专利名称：：高耐性酿酒酵母工程菌及其构建方法高耐性酿酒酵母工程菌及其构建方法
技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
，涉及工业微生物育种的方法，尤其是一种耐高温和耐高酒精浓度的酿酒酵母工程菌及其制备方法。
背景技术：
：酒精浓醪发酵可提高设备利用率、降低蒸馏能耗和生产成本。然而高浓度酒精对酵母菌的生长、发酵和存活都具有毒害作用，因此发酵终点的酒精浓度与酵母菌本身的耐酒精性能有关。普通酿酒酵母的酒精发酵浓度为12%(V)左右，如能将酒精发酵的浓度提高至16%(V)，则可节省蒸馏能耗25%左右。此外，普通酿酒酵母发酵的最适温度为32X:左右，当温度超过35'C时，酵母菌的生长和发酵能力大大减弱。如果能提高酵母对温度的耐受性，则可适当提高发酵温度，加快发酵速度，减少酒精发酵过程中冷却水的消耗量。综上所述，在酒精发酵时，有必要选用耐高温和耐高酒精浓度的酵母菌。许多研究都表明，海藻糖不仅是酿酒酵母细胞内的一种重要贮藏性碳源，而且可以作为酵母细胞的活性保护物质。在一些极端环境(冷冻、干燥、热处理等)下，酵母细胞可以通过调节海藻糖的合成来抵御外界的不良伤害，所以海藻糖含量被认为是酵母耐性的重要鉴定指标。但当环境条件恢复的情况下，胞内海藻糖又会迅速分解。所以如何降低胞内海藻糖的消耗速率是提高酵母耐性的有效途径。海藻糖的分解由两类海藻糖酶(Trehalase)调控，中性海藻糖酶(NTH，由WW和w/W基因编码)和酸性海藻糖酶(ATH，由a/W基因编码)。现在的研究表明中性海藻糖酶基因"&7在酵母胞内海藻糖的积累上起着关键作用。近年来虽然通过改善工艺条件及选用先进设备等可以在一定程度上提高酒精浓度，减少能源消耗，但是要从根本上解决酵母的耐性问题还是需要利用分子生物学育种技术构建耐高温和耐用消费品高酒精浓度的酿酒酵母工业菌株。
发明内容本发明目的是解决酿酒酵母菌株自身耐性不足的问题，提供一株具有耐高温和耐高酒精浓度的高耐性酿酒酵母工程菌及其构建方法。本发明采用基因工程育种技术选育获得的耐高温耐酒精的酿酒酵母菌株，可以更好地适合酒精浓醪发酵的要求，能够为酒精发酵工业带来显著的经济效益。本发明所提供的酿酒酵母工程菌，是将酿酒酵母中的中性海藻糖酶基因敲除，得到高海藻糖含量的酿酒酵母工程菌株，保藏号为CGMCCNo2666，命名为酿酒酵母Sflcc/zara附少ceyAY-18<=本发明所述的高耐性酿酒酵母工程菌的构建方法，是通过构建的同源重组质粒，采用同源重组的方式敲除酿酒酵母中编码中性海藻糖酶基因ATW/，降低酵母细胞内生物活性保护物质海藻糖的分解，获得耐高温耐酒精的酿酒酵母工程菌株。所述中性海藻糖酶OV77f/)的氨基酸序列的GenBank号为CAA88061。所述酿酒酵母(受体菌)可为酿酒酵母(&cc/wra/WK"cewv/w'ae)AS2.14(中国微生物菌种保藏管理委员会，公众可以通过该保藏管理委员会获得出发菌株AS2.14)。本发明方法所述的中性海藻糖酶的编码基因AT///是通过构建的重组质粒pUC-NK进行敲除的；所述重组质粒pUC-NK的物理图谱如图4所示。该构建方法的具体操作过程如下第一、编码酵母中性海藻糖酶iV77/7基因的获得根据已报道酵母中性海藻糖酶AA77/7的基因序列，设计上下游引物，进行AT/Z/基因的PCR扩增，引物序列为上游引物Pl:5'-CGTCAGCTTAGCGCTAGGC-3'下游弓l物P2:5'-CAATGCCTACCATCCGATCGC-3'以酵母总DNA为模板，以Pl和P2为引物进行PCR扩增；PCR条件Pl、P2各10mmol/L及1/10体积的10xPCR缓冲溶液，0.2mmol/L的dNTP和2U的TaqDNA聚合酶，以20pL系进行扩增；扩增条件先95'C变性5min，然后95'C变性40s，58°C退火60s，72°C延伸2min，共25个循环；最后72°C延伸8min使产物延伸完全；PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条约2.2kb的特异性条带，其大小与预期相当，即为编码酵母中性海藻糖酶iVLW基因；第二、重组载体pUC-NK质粒的构建将上步纯化后的PCR产物，经五coRI-AWel双酶切后，插入载体pUC19的五coRI和iWd酶切位点之间，构成pUC-N质粒；用历wdIII-SacI从pUG6中酶切/ox;-Kfl"、/ox;片段，插入质粒pUC-N的///wdlll和Sad酶切位点之间，构成pUC-NK质粒；第三、酿酒酵母工程菌的获得1)酿酒酵母AS2.14中M7/7的敲除将第二步构建的质粒pUC-NK通过醋酸锂转化法转入酵母AS2.14中，通过质粒上的iV77W与酵母中的染色体上的同源序列发生重组，从而整合到酵母染色体上随染色体一起复制；重组后一方面将Kanr基因引入酵母的染色体，使重组菌株产生G418抗性；另一方面，质粒的插入打断了酵母染色体上的iV77^基因，产生由两个不完整的NTH1基因构成的串联重复序列，从而实现iV77/7基因的敲除；2)kanr基因的去除将重组质粒pSH47电转化感受态的酿酒酵母单倍体细胞，涂布含有200mg/LG418的YEPD平板筛选转化子，将所得到的转化子挑到无菌水中饥饿培养3h后，重新验证转化子的Kanr抗性表型；挑选在G418平板上生长较好的转化子，接种含有半乳糖的液体YEPD培养基，3(TC诱导培养4小时，取适量培养液涂在YEPD平板上30"C培养2天，将得到的单菌落影印到含有200mg/L的G418的YEPD平板上，筛选Kan抗性标记丢失的菌株，即为高耐性酿酒酵母工程菌，分类命名是酿酒酵母(Sacc^romycMce/rv/w'ae)AY-18，保藏号为CGMCCNo2666。本发明的优点和积极效果本发明利用改进的Cre/loxP系统敲除了酿酒酵母AS2.14的M7//基因，获得了酿酒酵母中性海藻糖酶(;V77//)突变株AY-18(CGMCCNo2666)。本法具有操作简单、方便易行的特点。本发明所获得的酿酒酵母工程菌&cc/KWwn_ycMcerevis/aeAY-18(保藏号CGMCCNo2666)与普通的酿酒酵母菌(受体菌)相比，胞内海藻糖含量高，具有良好高温耐性和酒精耐性，在52'C高温下处理60min细胞存活率为85.15%,经20%(V)酒精冲击4h细胞存活率为95.12%，发酵酒精浓度达18.2%(V)，适合于淀粉质原料的酒精浓醪发酵，能够为酒精发酵工业带来显著的经济效益。工程菌对发酵设备及条件没有特殊要求，一般酒精厂的设备和条件均可使用。附圉说明图1为MH/的PCR产物电泳图2为pUC19质粒的物理图谱；图3为pUG6质粒的物理图谱；图4为质粒pUC-NK的构建过程与图谱图5为质粒pUC-NK的酶切验证；图6为M7//的重组过程，；图7为pSH47质粒的物理图谱；图8为Southernblot分析AwW突变株。本发明提供的耐高温耐酒精酿酒酵母菌株(Sacc/wnwi_yc^cerev/w'從)，已于2008年9月12日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo2666,建议分类命名为酿酒酵母Sacc^aro加ycescew's/ae。具体实施方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1、中性海藻糖酶缺失的酿酒酵母工程菌的获得1、中性海藻糖酶缺失的酿酒酵母工程菌的构建(1)编码酵母中性海藻糖酶iV77f7基因的获得根据已报道面包酵母中性海藻糖酶的基因序列(GenBank号为CAA88061),设计上下游引物，进行iV77/7基因的PCR扩增。引物序列为上游引物Pl:5'-CGTCAGCTTAGCGCTAGGC-3'下游引物P2:5'-CAATGCCTACCATCCGATCGC-3'以酵母总DNA为模板，以Pl和P2为引物进行PCR扩增。PCR条件Pl、P2各10mmol/L及1/10体积的10xPCR缓冲溶液，0.2mmol/L的dNTP和2U的TaqDNA聚合酶，以20pL系进行扩增。扩增条件先95。C变性5min，然后95。C变性40s，58。C退火60s，72°C延伸2min，共25个循环；最后72°C延伸8min使产物延伸完全。PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条约2.2kb的特异性条带，其大小与预期相当(图1)，其中图1中泳道M为Marker，泳道1为的PCR产物。(2)重组载体的构建与酶切验证将纯化后的PCR产物，经￡coRI-A^d双酶切后，插入载体pUC19(图2)的￡coRI和MM酶切位点之间，构成pUC-N质粒。用/f/wdlII-5"fld从pUG6中酶切/0;^-/:";"-/0乂/7片段，插入质粒pUC-N的//i"din和&d酶切位点之间，构成pUC-NK质粒(图4)。质粒pUC-NK经五coRI-AWd酶切释放出1400bp和5200bp的特异性条带，其大小与预期相当(图5)，其中图5中泳道M为Marker，泳道1为质粒pUC-NK，泳道2为经五coRI-AWel双酶切后的pUC-NK质粒。(3)酿酒酵母工程菌的获得1)酿酒酵母AS2.147V77W的敲除将质粒pUC-NK通过醋酸锂转化法转入酵母中，通过质粒上的iV77//与酵母中的染色体上的同源序列发生重组，从而整合到酵母染色体上随染色体一起复制(图6)。重组后一方面将Kanr基因引入酵母的染色体，使重组菌株产生G418抗性；另一方面，质粒的插入打断了酵母染色体上的iV77//基因，产生由两个不完整的NTH1基因构成的串联重复序列，从而实现M7/7基因的敲除。2)kanf基因的去除将重组质粒pSH47(图7)电转化感受态的酿酒酵母单倍体细胞，涂布含有200mg/LG418的YEPD平板筛选转化子，将所得到的转化子挑到无菌水中饥饿培养3h后，重新验证转化子的Kai^抗性表型。挑选在G418平板上生长较好的转化子，接种含有半乳糖的液体YEPD培养基，3(TC诱导培养4小时，取适量培养液涂在YEPD平板上30'C培养2天。将得到的单菌落影印到含有G418(200mg/L)的YEPD平板上，筛选Kan抗性标记丢失的菌株。2、中性海藻糖酶缺失的酿酒酵母工程菌的验证(1)工程菌的稳定性检测将酿酒酵母在YEPD培养基中连续传代20代，提取酵母染色体DNA，以其为模板用PCR方法进行验证，结果表明，已成功实现iV77/7基因的敲除，未发生丢失现象。(2)Kanr的检测将酿酒酵母AY-18(CGMCCNo2666)和受体菌酿酒酵母分别接种在含有200mg/LG418的YEPD平板上，在30'C条件下培养3天后，结果表明，受体菌酿酒酵母AS2.14和酿酒酵母AY-18(CGMCCNo2666)在200mg/LG418的YEPD平板上均不能生长。(3)Southern杂交验证以iV77Z7基因中经酶切的1.2kb的片段为探针，与经Pc/I酶解的酵解总DNA杂交，出现了4.02kb的杂交条带，为酵母染色体上包含完整AT/f/基因的户dl片段；与JWW突变株尸dl酶解的总DNA杂交出现2.0kb和4.35kb的2条杂交条带，为酵母染色体上A77f/基因上游和下游的尸c/1位点与质粒pUC-NK上Pc/I位点间DNA片段的长度(图8)。实施例2、菌株耐性试验1、胞内海藻糖含量亲本和突变株分别经斜面活化后，首先分别接入30mLYEPD液体培养基中，30'C静止培养24小时后，按10%的接种量接至50mLYEPD液体培养基中，3(TC摇床(150rpm)培养36小时后，离心收集菌体，用硫酸蒽酮法测定胞内海藻糖含量。试验结果见表l，从结果看,突变株的海藻糖含量为16.53%，与亲本相比提高了98.9%。而且生物量没有变化，说明海藻糖酶基因的缺失并没有对酵母的生长产生影响。表l亲本和突变株海藻糖含量的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、高温耐性亲本和突变株分别经斜面活化后，首先分别接入30mLYEPD液体培养基中，3(TC静止培养24小时后，按10%的接种量接至50mLYEPD液体培养基中，30'C摇床(150rpm)培养12小时后，离心，用冷水洗涤，然后将其悬浮在50mLYEPD液体中，当细胞浓度达到OD6Q()=0.5h时，在52'C下处理60min后迅速在冰浴中冷却，然后将其细胞悬浮液稀释到l()S个/ml，涂平板测定细胞存活率(见表2)。由表2可知，经高温处理后亲本的存活率为16.83%,而zlw/W的存活率可达85.15%。热激会增加海藻糖合成酶海藻糖-6-磷酸合成酶(fj^)的表达量，增加海藻糖的含量。突变株由于敲除了海藻糖酶基因，可以阻止海藻糖的分解，使胞内海藻糖积累量增加，从而提高了细胞的高温耐性。表2J"A7突变株高温(52°C，60min)存活率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3、酒精耐性亲本和突变株分别经斜面活化后，首先分别接入30mLYEPD液体培养基中，3(TC静止培养24小时后，按10。/。的接种量转接至YNB液体培养基中，30°C150r/min培养至稳定期早期，取5mL菌液，离心，无菌水洗涤，转移至含酒精20M的50mLYNB培养基中冲击4h。然后将其细胞悬浮液稀释到l()S个/ml，涂平板测定细胞存活率(见表3)。从结果看，经20%(V)酒精冲击4h后，突变株的存活率为95.12%，比亲本提高了43.18%，说明突变株酒精耐性大大提高了。表3酒精冲击(20%，<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例3、30L罐酒精浓发酵实验1、糊化液化取玉米粉10.8kg，加70。C温水19.0L调浆，加耐高温a-淀粉酶(20000U/mL)5.6mL，CaC1213.6g，混匀后升温至8590°C,糊化液化90min。2、糖化糊化醪冷却到60。C，加糖化酶(105U/mL)13.0mL，糖化30min。3、接种发酵糖化醪冷却至30'C，加尿素17.6g，磷酸氢二钾8.0g，硫酸镁4.0g，搅匀，接酵母种子液4.0L，补加无菌水至发酵液总体积约26.5L。4、温度控制发酵前期(012h)32°C，主发酵期(1228h)36°C，后发酵期33°C，72h发酵结束。5、发酵结束后分测定残糖、酒精浓度，并计算淀粉对乙醇得率，结果见表4。结果表明，与亲本相比，突变株的发酵酒精度提高了3.7度，淀粉出酒度提高了10.59个百分点；从残糖情况看，突变株发酵液残糖为0.48g/100mL，亲本的残糖为6.53g/100mL。这是因为亲本菌株由于不能耐受较高的酒精度，发酵至60h后酵母细胞大量死亡，酒精发酵已基本停止，最终导致发酵不彻底。表430L罐酒精浓醪发酵试验结果(五次试验平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注计算淀粉对乙醇得率时，按投入的总淀粉计。权利要求1、一种高耐性酿酒酵母工程菌，是将酿酒酵母中的中性海藻糖酶NTH1基因敲除，得到不产生中性海藻糖酶且耐性比所述酿酒酵母高的菌株。2、如权利要求1所述的高耐性酿酒酵母工程菌，其特征在于所述酿酒酵母工程菌为酿酒酵母(Sacc/wro/^cescem^/ae)AY-18,保藏号为CGMCCNo2666。3、如权利要求1所述的高耐性酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于该方法是通过构建的同源重组质粒，采用同源重组的方式敲除酿酒酵母中编码中性海藻糖酶基因M7//,降低酵母细胞内生物活性保护物质海藻糖的分解，获得耐高温耐酒精的酿酒酵母工程菌株。4、如权利要求3所述的高耐性酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于所述的中性海藻糖酶的编码基因MH/是通过构建的重组质粒pUC-NK进行敲除的。全文摘要本发明公开了一种高耐性酿酒酵母工程菌及其构建方法。本发明所提供的酿酒酵母工程菌，是利用改进的Cre/loxP系统将酿酒酵母中编码中性海藻糖酶的基因敲除，得到生物活性保护物质海藻糖含量提高的菌株SaccharomycescerevisiaeAY-18(保藏号CGMCCNo2666)。本法具有操作简单、方便易行的特点。本发明所获得的酿酒酵母工程菌胞内海藻糖含量高，具有良好高温耐性和酒精耐性，在52℃高温下处理60min细胞存活率为85.15％，经20％(V)酒精冲击4h细胞存活率为95.12％，发酵酒精浓度达18.2％(V)，适合于淀粉质原料的酒精浓醪发酵，能够为酒精发酵工业带来显著的经济效益。工程菌对发酵设备及条件没有特殊要求，一般酒精厂的设备和条件均可使用。文档编号C12N1/19GK101440352SQ200810153108公开日2009年5月27日申请日期2008年11月17日优先权日2008年11月17日发明者烨吕,肖冬光,欣郝,郭学武申请人:天津科技大学被以下专利引用(1),