专利名称：体外组织的培养方法及其多孔隙载体的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种体外组织的培养方法及其多孔隙载体，其是将撷取的组织块置入中空多孔隙分解载体中，并供给养分使组织以三度空间方式向周围多孔隙基材的孔洞生长，以获得新生的组织。
近年来，随着生物科技的进步，生物、医用材料与组织细胞的培养技术已相互结合，逐渐发展出组织工程此一新的研究领域。希望未来，受损的组织或器官可经由组织工程的再造技术，在体外修补或重建一个新的组织或器官，替代受损的部位，以恢复病患的健康或延续病患的生命。
根据目前的组织工程技术的内容，需要撷取病患或捐赠者一小部分健康的组织，经体外大量培养组织细胞后，植入一可分解性的多孔隙基材，利用其三度空间架构，让组织细胞贴附并生长于其上，当组织细胞逐渐成长成为三度空间的组织块后，再植回病患所需修补的部位。从组织学的观点来看，一块组织除了含有其特定的组成细胞外，细胞与细胞间由三度空间的细胞外间质(extracellulamatrix，ECM)所包覆，此间质除了维持其细胞架构外，亦可表现该组织特定的功能。
以软骨组织的培养为例，目前体外的软骨三度空间培养，已证实软骨细胞于琼脂(agarosegel)中的三度空间培养，可维持其于组织中原有的细胞形态及功能，而经两度空间培养变异转化的软骨细胞，亦可在琼脂三度空间培养时，回复原有的软骨细胞形态。在模拟细胞外间质的架构方面，目前已开发出多种不同材料如胶原蛋白酶(collagen)或聚乳酸甘醇酸(poly(glycolicco-Lactic)acid(PLGA))及不同结构，如纤维网状或多孔隙的人工基材。目前面临最大的问题为1、组织细胞在两度空间的培养皿中大量培养时细胞，由于组织中的三度空间排列转为两度空间成长时，细胞将发生去分化(dedifferentiation)的现象，因而失去细胞于原来组织中的形态及功能。
2、此外，细胞的植入(seeding)亦是一项不易克服的问题，因为要提供细胞足够发展为组织的空间，多孔隙基材的孔径需大于细胞的尺径，当细胞与培养基混合液植入多孔隙基材时，细胞往往会自载体流出，不易保持于基材内，为克服此问题，目前的做法有两种一种是静态的植入法，先将所培养的细胞浓度调整至106cells/ml以上的高浓度，然后利用多孔隙基材本身的含水性，将所植入的细胞含于基材内，待细胞贴附于基材后，再加入大量的培养基进行培养，此方法虽然可以确知有多少量的细胞植入基材内，且可植入高浓度的细胞进入材料内，然而，细胞的分布还是会受到重力的因素所影响，导致上下层的细胞分布不均，此外，为防止细胞溢出，能与细胞混合的培养基的体积相当有限，因此贴附的效果及存活率亦需考量。
另一种为动态的细胞植入法，目前一般采用搅拌式反应器(spinnerflask)，以水流搅拌的方式将细胞自培养基带入基材内部，此方法可得到较佳的细胞贴附率及相较静态植入方式更均匀的细胞分布，然而，所要使用的细胞数较高，实际贴在材料内部的细胞数亦不易确知，而且细胞是由外而内植入，外围的细胞数还是会较内部的细胞密度为高，当组织培养时，外围的细胞生长速率较高将形成一层阻碍，阻止内部细胞的养分交换，从而导致材料内外细胞生长明显的不均。
本发明的主要目的是提供一种体外组织的培养方法，至少包含下列步骤提供一具有空腔的多孔隙载体；将组织块经酵素部分溶解；将经酵素部分溶解的组织块及溶解出的组织细胞置于前述多孔隙载体的空腔中；及将前述包含有组织块及组织细胞的多孔隙载体置于培养基中进行培养。克服组织在体外两度空间平面培养时发生去分化现象，或基材内外组织细胞生长不均等缺点，达到有效地培养体外组织的目的。
本发明的另一目的是提供一种体外组织的培养方法所使用的多孔隙载体，研制出一种多孔隙载体，其主要包含主体、至少一个位于主体内部且具有一开口的中空空腔及覆盖中空空腔开口的上盖，上盖是由与主体相同的多孔隙材料制成，组织块的粒径是大于载体空腔外围基材的孔径，达到避免组织块溢流出去的目的。
本发明的目的是这样实现的一种体外组织的培养方法，其特征是它至少包含下列步骤(1)提供一具有空腔的多孔隙载体；(2)将组织块经酵素部分溶解；(3)将经酵素部分溶解的组织块及溶解出的组织细胞置于该多孔隙载体的空腔中；(4)将该包含有组织块及组织细胞的多孔隙载体置于培养基中进行培养。
该多孔隙载体中具有至少一个放置组织块的中空空腔。该组织块的粒径是大于该载体空腔外围基材的孔径。该组织块的粒径为500至1000μm。该多孔隙载体的形状为圆柱形、立方体型或所需的任意形状。该多孔隙载体的孔径范围为50至500μm该多孔隙载体为生物可吸收性的高分子材料，该高分子材料选自下列的至少一种聚交酯酸、聚乳酸交酯酸、聚乳酸甘醇酸、聚酐、聚己内酯、聚二酮酯或聚正酯。该多孔隙载体为聚乳酸甘醇酸。该组织块为动物组织。该动物组织为软骨组织。该酵素为溶解蛋白酶或将组织块细胞溶解出来的酵素。该培养液为含胎牛血清的培养液。
本发明还提供一种体外组织的培养方法所使用的多孔隙载体，其特征是它包含一主体、至少一个以上的位于该主体内部且具有一开口的中空空腔及覆盖该中空空腔开口的上盖。
该主体为圆柱形、立方体型或所需的任意形状。该多孔隙载体的孔径范围是为50至500μm。该上盖是由与主体相同的多孔隙材料。
本发明的主要优点是可以最少体积的组织量，于最短的时间内于体外培养所需的组织。
下面结合较佳实施例和附图进一步说明。
图2是本发明的具有中空空腔的多孔隙载体的结构示意图。
图3是本发明的组织于具有中空空腔的多孔隙载体中的成长状态示意图。
图4是本发明的实验组的体外组织的培养方法的流程示意图。
图5是本发明的对照组的体外组织的培养方法的流程示意图。
图6是本发明的实验组的软骨组织培养两星期时，中空空腔载体填塞软骨组织周围的组织及细胞生长情形的照片。
图7是本发明实验组的软骨组织培养两星期时，载体空腔外围多孔隙基材的组织及细胞生长情形的照片。
图8是本发明的实验组的软骨组织培养四星期时，中空空腔载体填塞软骨组织周围及载体空腔外围多孔隙基材的组织及细胞生长情形的照片(放大40倍)。
图9是图8相同条件的照片(放大200倍)。
图10是本发明实施例的对照组的软骨组织培养四星期时，载体空腔外围多孔隙基材的组织及细胞生长情形的照片(放大40倍)。
图11是本发明实施例的对照组的软骨组织培养四星期时，载体空腔外围多孔隙基材的组织及细胞生长情形的照片(放大200倍)。
图12是比较本发明的实验组与对照组的软骨组织长入PLGA多孔隙载体中的横截面面积量化结果示意图。
参阅图2所示，是显示本发明多孔隙载体10，其主要包含一主体1；至少一个以上的中空空腔2，其是位于前述主体1内部且具有一开口5；及一上盖6，是作为覆盖上述中空空腔2开口5之用。
本发明的方法是直接撷取组织，并剪碎及酵素溶解表面细胞后，并不另外在体外先行放大培养，而是将组织块置入一多孔隙载体10的中空空腔中2，外围则是多孔隙的基材，之后，再将前述上盖6覆盖中空空腔2的开孔5，避免组织块流出。前述剪碎的组织碎片，经由过筛方式可控制其粒径大小，使其大于多孔隙载体10的中空空腔2外围基材的孔径。当组织块被填入多孔隙载体10的中空空腔2时，因外围基材的孔径小于组织块，因此，组织块将被限制于载体10内部而不会溢流出去。
参阅图3所示，多孔隙载体10内部(即中空空腔2)将含有经酵素溶解的高浓度细胞群及组织块4，由于多孔隙载体10内部的细胞浓度相当高，在培养过程中，组织细胞将由内向密度较低的外围多孔隙基材攀爬扩散生长，由内而外沿着其原本的组织块结构，以三度空间方式向外围多孔隙基材的孔洞3生长出新增的组织4′。此培养方法如同体外的组织培养，且是直接以组织形态来培养新的组织，相较于传统体外组织培养的方法，能解决在两度空间培养造成的去分化现象，亦可以最少的组织量于短时间内于体外进行组织培养。
前述组织块4可为任何动物组织，例如软骨组织或硬骨组织。
前述组织块4的粒径是为500至1000μm。
前述的多孔隙载体10的形状可依实际需要任意变化，例如圆柱形、立方体型或任意形状。
前述的多孔隙载体10是为可吸收性的高分子材料，此材料是选自下列群组聚交酯酸(polyglycolicacid；PGA)、聚乳酸交酯酸(polylacticacid；PLA)、聚乳酸甘醇酸(poly(glycolicco-Lactic)acid；PLGA)、聚酐(polyanhydrides)、聚己内酯(polycapralactone)、聚二酮酯(polydioxanone)及聚正酯(polyorthoester)；其中较佳的多孔隙载体材料为聚乳酸甘醇酸(PLGA)。
前述的上盖6是由与主体相同的多孔隙材料制成。
前述的多孔隙载体10的孔径范围是为50至500μm。
下面通过体外软骨组织的培养的实施例对本发明的方法作更详细的说明。
实施例一种体外软骨组织的培养方法(1)制备具有中空空腔2的生物可吸收性多孔隙载体10
本实施例中所选用的可分解性高分子材料是以开环聚合方式制备得到的PLGA高分子(分子量约为200,000)。将块状的PLGA高分子材料于粉碎机中粉碎，粉碎的颗粒通过60-80孔目的筛网过筛后可得到粒径在177-250μm的高分子颗粒；选用的添加入基材中创造孔洞结构的水溶性材料是粒径250μm左右的氯化钠颗粒；选用的溶解高分子颗粒的有机溶剂是为丙酮。
PLGA高分子颗粒与氯化钠颗粒依10/90的重量比，以搅拌的方式均匀混合；混合后的PLGA高分子颗粒与氯化钠颗粒倒入一下端接有抽气装置、直径为7mm圆形的过滤器中并压实，此时将有机溶剂丙酮倒入混合颗粒中并浸润，其后打开抽气阀产生一负压向下抽去多余的溶剂，并使表面已溶化的高分子颗粒相互粘结。高分子颗粒相互粘结后，于过滤器上方倒入大量的去离子水，同时并打开抽气阀抽气，将大量的水通过材料中，析出并固化高分子颗粒，同时将其内部的氯化钠颗粒水洗出来。固化后的高分子从过滤器中取出，置于装有去离子水的大烧杯中，于室温下每6小时换水一次，以搅拌的方式浸泡水洗24小时，将内部残留的溶剂及盐粒洗出，再置于50℃的真空烘箱加热乾燥24小时，即可得到一孔径分布在150至350μm之间，孔隙率约90vol％，孔洞为相互连通的多孔隙基材。
本实施例所制备的具有中空空腔2的多孔隙载体10，是以手术刀裁切直径为7mm，高度为9mm的圆柱体，于基材内部挖一直径为3mm深度为6mm的中空圆腔，再裁切一直径为3mm，高度为3mm的圆柱体塞子(即图2所示的上盖6)，可在组织块填入时，以封住内部的中空空腔2。中空的多孔隙载体10制备完成后，以75％的酒精浸泡消毒6小时，并以大量无菌的磷酸缓冲盐(phosphatebufferedsaline，PBS)溶液置换内含消毒的酒精。
(2)实验组的处理如图4所示的流程图，首先，软骨组织是以显微器械取出新生约2至4天的大白鼠11的大腿骨12，去除表面的肌肉及骨膜，浸于没有加胎牛血清(fetalcalfserum，FCS)的DMEM中，于细胞培养的操作台(laminarflow)中将大腿骨12取出，置于15ml的离心管13中，加入10ml的磷酸缓冲盐溶液予以清洗，重复两次。将大腿骨12清洗后，倒于10cm的培养皿中，以灭过菌的组织剪将关节软骨分离并剪碎，组织块4碎片大小以20-40孔目的筛网控制在400-800μm之间。剪碎的碎片收集于15ml的离心管中，再倒入10ml的磷酸缓冲盐溶液冲洗，重复三次。冲洗后的软骨组织块4碎片，将磷酸缓冲盐溶液清除，再加入溶解蛋白酶(collagenase)5ml(1mg/ml磷酸缓冲盐溶液)，置于37℃的培养箱中，静置2小时，将表面的软骨细胞予以游离出来。之后，以溶解蛋白酶分离溶解过后的软骨骨块，置于离心机中，以转速1500r.p.m.离心5分钟，将溶解蛋白酶与软骨块加以分离。离心后，吸取澄清的溶解蛋白酶上清液，余留的碎片及细胞组织以磷酸缓冲盐冲洗两次，离心两次，以除去残留的溶解蛋白酶。洗净后的软骨块及组织细胞，将其填入体积0.02ml的多孔隙载体10的中空空腔2中，并盖上多孔隙载体的上盖6，以防止软骨块流失。
(3)对照组的处理如图5所示的流程图，首先，对照组是采用相同的培养方式，同样取自上述大腿骨12的软骨，并以同样的方法将软骨剥离及剪碎，软骨经剪碎后置于培养皿8，且浸泡于溶解蛋白酶5ml(1mg/ml磷酸缓冲盐溶液)及玻糖醛酸(Hyaluronidase)中，于37℃的培养箱(图未显示)中静置24小时，将所有的软骨细胞予以游离出来。通常1ml体积的软骨约有1.5x107个软骨细胞，相对于多孔隙载体10中空空腔2体积0.02ml，对照组所要加入的软骨细胞量为3x105个软骨细胞。要加入的细胞经离心机离心后，以细胞计数盘予以计数，计数后的细胞由上端加入多孔隙载体10中空空腔2中(所加入的细胞溶液体积为200μl)，为防止细胞流出，再盖上上盖6并置于培养皿中8，于含饱和水气的37℃培养箱中静置6小时使加入的细胞贴附。
(4)实验组及对照组的共同处理实验组及对照组的组织细胞添加入多孔隙载体10后，将含有组织细胞的载体10放入含有细胞培养液的旋转式培养器(spinnerflask)7中，如图4及图5所示的最后一个步骤。细胞培养液为含10％wt胎牛血清的DMEM培养液，每个载体的养分为3ml/天，依照培养的时间定期置换新鲜的培养液，培养环境为含5％二氧化碳37℃的培养箱。培养后于不同的培养时间将多孔隙载体10从反应器中取出，先以磷酸缓冲盐溶液予以冲洗的，然后浸于含4％福尔马林的磷酸缓冲盐溶液中将试片加以固定，以石蜡组织包埋的方式切片，再以苏木紫-伊红的方法染色，并观察其软骨组织成长的结果。
(5)实验结果以实验组的方法培养两星期的结果如图6、图7所示，可看出在载体中空空腔周围孔洞有新生的软骨组织9，直接以组织的型态从植入的软骨块周围向外围孔洞生长，如图6所示，载体其他部位的孔洞亦可观察到由中心向外扩散长满了细胞，如图7所示。
图8、图9为培养四星期后的实验结果，可以发现载体中除了中空空腔外围的孔洞外，其他部位的孔洞亦长出许多新生软骨组织9，如图8所示，以较高的倍率可观察到软骨组织中有许多软骨细胞腔隙(lacunae)，如图9所示，其腔隙中的软骨细胞已开始分裂成长形成同源细胞群，显示所形成的软骨为一相当活跃的新生软骨组织，而在软骨组织周围亦环绕着许多扁平的成软骨细胞(chondroblast)，此软骨组织将可持续扩大成长。
图10及图11是显示以对照组方法所培养的结果，于培养四星期时，PLGA中空空腔载体的多孔隙孔洞中以长满了细胞，如图10所示，以更高的倍率观察可发现，新生的细胞型态还是纺锤状的纤维软骨细胞，并没有形成软骨组织如图11所示。
图12是以显微组织影像软体分析计算实验组及对照组中，多孔隙载体外围孔洞中所形成的软骨组织所占的面积。由图12的结果可得知以本发明的方法所培养的软骨组织于四星期时可填充约26％的孔洞面积，相较于对照组的结果有明显的差异，显示以本发明的培养方法可以在短时间内于体外长出多量的新生软骨。
本发明的功效本发明的体外组织的培养方法，主要是将组织块置入一具有中空空腔的多孔隙载体的空腔中，使组织以三度空间方式由内向外围的多孔隙载体的孔洞生长，直接以组织的形态增生出新的组织。此方法可以最少体积的组织量，于最短的时间内于体外接培养所需的组织。此技术的突破将使体外组织培养由过去利用培养细胞来形成组织，再转进到直接以组织来培养组织，对未来将形成的组织工程产业提供一更快速和有效的培养技术。
权利要求
1.一种体外组织的培养方法，其特征是它至少包含下列步骤(1)提供一具有空腔的多孔隙载体；(2)将组织块经酵素部分溶解；(3)将经酵素部分溶解的组织块及溶解出的组织细胞置于该多孔隙载体的空腔中；(4)将该包含有组织块及组织细胞的多孔隙载体置于培养基中进行培养。
2.根据权利要求1所述的体外组织的培养方法，其特征是该多孔隙载体中具有至少一个放置组织块的中空空腔。
3.根据权利要求1所述的体外组织的培养方法，其特征是该组织块的粒径是大于该载体空腔外围基材的孔径。
4.根据权利要求1所述的体外组织的培养方法，其特征是该组织块的粒径为500至1000μm。
5.根据权利要求1所述的体外组织的培养方法，其特征是该多孔隙载体的形状为圆柱形、立方体型或所需的任意形状。
6.根据权利要求1所述的体外组织的培养方法，其特征是该多孔隙载体的孔径范围为50至500μm。
7.根据权利要求1所述的体外组织的培养方法，其特征是该多孔隙载体为生物可吸收性的高分子材料，该高分子材料选自下列的至少一种聚交酯酸、聚乳酸交酯酸、聚乳酸甘醇酸、聚酐、聚己内酯、聚二酮酯或聚正酯。
8.根据权利要求7所述的体外组织的培养方法，其特征是该多孔隙载体为聚乳酸甘醇酸。
9.根据权利要求1所述的体外组织的培养方法，其特征是该组织块为动物组织。
10.根据权利要求9所述的体外组织的培养方法，其特征是该动物组织为软骨组织或硬骨组织。
11.根据权利要求1所述的体外组织的培养方法，其特征是该酵素为溶解蛋白酶或将组织块细胞溶解出来的酵素。
12.根据权利要求1所述的体外组织的培养方法，其特征是该培养液为含胎牛血清的培养液。
13.一种权利要求1所述的体外组织的培养方法所使用的多孔隙载体，其特征是它包含一主体、至少一个以上的位于该主体内部且具有一开口的中空空腔及覆盖该中空空腔开口的上盖。
14.根据权利要求13所述的体外组织的培养方法所使用的多孔隙载体，其特征是该主体为圆柱形、立方体型或所需的任意形状。
15.根据权利要求13所述的体外组织的培养方法所使用的多孔隙载体，其特征是该多孔隙载体的孔径范围是为50至500μm。
16.根据权利要求13所述的体外组织的培养方法所使用的多孔隙载体，其特征是该多孔隙载体是生物可吸收性的高分子材料，该高分子材料选自下列的至少一种聚交酯酸、聚乳酸交酯酸、聚乳酸甘醇酸、聚酐、聚己内酯、聚二酮酯或聚正酯。
17.根据权利要求16所述的体外组织的培养方法所使用的多孔隙载体，其特征是该多孔隙载体是聚乳酸甘醇酸。
18.根据权利要求13所述的体外组织的培养方法所使用的多孔隙载体，其特征是该上盖是由与主体相同的多孔隙材料。
全文摘要
一种体外组织的培养方法及其多孔隙载体，主要是将组织块经酵素部分溶解后，置入一具有中空空腔的多孔隙载体的空腔中，使组织以三度空间方式由内向外围的多孔隙载体的孔洞生长，直接以组织的形态增生出新的组织。具有以最少体积的组织量，于最短的时间内在体外培养所需的组织的功效。
文档编号C12N5/08GK1428418SQ01144738
公开日2003年7月9日 申请日期2001年12月24日 优先权日2001年12月24日
发明者廖俊仁, 林玉如, 陈进富, 张根源, 江淑芳 申请人:财团法人工业技术研究院