专利名称：拉达卡链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因及其编码的转谷氨酰胺酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种编码转谷氨酰胺酶的新DNA分子及其编码的转谷氨酰胺酶。
转谷氨酰胺酶在细胞外和细胞内均有发现。从许多动物和一些植物物种中已鉴别和鉴定了多种转谷氨酰胺酶。不幸的是，衍生自动物如豚鼠的转谷氨酰胺酶在产业上无法应用，因为难于以低成本获得大量的这种动物来源的转谷氨酰胺酶。目前仅揭示了很少几种微生物转谷氨酰胺酶，即来自菌种茂原链轮丝菌(Streptoverticilliummobaraense)、肉桂链轮丝菌(Streptoverticillium cinnamoneum)和灰肉色链轮丝菌(Streptoverticillium griseocarneum)(见美国专利5,156,956)以及来自预期为淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)的菌种(见美国专利5,252,469)的转谷氨酰胺酶。根据Wu等，在所筛选的菌株中，拉达卡链轮丝菌(Streptoverticillium ladakanum)的转谷氨酰胺酶具有最高的活性(Wu等，1996，Chinese Agric.Chem.Soc.34(2)228-40)。
编码转谷氨酰胺酶的基因已从链轮丝菌菌种S-8112(Washizu等，1994，Biosci.Biotechnol.Biochem.58(1)82-7)，肉桂链轮丝菌(Pasternack等，1998，Eur.J.Biochem.257(3)570-6)，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)(WO9606931)和枯草芽孢杆菌(Kobayashi等，1998，J.Gen.Appl.Microbiol.4485-91)中克隆。
另外，目前基因工程技术已使得获得大量酶相对容易，这可通过分离编码酶的基因，确定酶基因的碱基序列，产生含有编码酶的基因的重组DNA，将重组DNA掺入微生物或动物或植物细胞，以及培养所获得的转化子而实现。
本发明的另一目的是提供包含本发明的DNA分子的表达载体。
本发明的再一目的是提供包含本发明的表达载体的宿主细胞。
本发明的又一目的是提供包含由本发明的DNA分子编码的氨基酸序列的多肽。
图1示出茂原链轮丝菌CCRC 12165的转谷氨酰胺酶基因的部分片段(644bp)。
图2示出KpnI片段的3241个核苷酸序列以及位于KpnI片段的第二个开放读框的第700-1900位核苷酸附近的基因。
图3示出质粒pAE051和pAE052的限制图谱。
图4示出质粒pAE051在浅青紫链霉菌(S.lividans)JT46中的表达活性。
本文所用术语“氨基酸序列”是指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列，“氨基酸序列”及类似术语如“多肽”或“蛋白质”并非将氨基酸序列限制为与所引述的蛋白质分子相关的完整氨基酸序列。氨基酸序列包括寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，及其片段或部分，以及天然存在或合成的分子。
本文所用术语“缺失”是指氨基酸或核苷酸的变化，其中一或多个氨基酸或核苷酸残基被缺失。
本文所用术语“插入”或“添加”是指导致与天然存在的分子相比添加一或多个氨基酸或核苷酸残基的氨基酸或核苷酸序列的变化。
本文所用术语“载体”是指能转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种优选的载体是附加体，即能在染色体外复制的核酸。优选的载体是能够自动复制和/或表达与其相连的核酸的载体。能指导与其可操纵连接的基因的表达的载体在本文中称作“表达载体”。通常，重组DNA技术中实用的表达载体通常是“质粒”形式，其通常是指环状双链DNA环，其在载体形式中不与染色体结合。
本文所用术语“宿主细胞”是指可被载体如质粒感染的宿主的细胞。适于本发明的宿主包括本领域通常和常规使用的宿主。核酸本发明的一个目的是提供分离的和纯化的DNA分子，其包含编码转谷氨酰胺酶的序列，其中所述核酸在高度严格条件下与SEQ IDNO1所示序列或其互补序列杂交。更优选地，所述DNA分子编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的转谷氨酰胺酶。最优选地，所示DNA分子由SEQ ID NO1所示的完整核苷酸序列代表。
具有序列相似性的核酸由在高度严格条件下的杂交而检测。高度严格杂交条件是指在例如含有0.25M Na2HPO4(pH7.4)，7％十二烷基磺酸钠(SDS)，1％牛血清白蛋白(BSA)，1.0mM乙二胺四乙酸(EDTA，pH8)的缓冲液中于65℃杂交，随后用0.1％SDS和0.1倍SSC在65℃洗3次(0.1倍SSC含有0.015M氯化钠和0.0015M柠檬酸三钠，pH7.0)。
编码本发明的转谷氨酰胺酶的序列可以本领域已知的各种方式突变以产生在启动子强度、编码的蛋白质的序列等方面的定向变化。这种突变的DNA序列或产物与本文提供的序列基本相似，即它们将有至少一个核苷酸或氨基酸的不同，并可有至少两个但不超过约十个核苷酸或氨基酸的不同。所述变化可以是取代、插入或缺失。
目前有若干不同的方法来分离本发明的DNA。这些方法包括，例如，纯化酶蛋白，随后将其直接进行氨基酸微测序或在限制裂解后进行氨基酸微测序。所获得的部分氨基酸序列可用于设计简并寡核苷酸探针或引物以用于经聚合酶链反应(PCR)产生独有的非简并核苷酸序列，即可随后用作探针筛选DNA文库的序列。也可使用抗纯化的蛋白质的抗体从DNA表达文库中分离DNA克隆。或者，可使用相关酶的DNA分子的序列作为克隆策略的起点。这一方法通常称为“同源性克隆”。使用来自不同物种的序列信息的另一种方式是在来自不同物种的相关DNA分子中缩小高序列同源性的区域，并进行聚合酶链反应测序扩增方法(PCR)以获得“物种特异性”非简并核苷酸序列。这种序列随后可用于DNA文库筛选或甚至用于直接基于PCR的DNA克隆。
使用本领域熟知的生物化学程序，可用寡核苷酸探针在各种样品中检测和扩增本发明的DNA分子。例如，可使用应用标记探针的Southern或Northern印迹杂交技术。或者，可使用PCR技术，并且扩增的PCR产物的核酸测序可用于检测DNA中的突变。表达载体和宿主系统本发明的另一目的是提供含有SEQ ID NO1所示DNA分子的表达载体。为了表达生物活性的转谷氨酰胺酶，编码转谷氨酰胺酶的核酸序列可被插入合适的表达载体即含有转录和翻译所插入的编码序列所必需的元件的载体中。根据本发明，可使用本领域熟知的方法构建含有图1所示DNA分子以及合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内基因重组。
本发明的另一目的是提供含有表达载体的宿主细胞，所述表达载体含有SEQ ID NO1所示的DNA分子。根据本发明，可使用各种宿主系统以含有和表达编码转谷氨酰胺酶的序列，这些宿主系统包括但不限于用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的微生物，如细菌；用酵母表达载体转化的载体；用病毒表达载体或细菌表达载体转化的植物细胞系统；或者动物细胞系统。优选地，用载体转化浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)以表达转谷氨酰胺酶。多肽本发明的另一目的是提供一种多肽，其包含由SEQ ID NO1所示的DNA分子编码的氨基酸序列。优选地，所述多肽包含SEQ IDNO2所示的氨基酸序列。
本发明的多肽可以大量提供。通过采用表达宿主，可根据常规方式分离和纯化蛋白质。可制备表达宿主的裂解物，并用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其它纯化技术纯化裂解物。纯化的蛋白质的纯度通常至少为80％，优选至少90％，并可达100％。纯化是指无其它蛋白质和细胞碎片。用途本发明的DNA分子可用于编码转谷氨酰胺酶。大量表达DNA分子以大量生产转谷氨酰胺酶。得到的转谷氨酰胺酶具有各种工业用途，包括胶凝蛋白质，改善面粉的烘烤品质，从蛋白质、脂肪和水生产糊状食品或食品成分，从浓缩乳中生产干酪，粘合碎肉或鱼制品，改善食品蛋白的口味和组织，在皮革加工中固定酪蛋白，擦鞋等。
下述实施例是举例性而非限制性。实施例1 拉达卡链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因A.拉达卡链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因的克隆(1)PCR扩增和纯化拉达卡链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因片段根据两个氨基酸片段FDEEKGF和KVKQGWP设计简并引物，这两个氨基酸片段是由Washizu等在1994年克隆的链轮丝菌菌种S-8112的转谷氨酰胺酶氨基酸序列(Washizu K.等，Biosci.Biotechnol.Biochem.58(1)82-7)中简并性最低的区域。两个简并引物为5’-aaaaacctgaaaccctt(ct)ga(ct)ga(ag)ga(ag)aa(ag)gg(gact)tt-3’，和5’-cttatcaacggatacggcca(gatc)cc(tc)tg(tc)tt(gact)ac(tc)tt-3’。
两个巢式引物为5’-aaaaacctgaaaccc-3’，和5’cttatcaacggatac-3’。
通过巢式PCR扩增茂原链轮丝菌CCRC 12165的转谷氨酰胺酶的部分片段，结果显示约650bp的一条DNA带，其相应于PCR产物的计算长度(644bp)。所得DNA序列示于图1(SEQ ID NO3)。茂原链轮丝菌CCRC12165见台湾新竹食品工业发展研究所(FIRDI)培养物寄存和研究中心的目录。(2)用茂原链轮丝菌的部分转谷氨酰胺酶基因片段作为探针探查拉达卡链轮丝菌的完整转谷氨酰胺酶基因用上述644bp DNA作为探针进行Southern印迹实验。在拉达卡链轮丝菌基因组的下列限制酶切片段中检测到信号8.4kb BamHIDNA，6kb BclI DNA，9kb NcoI DNA和7.5kb PstI DNA。拉达卡链轮丝菌见台湾新竹食品工业发展研究所(FIRDI)培养物寄存和研究中心的目录(登录号CCRC12422)。
为了纯化所述包含转谷氨酰胺酶基因的DNA片段，将拉达卡链轮丝菌基因组DNA用NcoI酶切并进行电泳分离。将纯化的9kbDNA插入用NcoI酶切的pMTL23载体中并转化大肠杆菌DH5α而形成DNA文库。再次使用上述644bp DNA作为探针进行菌落杂交实验，并选择包含拉达卡链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因的重组载体。由于所述NcoI片段太大而不能测序，克隆一包含转谷氨酰胺酶基因的3.2kb KpnI片段并插入pMT23载体上的KpnI酶切位点(形成pAE021)，随后进行测序。KpnI片段的3241个核苷酸序列示于图2。用GCG提供的密码优选软件分析所述序列，预计基因位于KpnI片段序列的约700-1900位核苷酸处(图2)。所述基因是拉达卡链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因。从上述核苷酸序列推导的氨基酸序列也示于图2，其由410个氨基酸组成，其分子量为45780.2道尔顿。预计拉达卡链轮丝菌的成熟转谷氨酰胺酶起自第80位氨基酸并由331个氨基酸组成(图2的下划线区)，其分子量为37922.3道尔顿，等电点为7.07。B.在浅青紫链霉菌中表达拉达卡链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因用BglI和BamHI酶切pAE021，纯化所得到的包含转谷氨酰胺酶基因的3.2kb DNA片段并将其插入pIJ702上的BglII酶切位点中，得到pAE051和pAE052(图3A和B)。在浅青紫链霉菌JT46中表达pAE052并每24小时测量上清中的转谷氨酰胺酶活性。在72小时，转化的克隆具有1.46U/ml的最大转谷氨酰胺酶活性(图4)。对胞外培养基进行的拉达卡链轮丝菌转谷氨酰胺酶特异性抗体分析检测到成熟的和未修饰或部分修饰的转谷氨酰胺酶，其分子量在45.8kD和38kD之间分布。上述结果表明浅青紫链霉菌JT46大量表达转谷氨酰胺酶。
序列表<110> 食品工业发展研究所<120> 拉达卡链轮丝菌的转谷氨酰胺酶基因及其编码的转谷氨酰胺酶<130> TKLEE885<160> 3<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 1233<212> DNA<213> 拉达卡链轮丝菌<220><221> CDS<222> (1)..(1230)<223><400> 1atg tcc caa cgc ggg aga act ctc gtc ttc gcc gct ctc ggt gcg gtc48Met Ser Gln Arg Gly Arg Thr Leu Val Phe Ala Ala Leu Gly Ala Val1 5 10 15atg tgc acc acc gcg tta atg ccg tcc gca ggc gcg gcc acc ggc agt96Met Cys Thr Thr Ala Leu Met Pro Ser Ala Gly Ala Ala Thr Gly Ser20 25 30ggc agt ggc agc ggc acc ggg gaa gag aag agg tcc tac gcc gaa acg144Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Glu Glu Lys Arg Ser Tyr Ala Glu Thr35 40 45cac cgc ctg acg gcg gat gac gtc gac gac atc aac gcg ctg aac gaa192His Arg Leu Thr Ala Asp Asp Val Asp Asp Ile Asn Ala Leu Asn Glu50 55 60agc gct ccg gcc gct tcg agc gcc ggt ccg tcc ttc cgg gcc ccc gac240Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp65 70 75 80tcc gac gag cgg gtg act cct ccc gcc gag ccg ctc gac cgg atg ccc288Ser Asp Glu Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro85 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1.一种分离和纯化的DNA分子，其包含编码转谷氨酰胺酶的序列，其中所述核酸在高度严格条件下与SEQ ID NO1所示序列或其互补序列杂交。
2.权利要求1的分离和纯化的DNA分子，其中所述DNA分子编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的转谷氨酰胺酶。
3.权利要求1的分离和纯化的DNA分子，其中所述DNA分子包含SEQ ID NO1所示序列。
4.包含权利要求1的DNA分子的表达载体。
5.权利要求4的表达载体，其包含权利要求2所述的DNA分子。
6.权利要求4的表达载体，其包含权利要求3所述的DNA分子。
7.包含权利要求4的载体的宿主细胞。
8.权利要求7的宿主细胞，其包含权利要求5的载体。
9.权利要求7的宿主细胞，其包含权利要求6的载体。
10.权利要求7的宿主细胞，其是浅青紫链霉菌。
11.一种多肽，其包含由SEQ ID NO1所示的DNA分子编码的氨基酸序列。
12.权利要求11的多肽，其包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
13.权利要求11的多肽，其用于胶凝蛋白质，改善面粉的烘烤品质，从蛋白质、脂肪和水生产糊状食品或食品成分，从浓缩乳中生产干酪，粘合碎肉或鱼制品，改善食品蛋白的口味和组织，在皮革加工中固定酪蛋白，擦鞋。
全文摘要
本发明提供了编码拉达卡链轮丝菌(Streptoverticilliumladakanum)的转谷氨酰胺酶的DNA分子，所编码的转谷氨酰胺酶以及所述转谷氨酰胺酶在工业工程中的应用。
文档编号C12N15/63GK1427078SQ0114372
公开日2003年7月2日 申请日期2001年12月18日 优先权日2001年12月18日
发明者林怡杏, 刘昌协, 朱文深 申请人:食品工业发展研究所