一种导入了上述的木聚糖酶XynA2编码基因，产生木聚糖酶的重组菌，例如含有重组质粒的重组菌株H1398。本发明的技术方案如下一种编码木聚糖酶XynA2的基因，该基因具有选自下组的核苷酸序列-a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或b)不同于SEQIDNO:1但编码的氨基酸序列与SEQIDNO:1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或c)在严格杂交条件下与所述的a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的木聚糖酶核苷酸序列。应当指出的是，上述提到的术语"严格条件"在本说明书中的含义是指在该条件下形成了所谓特异杂交而没有形成非特异的杂交。例如，该严格条件可以是，相互之间的同源性不小于70%的DNA之间可以杂交而低于上述数值的DNA之间不能杂交，优选的是同源性不少于90%的DNA之间可以杂交。相对于Southern杂交中普通洗涤条件而言，可以例如为如下的杂交条件将杂交膜置于预杂交液(O.25mol/L磷酸钠缓冲液，PH7.0，7%SDS)中，50'C预杂交30min;弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，7%SDS，同位素标记的核苷酸片段)，5(TC杂交12hr;弃杂交液，加入洗膜液I(2XSSC和0.1%SDS)，50。C洗膜2次，每次30min;加入洗膜液II(0.5XSSC和0.1%SDS)，50。C洗膜30min。本发明进一步公开了一种木聚糖酶XynA2，该酶具有核苷酸序列编码的氨基酸序列。或者最好具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或上述中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后、并且具有所述木聚糖酶活性的氨基酸序列。本发明再进一步公开了重组表达质粒及重组菌，它含有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的基因。所述的重组质粒的载体为pET-28a(+)，重组质粒为pLW1178。含有重组质粒的重组菌株H1380，这些均属于本发明的保护范围。扩增木聚糖酶XynA2中任意片段的引物对，也在本发明的保护范围之内。本发明的较佳实施例中，上述木聚糖酶XynA2的最适底物为山毛榉木聚糖；本发明的较佳实施例中，上述木聚糖酶的反应温度为30-C-10(TC，优选7(TC。本发明的较佳实施例中，上述木聚糖酶反应pH值为7.6-10.6，优选最适反应pH值为9.0。本发明提供的表达木聚糖酶的重组质粒为pLW1178，至少包括上述的木聚糖酶XynA2的编码基因。本发明的较佳实施例中，上述的重组质粒的载体为pET-28a(+)。本发明的较佳实施例中，木聚糖酶的重组菌内导入了木聚糖酶XynA2的编码基因。所述的重组菌为大肠杆菌。优选为大肠杆菌BL21菌株。所属
技术领域：
的技术人员应该知道，本发明编码木聚糖酶的DNA序列，还包括编码对SEQIDNO:1所示核苷酸序列所表达的酶分子的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失并仍具有该酶活性的蛋白质的核苷酸序列。另外，对本发明的木聚糖酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的蛋白质，也能达到本发明的目的。因而本发明还包括与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少70%的同源性，优选具有至少90%的同源性，但同时具有木聚糖酶活性的蛋白质。上面使用的术语"多个"可以是小于IOO的数目，优选为小于10的数目。本发明所述的XynA2基因，它是以从嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2中分离的木聚糖酶XynA2(GTNG—1774基因编码)基因组DNA为模板，根据XynA2基因全序列，设计两对引物，有效地扩增出了XynA2基因片段并进行拓扑、克隆和DNA序列测定，进一步实验显示木聚糖酶XynA2将木聚糖的长链打断为寡聚木聚糖，然后通过木糖苷酶将寡聚木聚糖彻底降解(如图1)。本发明提出的XynA2和已知的木聚糖酶相比，本发明提出的XynA2木聚糖酶属于新型酶，不但耐高温，而且热稳定性优良。目前已公开发表的文章介绍木聚糖酶热稳定性较长的有嗜热脂肪芽孢杆菌(feo力acW7"s"ear"力e頂o/^7"s)T6中的木聚糖酶在65。C中能保存10小时(Khasin，A.，etal,Purificationandcharacterizationofathermostablexylanasefromfec_z'7_Zf/sstearot力ei"历cip力J'7i/51T—6.Appl.Environ.Microbiol.1993.59:1725-30.);放线菌(5Yre/^o/zycescja/ews)SN32中的木聚糖酶在60。C中倉旨保存1小时(Ni丽e，S.，etal，Purificationandcharacterizationofextracellularxylanasefrom5Yre/to/7yces1cya/2ei/51SN32,Bioresour.Technol.2007.);纤维单胞菌(CeL^/o忍o/asxaiaie朋)中的木聚糖酶在55或60。C中能保存1小时(Santiago—Herndndez，A.，etal，Purificationandcharacterizationoftwosugarcanebagasse—absorbablethermophilicxylanasesfromthemesophilicCe77w7,腦J脂'《e/a，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2007.34:331-338);阴沟肠杆菌(&teroZactersp.)MTCC5112中的木聚糖酶在50'C中能保存50小时(Khandeparkax,R.，etal，Purificationandcharacterizationofthermoalkalophilicxylanaseisolatedfromthe^/tero力3"ersp.MTCC5112，Res.Microbiol.2006.157:315-325);出芽短梗霉(J"reo6asJ't/j'"历p"77"7朋s)ATCC20524中的木聚糖酶在65。C中能保存半小时(Tanaka，H.，etal，Purificationandpropertiesofafamily-lOxylanasefromJ"i-eo力357W咖/w77i/7s"51ATCC20524andcharacterizationoftheencodinggene,Appl.Microbiol.Biotechnol.2006.70:202-211);坚强芽孢杆菌(&cj77"s/YrM/s)中的木聚糖酶在62'C中能保存16小时(Chang,P.,etal，Cloningandcharacterizationoftwothermostablexyianasesfromanalkaliphilic5a"77us/Yraus,BiochenuBioph.Res.Co.2004.319:1017-1025);嗜热芽孢杆菌(fecj77wt力er历朋ter"ic〃s)中的木聚糖酶在60。C中能保存24小时(Lama，L,etal,PurificationandcharacterizationofthermostablexyianaseandP—xylosidasebythethermophilicbacterium5aci77i/st力er翻tarc",，Res.Microbiol.2004.155:283-289);丙酮丁醇梭菌("ostrW咖ace"力"Wic柳)ATCC82中的木聚糖酶在60。C中能保存1小时(Ali，M.K.etal，Thermostablexyl肌ase10BfromC7ostrjW咖scetoZt/0^'c"/zATCC824,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2004.31:229-234);高温单孢菌(T力e擺羅卿orasp.)中的木聚糖酶在60。C中能保存8小时(Geore,S.P.，etal,Anovelthermostablexylanasefromr力er历cyz0/70s/Qrasp.:influenceofadditivesonthermostability,Bioresour.TechnoL2001.78:22卜224);高温放线菌(r力e層sc"層，st力a7一D中的木聚糖酶在65。C中能保存2小时(Kohli，U.etal,Thermostable,alkalophilicandcellulasefreexyianaseproductionbyT^er/ffosct/no/Hycest力a7o/力j7iASsubgroupC，EnzymeMicrob.Technol.2001.28:606-610)。本发明的木聚糖酶XynA2与现有技术相比的有益效果在于与已知的木聚糖酶相比该酶的热稳定性高，且在55'C下孵育24小时后仍具有5C^以上的活性，在70'C下活性能保存2小时，在75。C下活性能保存30分钟。本发明的木聚糖酶XynA2性能不同于已报道的木聚糖酶，该木聚糖酶XynA2具有在高温、高pH条件下保持高活性的特征。木聚糖酶XynA2最适反应温度为7(TC;最适反应pH9.0。在碱性环境中热稳定性好。适合分解半纤维素中的木聚糖生产功能性寡聚木聚糖。图1是本发明的木聚糖瞎降解木聚糖作用示意图2为本发明实施例中的木聚糖酶基因重组质粒的构建模式图图3表示本发明木聚糖酶SDS-PAGE电泳图。图4表示本发明木聚糖酶对不同底物的相对活力。图5表示本发明木聚糖酶在不同温度下的相对活力。图6表示本发明木聚糖酶在不同pH值下的相对活力。图7表示本发明木聚糖酶的在55'C下的热稳定性。图8表示本发明木聚糖酶的在7(TC下的热稳定性。图9表示本发明木聚糖酶的在75'C下的热稳定性。图IO表示本发明木聚糖酶SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。图11表示本发明木聚糖酶SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。图12表示本发明木聚糖酶XynA2与feo力ac/77w印.MT-1中的木聚糖酶氨基酸序列的比较。具体实施例方式为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明。下面的具体实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。实施例一1.嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2(CGMCCNo.1228)总DNA的提取嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2(CGMCCNo.1228)总DNA的提取研究证明由嗜热脱氮芽孢杆菌(6"eo力aci77i/s"e/wo^e/H'tri/yca/w)NG80-2基因组能够分离出编码醇脱氢酶的基因。因此，在本实施例中，采用从中国天津大港油田官69-8区块油井地层水分离获得的嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2(其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.1228，保藏日期为2004年10月09日，已申请国内发明专利并获得授权，发明名称嗜热脱氮芽孢杆菌及其筛选和应用，专利号ZL200410072759.7),取其过夜培养的新鲜培养物3ml,离心收集菌体，菌体悬于250u150mMTris缓冲液中(pH8.0)，加入lOul0.4MEDTA(pH8.0),混匀后37。C保温20min，之后加入30u120mg/ml溶菌酶，混匀后37。C再保温20min，再加入5u120mg/ml蛋白酶K，温柔混匀后，再加入20!U1(^SDS，5(TC保温至溶液澄清，分别用等体积酚氯仿:异戊醇抽提两次，氯仿:异戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于10011lTE缓冲液(pH8.0,10mMTris，lraMEDTA),加入10mg/mlRNase2p1，65。C保温30min，分别用酚氯仿异戊醇、氯仿异戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50U1TE缓冲液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280=1.95,A260=0.73。2.木聚糖酶基因XynA2的克隆和筛选取嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2(CGMCCNo.1228)总DNA溶液0.5u1(约10ng)作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增。反应混合物(50ul)如下ddH20，34ul;10XPCRBuffer,5ul;MgCl2Buffer,5ul;dNTPMix,2ul;上游引物，lul;下游引物，lul;NG80-2基因组DNA，lul;TaqDNApolymerase,lul。引物序列如下上游引物为SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，下游引物为SEQIDNO:4所示的核苷酸序列设定的PCR循环参数如下-95。C，5min;95°C，30s;50°C，45s:72°C，2min;72°C，lOmin;4°C，2hr。按上述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。上述PCR产物用7Vfco[和Z力ol双酶切，经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切产物片断。与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5a后，涂于含50ug/mlKan(卡那霉素)的LB固体培养基上。37'C培养12小时，挑取单克隆转接到20mlLB培养基中进行培养(50ug/mlKan)，37'C培养12小时后，提取质粒鉴定，插入有SEQIDNO:1的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW1178(见图2)，将重组质粒pLW1178转入表达宿主大肠杆菌BL21(该菌株可向天津开发区厚普生物技术开发有限公司订购,货号为69387-3)中，得到含有该重组质粒的重组菌株为H1398,此重组质粒pLW1178可高频转化大肠杆菌BL21表达木聚糖酶活性和抗卡那霉素性能。其中的酶切及连接反应均参照表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>g10XBuffer3.OpL载体DNA片断550ng限制性内切酶110~20U1OXT4ligasebuffer1限制性内切酶21(T20UTi腿ligase10UddH20X总体积lOuL总体积303.XynA2DNA片段的测定采用Sanger法对此DNA片段进行了测序，测序结果显示PLW1178中的插入片段含有长1002bp(SEQIDNO:1)的开放阅读框架，编码由333(SEQIDNO:2)个氨基酸组成的蛋白质。实施例二重组木聚糖酶的表达纯化和特性将上述重组菌H1398单克隆接入20ml含50ug/mlKan的LB培养基中，37°C，180rpm培养12小时，然后将培养物按1%(v/v)接种量接入200ml含50iig/mlKan的LB培养基，37°C,220rpm培养至0D600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.lmM，在37。C、180rpm诱导3小时。5000rpm离心5min收集菌体，悬于含50mMTris-HC1(pH8.0)缓冲液中，利用超声波破碎细胞，14000g离心20min，上清液为醇脱氢酶的粗提液。此上清液经螯合琼脂糖凝胶(ChelatingS印harose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带(见图3)。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此酶系的基本特性。用SDS-PAGE测得的重组酶的分子量为40kDa，与理论上推算的分子量(39027Da)相似；等电点沉淀法测得的重组酶的等电点pl为5.7。实施例三1.测定本发明木聚糖酶作用于不同来源的底物时的比活力将木聚糖酶添加于动物饲料或者造纸纸浆中，应当考虑其对不同来源的木聚糖的活性及专一性对应用的影响，燕麦木聚糖作为麦类作物(小麦、黑麦和小黑麦)木聚糖模式底物，山毛榉木聚糖和桦树木聚糖作为木材来源木聚糖模式底物考察其对不同来源木聚糖的比活力。上述实施例二中制得的木聚糖酶能降解不同来源的木聚糖，本实验对目前可购买到的三种木聚糖底物燕麦木聚糖(Sigma货号为X0627)、山毛榉木聚糖(Sigma货号为X4252)、桦树木聚糖(Sigma货号为X0502),进行了酶活力检测。具体方法为配制木聚糖酶XynA2反应体系(100ul)为加入燕麦木聚糖、山毛榉木聚糖、桦树木聚糖底物至终浓度1%(w/v)，一定浓度的木聚糖酶XynA2，用50mMpH9.0的glycine-NaOH缓冲液补至100ul。混匀，在70'C水浴中反应15分钟，反应结束后，冰浴终止反应，加入150ul的WDNS试剂(3，5二硝基水杨酸1%;苯酚0.2%;硫酸钠O.05%;酒石酸钾钠20%;氢氧化钠1%。避光放置两周后使用。)沸水浴10分钟，然后在540nm处测定光吸收。以木糖为标准曲线，计算每分钟生成lixmol还原糖所需酶量，定义为l个酶活力单位。测定结果参见图4，从该图中可以看出，木聚糖酶对三种不同来源的商品化木聚糖均能降解，其最适底物为山毛榉木聚糖。2.测定本发明木聚糖酶在不同温度下的比活力-对上述实施例二中制得的木聚糖酶进行最适反应温度的测定，具体方法为配制木聚糖酶XynA2反应体系(100ul)为加入燕麦木聚糖底物至终浓度1%(w/v)，一定浓度的木聚糖酶XynA2，用50mMpH9.0的glycine-NaOH缓冲液补至lOOP1。混匀，分别于25、00'C水浴中反应15分钟，反应结束后，冰浴终止反应。加入150y1的DNS试剂沸水浴10分钟，然后在540nm处测定光吸收。以木糖为标准曲线，计算每分钟生成lumol还原糖所需酶量，定义为l个酶活力单位。测定结果参见图5。从该图中可以看出，木聚糖酶的最适反应温度约为70'C。3.测定本发明木聚糖酶在不同pH下的比活力对上述实施例二中制得的木聚糖酶进行最适反应pH值的测定，具体方法为配制100u1反应体系，底物燕麦木聚糖的终浓度为1%(M/V)，一定浓度的木聚糖酶XynA2，分别用50mMpH3-11.9的缓冲液(配方见表2)补至100u1。混匀，在70'C水浴中反应15分钟，反应结束后，冰浴终止反应。加入150pl的DNS试剂沸水浴10分钟，然后在540mn处测定光吸收。以木糖为标准曲线，计算每分钟生成1ymol还原糖所需酶量，定义为1个酶活力单位。测定结果参见图6,从该图中可以看出，木聚糖酶的pH值为7.6-10.6，优选最适反应pH值为9.0。这种在碱性范围内稳定的特性有利于工业上应用。表2木聚糖酶活测定中所用的缓冲液pH范围缓冲液pH3-6citrate—sodiumcitratepH6-8K2HP04-KH2P04pH8-9Tris-HC1pH8.6-10.6glycine-NaOHpH11-11.9Na細广NaOH4.测定本发明木聚糖酶的热稳定性-对上述实施例二中制得的木聚糖酶进行热稳定性的测定，具体方法为将一定浓度的木聚糖酶XynA2放入55和70"C水浴中温浴，每隔一小时取出一部分酶做酶活反应。配制木聚糖酶XynA2反应体系(100u1)为加入燕麦木聚糖底物至终浓度1%"/"，一定浓度的木聚糖酶XynA2，用50mMpH9.0的Glycine-NaOH缓冲液补至lOOu1。混匀，在7(TC水浴中反应15分钟，反应结束后，冰浴终止反应。加入150ul的DNS试剂沸水浴IO分钟，然后在540nm处测定光吸收。以木糖为标准曲线，计算每分钟生成lumol还原糖所需酶量，定义为l个酶活力单位。测定结果参见图7、8、9。从图中可以看出，木聚糖酶XynA2在55'C温浴24小时后仍保持约5(^的酶活性，在7(TC温浴2小时后有2.6%的酶活性，在75°。温浴30分钟后有6.3%的酶活性。实施例四1.将本发明木聚糖酶XynA2的氨基酸序列与feo力aw77"ssp.MT-1木聚糖酶的氨基酸序列进行比对，比对结果参见图12。2.本发明木聚糖酶XynA2与6"eo力acj77wsstearot力eryzc!p力j7iAST6和CeoZacj7Jw51sp,MT-1中的木聚糖酶各项酶学参数均有不同，详见表3。表3XynA2与6"eO;6acj77i/ssfearot/e77no//j'JiAsT6和Geote"'JJiAssp.MT-1中的木聚糖酶酶学参数的比较NG80—2T6MT-1最适反应温度rc)最适反应pH707.6未鉴定未鉴定707.0热稳定性55'C温浴24小时后仍有5(W以上活性，70'C下未鉴定75'C温浴30分钟活性能保存2小时，75'C下活性能保存30分钟内即失活比活力(U/mg)368.76未鉴定289从图12和表3可以看出，由于氨基酸的变化，NG80-2中的木聚糖酶XynA2比fe"aci77"ssp.MT-l中的木聚糖酶活性更高，更耐碱嗜热，更具热稳定性。虽然本发明己以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属
技术领域：
的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围所做的更动与改进，都将落入本发明的保护范围。序列表<110>南开大学<120>耐高温木聚糖酶XynA2和编码该酶的基因与应用<160>4<210>1<211>1002<212>DNA<213>嗜热脱氮芽孢杆菌(Ge<6fl"7/WAerwfe"//wyJaHW)NG80-2<220><221>gene<222>(1)..(1002)<400>1atgagcgtgagtcaatcgctcccctccctccgtgaagtatttgcgaatgactttcgcatt60ggagcggcagttaatccggtgaccattgaaagctgttgattagccacgtc120aacagccttacagccgaaaacca±atgaagttcgaacatccttcagccggaagaagggcgg180ttcacgtttgacatcgccgatcgaatcgtcgatttcgctcgttcccatcacatggcggtt240cgcgggcatacgctcgtatgacgccggattgggtgtttcaggatggtcaa300ggtcatttcatcagcagggatgtgttgcttgagcggatgaagtcccacatttctgcagtt360gtacggcggtacaaggggaaagtgtattgctgggatgtggtcaacgaagcggtggctgac420gaggggsgcg祖tggttgcgttcstcga^gtggcgcc站aitcsttggggeicgattttatt480gaacaggcgtttctctgtgctcatgaagccgacccagacgcgttgttgttttacaatgat540tataatgaatgttttccgaaaaaacgcgagaagatctatacactagttaaatctttgcga600gacaaagggattcccattcscggcatcggtatgcaggcgcattggagcctgacgcgcccg660tcattggacgaaattcgagcagccattgaacgatatgcgtctctcgatgtggttcttcac720attacggagcttgatgtatctatgtttgaatttcacgaccatcgcaaggacttagctgcc780cctacaaacgaaatgatcgaacgacaggcagagcggtacg站ca站ttttcsctctattc840aaggagtatcgtgacgtaattgaaagtgtaacattttggggaatggccgatgactatacg900tggctcgatcactttccggtgcaagggagaaaaaactggccatttttgtttgatgaacaa960cacgaaccgaagtcagctttttggagagtggcgagtatct站1002<210>2<211>333bp<212>PRT<213>嗜热脱氮芽孢杆菌(feo6a"J7〃st力er/zoc/e/n'^ri/Yc朋s)NG80-2<220><221>CHAIN<222>(1)..(333)<400>2MetSerValSerGinSerLeuProSerLeuArgGluValPheAlaAsn151015AspPheArglieGly20LysGinLeuI^eulie35MetLysPheGluHis50lieAlaAspArglie6570ArgGlyHisThrLeu85GinAspGlyGinGly100MetLysSerHislie115TyrCysTrpAspVal130TrpIjeuArgSerSerAlaAlaValAsnProValThrlieGluSerGin2530SerHisValAsnSerLeuThrAlaGluAsnHis4045LeuGinProGluGluGlyArgPheThrPheAsp5560ValAspPheAlaArgSerHisHisMetAlaVal7580ValTrpHisAsnGinThrProAspTrpValPhe9095HisPhelieSerArgAspVall<eulieuGluArg105110SerAlaValValArgArgTyrLysGlyLysVal120125ValAsnGluAlaValAlaAspGluGlySerGlu135140LysTrpArgGinlielieGlyAspAspPhelie145150155160GluGinAlaPheLeuCysAlaHisGluAlaAspProAspAlaLeuLeu165170175PheTyrAsnAspTyrAsnGluCysPheProLysLysArgGluLyslie180185190TyrThrLeuValLysSerLeuArgAspLysGlylieProlieHisGly200205GinAlaHisTrpSerLeuThrArgProSerLeuAspGlu215220AlalieGluArgTyrAlaSerLeuAspValValLeuHis230235240LeuAspValSerMetPheGluPheHisAspHisArgLys245250255AlaProThrAsnGluMetlieGluArgGinAlaGluArg265270PheThrLeuPheLysGluTyrArgAspVallieGlu280285TrpGlyMetAlaAspAspTyrThrTrpLeuAspHis295300GlyArgLysAsnTrpProPheLeuPheAspGluGin310315320SerAlaPheTrpArgValAlaSerlie325330<210>3<211>32bp<212>DNA195lieGlyMet210lieArgAla225lieThrGluAspLeuAla260TyrGluGinlie275SerValThrPhe290PheProValGin305HisGluProLys<213>人工序列<4(,0>3acgaccatggtgagcgtgagtcaatcgctccc32<210>4<211>32bp<212>DNA<213>人工序列<400>4tgcactcgsgtg3tsctcgcC3ctctcc站ss3权利要求1、一种编码木聚糖酶XynA2的基因，该基因具有选自下组的核苷酸序列a)SEQIDNO1所示的核苷酸序列；或b)不同于SEQIDNO1但编码的氨基酸序列与SEQIDNO1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或c)在严格杂交条件下与所述的a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的木聚糖酶核苷酸序列。2、一种木聚糖酶XynA2，它具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；3、一种重组表达质粒，它含有权利要求l所述的木聚糖酶XynA2编码基因。4、权利要求3所述的重组表达质粒，所述的重组质粒的载体为pET-28a(+)。5、权利要求l所述的木聚糖酶XynA2编码基因，其特征在于所述的木聚糖酶于嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2中分离得到。6、权利要求l所述的木聚糖酶XynA2编码基因，其特征在于所述的木聚糖酶的最适底物为山毛榉木聚糖；最适反应温度均为70°C。7、权利要求1所述的木聚糖酶XynA2编码基因，其特征在于所述的木聚糖酶pH值为9.08、一种产生木聚糖酶的重组菌，其特征在于它含有权利要求1所述的木聚糖酶XynA2编码基因。9、权利要求8所述的木聚糖酶XynA2的重组菌，其特征在于所述的重组菌为大肠杆菌BL21菌株。全文摘要本发明公开了由嗜热脱氮芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)NG80-2基因组DNA借助PCR扩增而得到的木聚糖酶XynA2构建表达载体在大肠杆菌中表达出该基因编码的重组木聚糖酶。该酶的最适反应温度为70℃，最适反应pH为9.0，在碱性环境中热稳定性好。适合分解半纤维素中的木聚糖生产功能性寡聚木聚糖。文档编号C12N1/21GK101429516SQ20081015307公开日2009年5月13日申请日期2008年11月14日优先权日2008年11月14日发明者露冯,刘雪倩,磊王申请人:南开大学