专利名称：通过分批或半连续培养大量生产紫杉醇的方法
本申请是申请日为1996年4月27日的中国专利申请96190419.4(PCT/KR96/00060)的分案申请。
另一方面，已采用全化学合成、半合成和提取方法制备紫杉醇。
然而，全化学合成法尚未实际应用，因为其需要非常昂贵的化学试剂并且收率也不是很高，这一点可从紫杉醇的复杂化学结构预料到。
采用前体如10-脱乙酰基浆果赤霉素III的半合成方法已被证明存在一些缺点，因为其需要复杂而繁多的从紫杉属植物中分离和纯化紫杉醇前体并将前体转化成紫杉醇的步骤。
考虑到这些方面，现有技术中主要采用经济的提取方法，通过该方法可直接从紫杉属植物中分离紫杉醇。然而，所述方法已证明也存在令人不满意之处，即其需要大量的紫杉树来纯化紫杉醇，由此最终导致严重的环境破坏。
因此，用全化学合成、半合成和提取方法提供用于世界范围的化学治疗学用途的紫杉醇得不到保证，仍非常有必要开发生产紫杉醇的其它方法。
作为一种很有潜力的解决所述问题的方法，细胞培养生产紫杉醇的方法已在现有技术中有提议。
不同于现有技术，基于细胞培养的生产紫杉醇的方法具有如下优点首先，可以以稳定的方式生产紫杉醇，而不受枯萎病和害虫等导致供给的紫杉属植物不稳定的影响；第二，细胞培养物可在大的生物反应器中繁殖，由此通过控制培养条件可以大量生产紫杉醇；第三，与其它现有技术方法相比，细胞培养物能生产光谱较简单的化合物，大大地简化了分离和纯化过程；第四，细胞培养法可以比其它方法更好地迅速适应需求量的快速变化；第五，细胞培养法可以生产紫杉醇以及能转化为紫杉醇的紫杉烷前体如浆果赤霉素。
现有技术中已描述了利用培养的植物细胞生产紫杉醇的方法USP5,019,504公开了一种利用短叶紫杉的培养细胞生产紫杉醇及其衍生物的方法，然而，其中所述的紫杉醇产量为1-3mg/L，不足以工业应用。另外，通过该细胞培养物生产紫杉醇不稳定，甚至即使通过选择可获得高产率的初级细胞，通过次级培养也很难保持其含量(见E.R.M.Wickremesine等，细胞和组织培养世界会议(1992))。
USP5,015,744教导了一种从浆果赤霉素III(一种生物合成紫杉醇的前体)进行半合成的方法，通过使用植物组织培养物，可以生产用于半合成方法的原料如浆果赤霉素III，因此，该植物组织培养物也可用于通过上述半合成方法生产紫杉醇。
WQ 93/17121提供了一种通过紫杉属植物的细胞培养同时改变培养基的组成、生长速率和生产速率等而生产紫杉醇的方法，在应用中国紫杉(Taxuschinensis)的情况下，在生物量每2.5天加倍的18天的培养物中可获得24.1mg/L的紫杉醇。
所有这些专利描述的均是通过采用分批培养大量生产紫杉醇的方法，在所述的专利中没有教导也没有预期生产紫杉醇的细胞系的半连续培养。
在这种情况下，USP5,407,816描述了将中国紫杉细胞接种到营养培养基中形成悬液，然后培养该悬液以形成悬浮培养物，该悬浮培养物又在其它营养培养基中次级培养以形成生产培养物，该生产培养物最终以153mg/L的收率生产出紫杉醇和紫杉烷。所述的方法显著提高了紫杉醇的产率，但是已证明该方法仍有不令人满意之处，即其需要许多组成非常复杂的营养培养基，并且高产率仅在相当受限的生长条件下才能达到。
因此，仍需要开发一种实用简便的生产紫杉醇的方法，该方法应能满足高产率的要求，而这一点是决定该方法能否适于工业应用的主要因素。
本发明的一个主要目的在于提供一种通过半连续培养大量生产紫杉醇的方法。
本发明的另一个目的在于提供一个从中国紫杉分离出的新的生产紫杉醇的细胞系。
图2示出柠檬酸铵对紫杉醇产率的影响的图表。
图3示出麦芽糖对紫杉醇产率的影响的图表。
图4示出在SYG-1半连续培养中的紫杉醇产率与培养循环的关系。
随后，本发明人优化了本发明的细胞系的生长条件，并确定SYG-1细胞在B5培养基上生长良好，更优选是补加20μM NAA(萘氧基乙酸)、0.4μM BAP(6-苄基氨基嘌呤)、1g/L酪素水解物和30g/L蔗糖的B5培养基，培养条件为温度24℃，摇瓶速度为150rpm。另外，还检测了AgNO3、柠檬酸铵和麦芽糖对紫杉醇产率的影响，本发明人总结出添加这些物质能显著提高紫杉醇的产率。
根据本发明，通过采用SYG-1的半连续培养可以高收率制备紫杉醇，该方法包括(i)将紫杉属植物细胞接种到含1-10％(重量/体积)糖的培养基中并保温培养；以及，(ii)将1/10-1/2体积的步骤(i)得到的培养物转移到新鲜培养基中并重复步骤(i)，向剩余的培养物中加入1-10％(重量/体积)糖并培养至紫杉醇最大产量时间。
在开始培养时可以将AgNO3以1-15μM、优选5-10μM的浓度加入到紫杉属植物细胞培养物中并培养10-20天，更优选10-15天。另外，可以在培养后5-30天、更优选5-10天将柠檬酸铵和麦芽糖分别以1-15mM、更优选1-10mM和1-10％(重量/体积)、更优选1-5％(重量/体积)的浓度加入到培养物中。
培养5-30天后，将1/10-1/2体积的总培养物转移到含新鲜培养基的培养瓶中开始循环培养，该新鲜培养基的成分与培养开始时采用的培养基成分相同。然后，向相当于总培养物的9/10-1/2体积的剩余的培养物中加入1-10％(重量/体积)、更优选1-5％(重量/体积)麦芽糖，培养30-60天，此时紫杉醇产量达到最高，培养温度为24℃、摇瓶速度为150rpm，并在暗处培养。
本发明方法中所用的紫杉属植物包括短叶紫杉，加拿大紫杉(Taxuscanadensis)、东北紫杉(Taxus cuscidata)、欧洲紫杉(Taxus baccata)、Taxusglobosa、佛罗里达紫杉(Taxus floridana)、喜马拉雅紫杉(Taxus wallichiana)、Taxus media和中国紫杉，然而，最优选采用的是本发明人新开发的中国紫杉SYG-1。
根据本发明，当采用中国紫杉SYG-1半连续培养并添加提高紫杉醇产率的AgNO3、柠檬酸铵和麦芽糖时，在培养42-49天后观察到紫杉醇的产率达到300mg/L的水平。紫杉醇的定量分析在下表1所述的具体条件下，用高效液相色谱定量分析根据本发明的方法从中国紫杉SYG-1培养物中生产的紫杉醇。
表1紫杉醇定量分析的条件
在下述实施例中将对本发明进行进一步描述，实施例不应看作是对本通过将愈伤组织分别转移到现有技术中公知的几种培养基中，例如MS(见Murashige，T.和F.Skoog，F.，植物生理学，5473(1962))，SH(见Schenk和Hilderbrandt，加拿大植物学杂志，50199-204(1972))，WPM(见Lloyd和Mccown，Int.Plant Prop.Soc.Proc.，30421-427(1981))和B5培养基(见上述)，并肉眼观察愈伤组织的生长模式而选择愈伤组织的生长培养基。从上述结果可以确定愈伤组织在含20μM NAA、0.4μM BAP和2g/L酪素水解物的B5培养基上生长良好。
随后，对如此诱导的细胞系进行形态学、生理学和生长条件的研究，并与现有技术中公知的细胞系进行比较，结果示于表2和表3。如表2和表3所示，可以确定本发明开发的细胞系在紫杉醇产率和紫杉醇分泌模式等方面明显区别于现有技术中的细胞系。因此，该细胞系被命名为中国紫杉SYG-1，并在1996年3月14日保藏于国际保藏机构(IDA)韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，入藏号为KCTC 0232BP。表2 中国紫杉SYG-1的形态学和生长条件
表3本发明的细胞系与现有技术的细胞系的特征比较
实施例2 SYG-1的悬浮培养为选择用于SYG-1悬浮培养的最优选的培养基，将细胞系分别转移到MS、SH、WPM和B5培养基中，与实施例1类似观察生长模式，其结果是，与愈伤组织类似，SYG-1细胞在含20μM NAA、0.4μM BAP和2g/L酪素水解物的B5培养基上生长良好。另外，还确定了SYG-1细胞在24℃的培养温度和150rpm的摇瓶速度下生长良好。
在固化培养基的情况下每4周进行愈伤组织的系列培养，同时借助于镊子将部分转移将一片愈伤组织保留在固体培养基平板上。随后将保留在固体培养基上的愈伤组织接种到少量B5培养基中，并且随着细胞生长至增加培养物的总体积，向其中补加少量培养基。而后以1/5(体积/体积)的比率将生长良好的细胞系在装于500ml Erlenmeyer培养瓶中的改良的B5培养基中稀释，并每2周接种到悬浮培养基中。实施例3 AgNO3对紫杉醇产率的影响业已熟知AgNO3是作用于植物细胞生长和二级代谢物产生的植物激素乙烯的拮抗剂，因此，本发明测试了AgNO3对SYG-1悬浮培养中紫杉醇的生产的影响。
向-250ml锥形培养瓶中加入75ml含10μM AgNO3的B5培养基，将25ml 14天的细胞培养物接种到此培养基中并以实施例2所述类似的方式培养，然后，将紫杉醇的产率与不含AgNO3的对照进行对比(见
图1)。如图1所示，可以很清楚地确定，当向培养基中加入AgNO3时紫杉醇的产率98.95mg/L(-●-)是对照(-○-)的4.7倍。实施例4 柠檬酸铵对紫杉醇产率的影响在加入柠檬酸铵后监测SYG-1悬浮培养物中的紫杉醇产率。向一250ml Erlenmeyer培养瓶中加入75ml B5培养基，将25ml 14天的细胞培养物接种到此培养基中并以实施例2所述相同的生长条件培养，然后，在培养9天后向培养物中加入5mM柠檬酸铵，将紫杉醇的产率与未加柠檬酸铵的对照进行对比(见图2)。如图2所示，可以确定，当向培养基中加入柠檬酸铵时紫杉醇的产率约为103.6mg/L(-●-)，其是对照(-○-)的4.9倍。实施例5 麦芽糖对紫杉醇产率的影响已熟知在植物细胞培养物中提高糖的浓度能导致二级代谢物的增加，例如，据报道在野胡萝卜(Daucus carota)的愈伤组织培养物中加入3％(重量/体积)蔗糖和5％(重量/体积)甘露醇提高了单花青苷(antocyanin)的产率(见Knobloch，K.-H.等，Zeiteshrift fur Natruforschung，35c55-556(1981))；在葡萄(Vitis vinifera)的悬浮培养物中加入88mM蔗糖和165mM甘露醇提高了单花青苷的产率(见Rajendran，L.等，Biotechnology Letters，14(8)707-712(1992))。另一方面，还报道了当糖的加入量超过一定浓度时生长和二级代谢物的产量均下降，这可能是由于渗透应力造成(见DO，C.B.和Cormier，F.，Plant Cell Reports，9500-504(1990))。
评价麦芽糖加入到SYG-1中的效果。
向一250ml锥形培养瓶中加入75ml B5培养基，将25ml 14天的细胞培养物接种到此培养基中并以实施例2所述相同的生长条件培养，然后，分别在培养9天和21天后向培养物中加入2％(重量/体积)和3％(重量/体积)麦芽糖，将紫杉醇的产率与不含麦芽糖的对照进行对比(见图3)。如图3所示，可以确定，当向培养基中加入麦芽糖时紫杉醇的产率约为112.75mg/L(-●-)，其是对照(-○-)的5.3倍。实施例6 SYG-1的半连续培养基于实施例2-5得到的结果，采用SYG-1的半连续培养制备紫杉醇。
向一250ml锥形培养瓶中加入80ml B5培养基和20ml 14天的细胞培养物，在培养开始时加入10μM AgNO3，然后，在培养9天后向培养物中加入5mM柠檬酸铵和2％(重量/体积)麦芽糖，培养21天后，将相当于总培养物1/5体积的20ml培养物转移到另一含80ml新鲜培养基的培养瓶中开始另一培养循环。随后，向相当于总培养物4/5体积的80ml剩余培养物中加入3％(重量/体积)麦芽糖，并再培养21天，此时紫杉醇产量达到最大。此时，培养温度设定为24℃，摇瓶速度为150rpm。定期从培养物中取样以检测微生物污染，并且如上所述采用高效液相色谱(HPLC，Waters，U.S.A.)测定培养物中紫杉醇的产量。结果是，为观察到微生物污染并且培养42天后紫杉醇的产率为284mg/L(见图4)，如图4所示，紫杉醇的浓度随着培养循环的重复而增加。
如上所述，本发明提供了以高产率通过半连续培养紫杉属植物而大量生产紫杉醇的方法，根据本发明，当在半连续培养中采用中国紫杉SYG-1并添加提高紫杉醇产率的AgNO3、柠檬酸铵和麦芽糖时，在培养40-50天后观察到紫杉醇的产率达到300mg/L的水平。
权利要求
1.一种大量生产紫杉醇的方法，包括下述步骤(i)将紫杉属植物细胞接种到含1-15μM AgNO3的培养基中并培养；以及，(ii)从产生紫杉醇的培养物中回收紫杉醇。
2.权利要求1的大量生产紫杉醇的方法，其中紫杉属植物选自由短叶紫杉、加拿大紫杉、东北紫杉、欧洲紫杉、Taxus globosa、佛罗里达紫杉、喜马拉雅紫杉、Taxus media和中国紫杉组成的一组。
3.权利要求1的大量生产紫杉醇的方法，其中紫杉属植物是中国紫杉SYG-1(KCTC 0232BP)。
4.权利要求1的大量生产紫杉醇的方法，其中培养以分批或半连续方式进行。
全文摘要
本发明涉及以高产率通过分批或者半连续培养紫杉属植物而大量生产紫杉醇的方法，根据本发明，通过采用紫杉属植物细胞的分批或半连续培养可以高产率制备紫杉醇，所述的方法包括(i)将紫杉属植物细胞接种到含1－15μMAgNO
文档编号C12P15/00GK1394961SQ0114487
公开日2003年2月5日 申请日期1996年4月27日 优先权日1995年4月27日
发明者崔亨均, 汤姆·李·亚当斯, 罗伊·威廉·斯塔尔赫特, 金尚翼, 尹晶焕, 宋凤圭, 金镇铉, 宋准锡, 洪承绪, 李贤秀 申请人:(株)三养吉尼克斯