微载体的编码的制作方法

专利名称：微载体的编码的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码的微载体，更明确而言是写有密码的微载体。在此文件述及写在微载体‘上’的密码时包括了写在微载体表面的密码以及写在微载体内深处的密码。此发明还涉及在微载体上写密码的方法，读密码的方法，以及使用编码的微载体的方法。优选的编码微载体的方法包括将载有可漂白物质的微载体暴露于高空间分辨率光源下使微载体上的密码漂白。编码的微载体可用作，譬如，化学和生物测定与合成中的支持物。
相关技术的描述在化学和生物学技术中对药物的发现和筛选通常包括在极大数量的化合物或分子中进行测定。这些测定通常包括筛选化学文库寻找关注的化合物，在测试样品中筛选特定的靶分子，以及广泛地测试所关注的分子间的化学和生物学反应。上述测定常需要进行几千次个别的化学或生物学反应。例如，一种发现药物的测定可能包括对一特定靶分析物测试成千的化合物。被观察到的能与靶分析物起反应、结合或相互作用的任何化合物都可能有希望具有多数量的用途，只要所观察的相互作用被认为是有意义的。
上述测定需要操作大量的个别反应，在此过程中存在许多实际问题。可能最重要的问题是必须标记和跟踪每一个反应。例如，只在一组数千个反应中的一个观察到了所关注的反应，研究者必须能够确定在数千个起始化合物或分子中是哪一个产生了这个反应。
跟踪各个反应的一个通常方法是将每一个反应分置于各个反应器皿中，排成高密度的列阵，并记录每一个反应皿中使用的是哪种反应物。这样，例如，当有一个关注的反应被观察到是在1000个皿中标记为5号的皿中时，研究者可查看皿中所用反应物的记录，根据皿5的记录可以知道是什么反应物产生了这种反应。上文所述的高密度列阵的例子有384-，864-，1,536-，3,456-，和9,600-孔的微滴定板容器，微滴定板的每一孔构成一个微小的反应皿。使用微小的反应孔因为它们保存空间，且节省测定所用试剂的费用。
然而在化学和生物学测定中使用微滴定板容器有许多缺点。例如，使用滴定板需要小心地分隔开极大量的各个反应皿，而不让所有的反应自由地、通常更方便地在一个反应器中发生。而且，对反应体积在空间上分隔开的要求伴有对所用微滴定板体积的物理学的限制，从而也限制了板上所能进行的不同反应的数量。
根据上文所述使用微滴定板中的限制，在高通过量测定中曾努力发展跟踪个别反应的其它方法。这些方法放弃了对各反应进行空间分隔的想法，而用其它方法跟踪个别反应。例如，建立了以微载体为支持物进行高通过量测定和反应的方法。每一个微载体可有一个结合于其表面的特定配体，起反应物的作用，同时此微载体还可包含一个‘密码’，用以鉴别此微载体，从而也鉴别了结合于其表面的独特配体。用上述这些方法得以进行‘随机处理’，即数千个独特编码的微载体，每一个的表面都结合有一个配体，可以混合在一起并同时进行一种测定。对结合配体与靶分析物之间表现出所关注的良好反应的那些配体，可以读出其编码，从而鉴定出产生良好反应的配体。
实施上述随机处理要求对每个微载体分别进行精确的编码，并要求精确地、前后一致地鉴定代码。因为采用随机处理的测定结果高度依赖于微载体的编码，测定的质量很大程度上取决于微载体上代码的质量和可读性。编码微载体的企图仍限于差异显色(Dye-Trak微球)，荧光标记(Fluorospheres；Nu-flow)，所谓的远隔编程带存储器的型板(IRORI；U.S.专利No.5,751,629)，可去除标签如寡核苷酸和小肽(U.S.专利No.5,565,324；U.S.专利No.5,721,099；U.S.专利No.5,789,172)，以及载有脉冲转发器的固相颗粒(U.S.专利No.5,736,332)。上述专利的内容在此引入作为参考。
上述编码微载体的已知方法各有缺点。例如，只是在大小、形状、颜色、荧光强度、或其组合上有差异的微载体常常不能由这些变数提供足够的独特的可读组合，以产生适应极大量的不同分子测定所必需的大量独特代码。此外，以表面所载外来物为代码的任何微载体，譬如载有可去除标签或荧光标记，都有一定危险，即附加的部分可能会干扰微载体上配体结合分子与该测定中分析物的结合或反应。在将表现出良好反应的有意义的微载体分离出来后，用可去除标签编码的微载体还须加用切割和分析标签的步骤最终鉴定微载体上产生良好反应的配体。这种切割步骤当然增加了测定实验结果必需的时间和人力。
根据上述，在此领域中仍需要一些能在大量的其它方面相同的微载体中鉴定一种微载体的简单途径，特别是不需在微载体表面接上外来物而可编码更大量独特代码的途径。
发明概述本发明的一个目的是提供一种编码微载体，它不需要在微载体表面接上外来物作为代码。本发明的另一目的是提供一种编码微载体的方法，它可提供实际上有无限可能变化种类的、在微载体上可读写的独特代码。
本发明为实现上述目标提供写有代码的微载体。优选的微载体是含有可漂白物质，如荧光分子的微载体。优选的编码微载体的方法包括将载有可漂白物质的微载体暴露于高空间分辨率光源下，使微载体的代码退色。此方法优选地包括在荧光微载体上漂白代码，漂白作用在代码的漂白区生成相同或不同水平的荧光强度。更优选的编码微载体的方法是将代码写在微载体内深处。
在另一个优选实施方案中，大量的化合物或生物分子结合在相应大量的本发明的微载体上，微载体结合的配体按扫描或测定方案混合并同时进行反应，那些起反应的配体可通过读出与其结合的微载体的代码得到鉴定。
采用本发明的编码微球可以在单一的反应器中用一份样品同时对大量的分析物进行分析。因此，在高通过量测定和反应中使用本发明的微载体比使用常规的微滴定板技术要优越得多。
本发明的微载体还提供了实际上无限数量的可在微球上读写的代码，因此优于已知的用颜色或荧光标签编码的微载体，后者的编码数量可能要有限得多。本发明的微载体还优于以连接在表面的部分作为编码的微载体。因为本发明的微载体上所写的代码不会有干扰发生在微载体表面的分析物配体间反应的危险，而那些已知微载体有这种潜在危险。
本发明的其它特征和优点陈述于以下的描述中，部分地可从描述中明了或通过本发明的实施而熟悉。通过编码的微载体及在书面的描述和权利要求中详细指出的方法会领悟和掌握本发明的优点。前文的概述和下文对本发明的详述都只是示例和说明，而不是对发明的权利要求的限定。
附图简述

图1说明常规显微光解和SCAMP的多种原理。
图2a和2b说明使用不同强度的条码和环码，每种强度用图中的不同颜色指示。
图3a和3b说明一个FD148-dex-ma微球在对其表面下约10μm处一3μm条纹进行漂白前(上)和漂白后(下)中间平面的共聚焦影象。
图4说明148-dex-ma微球中FD148的荧光恢复曲线(A)和用浸入FITC而载有FITC的dex-ma微球中FITC的荧光恢复曲线(B)。
图5说明一个FD148-dex-ma微球在用SCAMP漂白一任意几何形状后中间平面的共聚焦影象。
图6a和6b说明一个45-μmFITC标记胶乳珠在漂白一个条码(图6a)和条码加数字(图6b)后一小时的中间平面共聚焦影象。
图7说明一个45-μmFITC标记胶乳珠在漂白代码R1247后一小时的中间平面共聚焦影象。
图8说明一个45-μmFITC标记胶乳珠在漂白Ghent大学标识后一小时的中间平面共聚焦影象。
图9说明一个45-μmFITC标记胶乳珠在漂白Tibotec公司标识后一小时的中间平面共聚焦影象。
图10a说明漂白至不同强度的代码的共聚焦影象，图10b至10d以绘图说明代码内的不同强度。
图11a和12a漂白至不同强度的代码的共聚焦影象，图11b和12b以绘图说明各代码内的不同强度。
发明详述在一实施方案中，本发明涉及在上面写有代码的微载体。本发明的微载体可由，例如，在高通过量筛选技术和诊断学中常规使用的任何材料制成。例如，微载体可由固体，半固体，或固体和半固体的组合制成，这些材料的非限定例子包括胶乳，聚苯乙烯，交联葡聚糖，甲基苯乙烯，聚碳酸酯，聚丙烯，纤维素，聚丙烯酰胺，和二甲基丙烯酰胺。优选材料包括乳胶，聚苯乙烯和交联葡聚糖。微载体也可以是原核或真核细胞。
微载体可以具有任何形状和大小，只要适合微载体的编码和使用。例如，微载体可以是球形，或不一定是球形的小珠。微载体可以是，譬如，园柱形或椭园形。球形微载体的直径可以是，譬如，1～200μm。
写在微载体上的代码可以是能在微载体上写、读的任何几何形状、设计或符号。例如，代码可写作数码或字母，或符号、图形形式的代码，条形码，环形码，或三维码。环码与条码相似，只是使用同心园代替直线。一个环可以包含，例如，一个条所包含的同样信息。代码可以写在微载体的表面或微载体内深处。例如，代码可以写在微载体内深处，特别是微载体的中心平面上。根据微载体的形状不同，中心平面可能是写代码的优选位置，因为它可以提供出写码的最大表面面积。而且，对于具有弯曲表面的微载体，将代码写在内部深处比写在弯曲的表面上可能更为有利。因为在一个平面上写、读代码往往比在弯曲表面上更为方便。
本发明的微载体可以包含一种可漂白物质，微载体上的代码可以是在微载体的可漂白部分内漂白了的图型。微载体可在表面或微载体内含有可漂白物质。在本申请中任何提及在微载体“上”对物质漂白包括在微载体表面的漂白以及在微载体内深处的漂白。优选的可漂白物质包括可漂白的荧光物质或吸收电磁辐射的物质。微载体可包含可漂白的发光体。能使用的发光体的例子包括荧光体，磷光体，或闪烁体。可漂白的化学发光体，生物发光体，或有色物质均可使用。可漂白物质可以是，特别是，异硫氰酸荧光素(“FITC”)，藻红素，香豆素，荧光黄，和若丹明。应当选择这样的可漂白物质，即当漂白作用发生时，在使用微载体及读取代码所必需的时间内，代码仍保留在微载体上。因此，在保持代码有用的时间内，一定量的未漂白分子扩散到漂白区中是可以允许的。
微载体上被漂白的代码也可以用不同强度的荧光或颜色写在微载体的漂白区内。例如，一种漂白编码可以包含数种不同程度的漂白作用，因而在漂白区整体内具有数种不同的荧光强度。因此，微载体可以不仅按微载体上被漂白的几何图型来编码，还可以用图型内不同荧光强度来编码。
在另一实施方案中，本发明涉及在微载体上写码的方法。此方法可用于在微载体的表面上写码或在微载体内深处写码。在微载体上写码可以使用，例如，高空间分辨率的光源，例如激光器，灯，或能发射X线，α与β线，离子束，或任一形式的电磁辐射的源。也可用光变色或化学蚀刻将代码写在微载体上。优选的写码方法是使用高空间分辨率光源，特别是激光器或灯与共聚焦显微镜联合使用。另一优选的写码方法是使微载上可漂白物质中的代码退色。本方法中优选的可漂白物质包括上文描述微载体时提到的那些物质，并包括荧光分子。关于微载体内可被漂白的材料的体积，有一个例子的体积是在微载体的1nm3至8mm3之间。
在微载体上写码的一个优选方法是使用扫描显微光解(SCAMP)，SCAMP的技术特征由P.Wedekind等首次描述于“扫描显微光解一种基于对扫描激光束和共聚焦成象作快速强度调制的新的光漂白技术“一文，见Journal of Microscopy，Vol.176，pp.23-32(1994)，其内容在此引入作为参考。上文公布了用SCAMP在指甲油的薄荧光层内漂白并使图型显现。该文没有提出将SCAMP用于编码微载体。
我们使用SCAMP通过使微载体内荧光分子漂白而在微载体上写码。光漂白是众所周知的一种颜色消褪现象，它是由于一定波长的光照在某种色素上，会引起色素分子共振而最终崩解。这也是为什么荧光分子受强有力的特定波长的激光束激发后常倾向于退色的原因。
荧光显微光解技术(“MP”)，也称作光漂白后的荧光恢复(“FRAP”)，多年来用于研究荧光分子在生物介质，如细胞和组织，及非生物介质中的迁移率。Reters与Scholtz，“荧光光漂白技术”，见New Techniques of optical Microscopy and Miero-spectroscopy，R.J.Cherry(ed)，MeMillan，New York，pp.199-228(1991)；De Smedt等；“用探针扩散试验研究透明质酸溶液的结构信息”，Maeromolecules，Vol.27，pp.141-146(1994)；De Smedt等；“用共聚焦扫描激光显微镜研究大分子在乙丁烯酸葡聚糖溶液和凝胶中的扩散”，Macromolecales，Vol 30，pp.4863-3870(1997)。
荧光分子的迁移率可藉在光束聚焦区内移动的荧光分子的退色(光解)来测量，这种光束可以是，特别是，一种激光束(图1A，B)。在一短暂的漂白过程，通常约10毫秒，之后，用高度衰减的激光束测量光漂白区中荧光的恢复，这种恢复是由于周围未漂白区域的荧光分子向漂白区扩散而引起的(图1B，C)。特征性的扩散时间，扩散系数的一种计量，以及不移动的和移动的荧光分子的分数可从漂白区的荧光恢复推导得出(图1D)。
移动部分R定义为R=F(∞)-F(o)F(i)-F(o),]]>式中(i)是漂白作用前漂白斑的荧光强度，F(o)是漂白作用后即刻漂白斑的荧光强度，而F(∞)是漂白作用长时间后漂白斑的荧光强度。
使用普通(非扫描)光学显微镜的光漂白实验中，不变的(激光)光束在漂白过程以及恢复时期都聚焦在样品上。在漂白过程中(激光)光束的固定位置产生一个具有园形几何形状的光漂白区。虽然非扫描光学显微镜技术上产生的受照区直径为2μm或更小，但由于不变的激光束常发生漂白斑的扩大。这就形成一个大的园形漂白斑，通常直径为10μm-20μm，如图1B-II所示。
采用激光扫描显微镜为显微光解方法开创了新的机会。将光解、光束扫描和共聚焦显微镜相结合，产生了SCAMP。SCAMP方法的，在扫描样品时采用一种声-光调制器(“AOM”)那样的强度调制装置，使激光强度在低检测水平与光漂白的高强度水平间在小于1微秒的时间内转换而发生漂白作用。将扫描中的漂白作用与使用AOM相结合，后者产生极短的漂白脉冲，这就使得在普通显微光解中由于较长的光漂白时间和不变的激光束引起的漂白斑扩大现象得到防止，SCAMP能使样品的漂白斑小于1微米。
图1说明SCAMP如何测量荧光分子的迁移率。首先，在样品中所关注平面上对一条X线上的荧光通过扫描进行测量(图1A-点线)。其次，将此X线上的一小节段(如3μm)，即要用来研究扩散的一段，选定进行漂白(图1B-I)。节段的长度，位置以及数量都可用SCAMP软件自由选择。当激光束扫描过此节段，并伴有激光束强度的短暂增强的时候，此节段发生光漂白。激光束的光漂白强度和监测强度水平间的比值，典型地是大于100。
当SCAMP采用共聚焦显微镜时，不仅可以测量样品表面的荧光，而且还可测量样品任意深度的荧光，而几乎不受样品中来自焦点外水平的散射的干扰(如在普通显微镜中遇到的)。相反，在采用荧光灯照明并使用普通(非聚焦)显微镜时，典型地只有珠的表面得到观察。因此在内部深入的编码用一台普通显微镜通常难以观察，而用共聚焦镜则可看得很好。显微镜的共聚焦和扫描两个特征使得能在微载体的明确限定的位置中进行微小区域的光解和读出。此发明与本领域中迄今为止所描述的所有其它应用都明显不同，例如，采用SCAMP的高空间分辨率能够在微球内特定的深度上作不可逆的标记，并用共聚焦技术读出此编码。
本发明在微载体上写码的方法也可包括对微载体漂白，使代码中漂白了的物质产生不同强度水平。除了以代码本身的图形传递信息外，还可以用漂白图型内的不同强度传递信息。以不同强度编码微载体的能力可允许微载体上用较小的代码，从而节省空间，但仍能传递同样数量或更多的独特特征去编码微载体。例如，可根据本发明在微珠中漂白成四种不同的强度。这可藉多种途径实现，例如，反复地漂白微珠的某些部分，或将不同水平的声功率散送入AOM，生成多种不同的激光功率，根据用于代码每部分激光功率不同的而生成具有不同强度的漂白图形。图2a与2b是用不同强度漂白的代码的两个例子，一个是条型的，另一个是环型的，在图中代码中的不同强度以不同颜色表示。不同水平的强度还可以与编码成分的不同宽度相结合，譬如条码中的条纹。
本发明的另一实施方案涉及在本发明的编码微球上读出代码。读代码可以用一台普通显微镜进行，如果代码是在微载体的表面，或者代码在微载体内深处但微载体充分透明。读代码也可用共聚焦显微镜进行。特别是，读码可藉助将微载体悬浮于水环境中，将微载体置于两块玻璃载片间，或置于毛细管中，然后通过显微镜或共聚焦显微镜观察代码。
本发明的另一实施方案涉及本发明编码的微球的应用方法。微载体可用作测量生物分子相互作用的支持物，用于药物发现，受体结合测定，治疗学，医学诊断，组合化学，靶分子的分离和纯化，为分析目的捕获和检出大分子，选择性去除污染物，酶催化，化学修饰，杂交反应以及法学应用。
微载体可优选地作为化学和生物学测定及合成的支持物。在这种能力方面，微载体可含有一个或更多的配体，结合在微载体表面。结合有配体的微载体可与靶分析物接触，确定是否存在特定的所关注的分析物，或可作为在微载体结合配体上发生组合化学反应的支持物。与微载体结合的配体的靶分析物的例子包括抗原，抗体，受体，半抗原，酶，蛋白，肽，核酸，药物，激素，病原体，毒素，或任何其它感兴趣的化合物或分子。一种微载体结合的配体究竟是否与靶分析物结合或发生反应，可用领域中所使用的进行该项测定的常规技术测定。例如，可用发光反应指示反应，还可用颜色反应，化学发光反应，或荧光反应来指示反应。与微载体结合的所关注的配体可设计成这样当它所靶向的有意义的分析物存在时，微球的光学记号就发生改变。例如，当配体与分析物结合或相互作用时发生光化学反应便可引起这种光学记号的改变。这时微载体便可置于显微镜下观察，以检出光化学反应所伴有的荧光。
很大范围的化学和生物学官能基团可被附加为本发明微载体的配体。这些官能基团包括在高通过量扫描技术和诊断中常规使用的一切官能基团。将配体结合在微载体上可采用通常将配体结合在微载体的一般方法，包括共价结合，直接附加或经过一个接头而附加。而且，微载体还可用各种途径而功能化，而得以附加上一个原初反应物。
本发明的微载体可用于检测样品中一个或更多的靶分析物的存在或缺如的方法，包括将微载体结合的配体与至少一个分析物相接触，检测分析物是否与配体相作用或结合，并读出发生了反应或结合的任一微载体的代码。
更明确而言，本发明涉及检测样品中一种或更多靶分析物的存在或缺如的方法，包括选择一种或一种以上能与一种或更多的分析物相结合或起反应的配体，将配体与本发明的众微载体相结合，建立配体特性与联结配体的微载体代码间的关联，将一种或一种以上的分析物与结合配体的微载体相接触，观察在哪些微载上分析物已与微载体结合的配体相结合或起反应，以及读出微载体的代码以鉴定与一种或一种以上的分析物已发生反应的配体，从而确定一种或一种以上的分析物的存在或缺如。
上述方法的一个优选实施方案中靶分析物是核酸，具体而言是DNA或RNA，其中至少一个微载体结合配体是该核酸的互补体。这样本发明的微载体便可用于DNA杂交。微载体也能用于酶学测定和免疫测定。微载体还可用于筛选择品中某些化合物的测定，同时从这些样品中检出和分离出化合物。微载体还可用作建立组合化学文库及其反应成分的支持物。
本发明的微载体还可应用于对大量组分进行有效而迅速筛选的方法和装置，方法中具有多样性的是与微载体结合的配体及可溶性的分析物组分，或二者之一，人们感兴趣的是要确定两种组分间发生的相互反应。这类装置包含一个微列阵，譬如，一个固体支撑物，其结合配体已按预先登记的位置而排列，还包含检测组分间相互反应的读数器。此方法可包括制备微列阵，例如连接配体所需的固体支撑物，然后使配体与分析物结合以实现组分间的相互反应，随后再确定组分间相互作用的存在及具体位置。
微列阵通常包含多份的不同组分。理论上只需要一个组分，但可能多达105。在组分数量通常不超过105时，单独编码的微载体数量可能要大得多。
结合的配体可以是，譬如，有机物，如一个单一分子或分子的集合物，配体和受体，核酸结合成分，RNA，单链和双链结合蛋白，这里不需要有一个结合的配体连接在核酸，寡核苷酸，蛋白质上。
微列阵中的编码微载体可排成轨迹。“头”用于确定位置，因而具体的反应可被迅速测出。具体而言，园盘具有环形轨迹，带有“头”可确定轨迹上的位置，因而阳性信号可根据“头”提供的信息得到解释。环形轨迹优选为同心的，横戴面在5～5000μm范围内。可以做各种修饰，例如预制节段，可以与园盘连接用于测定。
以下例子进一步对本发明进行说明，进一步教授本领域的普通技术人员如何去实地应用此发明。以下例子仅仅是对本发明的说明，并公布本发明一些实施方案的各种有益的特性。以下例子不应被解释为对本发明权利要求的限制。例1葡聚糖-甲基丙烯酸(“dex-ma”)，用于制备dex-ma微球，其合成与特性描述详见于W.N.E.Van Dijk-Wolthius等，“葡聚糖与甲基丙烯酸缩水甘油的反应一种意外的转酯作用”，Macromolecules，Vol 30，pp.3411～3413(1997)，其公开内容在此引入作为参考。Dex-ma微球用N，N，N’，N’-四甲撑-乙二胺和过硫酸钾，由dex-ma/聚乙二醇乳剂，藉游离基聚合反应制备。见stenekes等，“在全水系统中制备葡聚糖微球配方参数对颗粒特征的影响”，Pharmaceutical Research，vol.15，pp.557-561(1998)，其公开内容在此引入作为参考。dex-ma溶液的浓度(在pH7的磷酸盐缓冲液中)为10％(w/w)。dex-ma的取代度，即每100吡喃葡糖苷单位的甲基丙烯酸酯分子数，为4。PEG溶液在pH7磷酸盐缓冲液中的浓度为24％w/w，PEG的平均分子量为10,000g/mol(Merck)。一批微球(FD148-dex-ma微球)是在有异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(分子量148.000g/mol)存在的条件下制备的。第二批微球上所荷的异硫氰酸荧光素(“FITC”)则是在完成dex-ma微球的制备后，将其浸入FITC溶液(0.01mg/ml于pH7.2的磷酸盐缓冲液中)而得到的。FD148及FITC二者都自Sigma获得。SCAMP实验用这两批微球如例2所述的方法进行。例2SCAMP安装在Sio-Rad MRC 1024共聚焦激光扫描显微镜上，参照文献Wedekind等，“扫描显微光解基于对扫描激光束的快速强度调制和共聚焦成象的新的光漂白技术”，Journal of Micro-scopy，vol.176，pp.23-32(1994)，以及Wedekind等，“对横向扩散的衍射限制测量的线性扫描显微光解”，BiophysicalJournal，vol71，pp.1621-1632(1992)，其公开内容在此引入作为参考。在用按例1方法制备的dex-ma微球进行的SCAMP实验中使用了40X油浸物镜和高效的2W(代表可能的最大输出功率)氩激光器(Spectre physics 2017)，后者用于在极短的光漂白时间内得到足够的光漂白作用。激光束的波长，也包括在漂白时是488nm。
在此例中，SCAMP实验在dex-ma微球表面下约10μm处进行。实验进行如下首先，在dex-ma微球中心平面上在400毫秒内扫描一条X-线，测量该线上的荧光(图1A一点线)。其次，选定此X-线上-3μm的节段进行漂白。用SCAMP软件可自由选择节段的长度，位置，以及数量。当激光束扫过此节段。并伴有微光束强度短暂而强烈的增加时，此节段上发生了光漂白。激光束的监测强度与光漂白强度水平间的比例是1∶500。为测量漂白了的条纹中的荧光恢复，用强衰减的激光束沿选定的X-线扫描约4秒。
图3a和3b分别显示一个FD148-dex-ma微球的中心平面在对3μm节段漂白前及漂白后2分钟的共聚焦影象。微球直径约为25μm。后一影象显示退色斑点仍为黑色，表明在2分钟后，微球的退色区没有发生荧光恢复。图4(曲线A)显示实验中退色节段的荧光没有恢复，由此可得出结论在实验的时间段内，“大”的FD148链完全地固定在dex-ma微球中所研究的区域中。
FD148链在微球形成时已经存在，它们可能被立体地网入dex-ma多聚体网状结构中，但FITC小分子是通过将已完全聚合的dex-ma球浸入FITC溶液而进入dex-ma微球的，不可能发生以上情况。此时可以期待完全的荧光恢复，且已被实验证明。图4(曲线B)表明FITC分子位于微球表面下10μm左右，仍是可移动的。
除了对样品中小节段进行光漂白的技术性能外，使用扫描显微镜能直接特异地选择样品中应发生漂白作用的微小区域，因为激光束可被局部定位。而且，在SCAMP实验中节段的长度，位置以及数量都是可自由选择的，样品中任何几何形状都可被光漂白。图5显示一个FD148-dex-ma微球在漂白了微球中一个十字形、一个环形和一个矩形后2分钟中心平面的共聚焦影象。
例3以购自比利时Antwerp PolylaB的45μm FITC标记胶乳珠也完成了SCAMP实验。按照Wedekind等(1994)和Wedekind等(1996)的工作，SCAMP安装在Sio-Rad MRC 10-24 CSLM上。在45μm FITC标记的胶乳珠SCAMP实验中，使用了100X的物镜和高效氩激光器(Spectra Physics 2017)，后者用于在极短的光漂白时间内得到足够的光漂白作用。Spectra Physics激光器的强度设置在300mw，它产生监测和光漂白激光强度分别为75_W和20mW(在发送激光束入共聚焦扫描激光显微镜的光学纤维末端测量)。因而监测与光漂白激光强度间的比值等于1∶266。激光束的波长，也包括漂白时，为488nm。
SCAMP测量在45μm FITC标化的胶乳珠的中间平面上进行。其过程如下首先将影象变焦到胶乳珠完全盖满图象的位置。其次，确定关注的标记，然后用SCAMP软件指定胶乳珠上应当漂白的标记的位置。在激光束扫过45μm FITC标记的胶乳珠的中间平面时发生了标记作用。当激光束扫过应当被漂白而产生所关注的标记的节段时激光束的强度一时强烈地增加(从75-W至20mW)。因为扫描速度为每“X-线”6ms(图1A)，而共聚焦平面(即胶乳珠的中间平面)的一个影象由512“X-线”组成，标记一个胶乳珠需要3.027秒。
图6～9显示45μm标记胶乳珠中间平面上的共聚焦影象漂白作用后一小时的条码(图6a)，条码加数字(图6b)，数字R1247(图7)，Ghentd大学的标识(图8)和Tibotec公司的标识(图9)。影象显示被退色的节段仍为黑色，表明在胶乳珠的退色节段中没有发生明显的荧光恢复。
Bio-Rad MRC 1024共聚焦扫描激光显微镜的变焦选择值如下图6a中为1.61，图6b中1.00，图7中3.07，图8中1.00，图9中1.00。在图6a和6b中可观察到SCAMP对漂白标记的高空间分辨率。图6a中的标记是由三种不同的线条组成的一种是宽的(2.5μm)，一种中等宽度(1.25μm)，还有一种较窄(0.62μm)。所有线条间互相距离为1.25μm。
例4以下实验展示在荧光微载体中漂白代码的方法，这些代码由于不同程度的漂白作用含有不同水平的强度。以下实验中使用的微载体是购自比利时Antwarp PolylaB的45μm FITC标记的胶乳珠。
在一组漂白实验中采用60X放大和300mW激光功率以产生图10a所示的图型。图中上排方块在软件中幅宽为32个象素(＝2.46μm)，间隔32象素，漂白作用使实象放大了。图中底部一排方块是上述大小的一半。
如图10a所示，进行几种强度的漂白作用是可能的。譬如，假定坪水平为200模拟-数字单位(“ADU”)，漂白作用可能至少约为50～200ADU水平。因此，漂白可能在约为原始荧光强度25％的间隔水平上进行。图10a的照片显示，例如，6种水平的漂白作用是的确可能的。图10a上面一排六个退色的方块明显显示了6种水平的漂白作用。这些方块的荧光强度可见于图10c的线图。六个方块的不同荧光强度是通过重复漂白作用(1～6次)获得的。用6个编码位置，并有6种不同水平的的荧光强度，便可有66，或46656种不同的代码。
图10a所示的一系列10个较小的方块清楚地显示重复扫描的漂白作用不是线性的。这些方块只有当前面那些的一半那么宽，但仍是清晰可辨的。这些标记的荧光强度水平示于图10d的线图。最后，在两排6个和10个代码位置之间的单个漂白斑的强度示于图10b。
第2个实验是有效地漂白一个代码，具有8个编码位置(1条的软件宽度＝24pix×0.069μm/pix＝1.66μm；间隔24pix)和8种不同强度(容许88＝16777216个不同代码)。激光输出选定为200mW。此实验的微载体的照片见图11a，表明各个代码的不同强度水平的线图示于图11b。不同的强度清晰可见。图11a的代码是15263748。
图12a和12b说明具有8个不同强度的8个编码位置的另一个例子。在此例中，用250mW漂白代替前一例中的200mW，采用0.056mm/pix。此例的代码是13265874。代码的照片和代码的不同强度的线图分别示于图12a和12b。
本发明的其它实施方案对本领域的技术人员来说，通过考虑此处公布发明的详细说明和实践，是十分明白的。这些详细说明和例子只打算被看作示范，本发明的真正范围和精神表达在以下的中。
权利要求
1.一种编码的微载体，其特征在于该微载体是藉写在微载体上的代码编码的。
2.权利要求1的编码微载体，其特征在于代码写在微载体内深处。
3.权利要求2的编码微载体，其特征在于代码是写在微载体的中心平面上。
4.权利要求1～3中任一项的编码微载体，其特征在于微载体是一微球。
5.权利要求3的编码微载体，其特征在于微载体的直径为1～200μm。
6.权利要求1～5中任一项的编码微载体，其特征在于代码是将微载体暴露于高空间分辨率光源下而写成的。
7.一种编码微载体的方法，包括在微载体上写一代码。
8.权利要求7的方法，其特征在于代码是写在微载体内深处。
9.权利要求8的方法，其特征在于代码是写在微载体的中心平面上。
10.权利要求7～9中任一项的方法，其特征在于微载体是一微球。
11.权利要求10的方法，其特征在于微球的直径为1～200μm。
12.权利要求7～11中任一项的方法，包括将微载体暴露于高空间分辨率光源下在微载体上写代码。
13.权利要求12的方法，其特征在于光源是一激光器或灯。
14.权利要求12或权利要求13的方法，其特征在于用漂白微载体的方法将代码写在微载体上。
15.权利要求14的方法，其特征在于微载体包括荧光分子，其特征还在于代码是用漂白荧光分子的方法写的。
16.权利要求15的方法，其特征在于书写代码的方法是使荧光分子漂白，在代码的漂白部分产生两种或更多种不同水平的荧光强度。
17.权利要求7～16中任一项的方法，其特征在于微载体包含选自一组材料中的一种材料，这组材料由固体，半固体，及固体与半固体的组合，而组成。
18.权利要求7～17中任一项的方法，其特征在于微载体是一种原核或真核细胞。
19.权利要求1～6中任一项的编码微载体的读出方法，包括用共聚焦显微镜观察代码。
20.检测样品中存在或不存在一种或更多种靶分析物的方法，包括选择一种或更多的与一种或更多的分析物结合或反应的配体，使配体与众多的、权利要求1～6中任一项的编码微载体结合，建立配体特性与配体所结合的微载体上代码间的相互关系，使一种或更多分析物与结合有配体的微载体接触，观察分析物已与微载体上结合配体相结合或反应的微载体，以及读出微载体上的代码以鉴定已与一种或更多分析物发生反应的配体，从而确定一种或更多分析物的存在或缺如。
21.权利要求20的方法，其特征在于靶分析物是一种核酸，其特征还在于至少一个微载体结合的配体是核酸的互补体。
22.权利要求21的方法，其特征在于该方法包含DNA杂交。
23.检测样品中存在或不存在一种或更多靶分析物的方法，包括使微载体结合的配体与至少一种分析物接触，此处的微载体是权利要求1～6中任一项的编码微载体，检测分析物是否已与配体起反应或结合，以及读出已在上面发生反应或结合的微载体的代码。
24.一种结合有配体的微载体，包括权利要求1～6中任一项的编码微载体，有一个配体与微载体相结合。
25.一个化学文库，包括与权利要求1～6中任一项的众多编码微载体相结合的文库的各个成分。
26.权利要求25的化学文库，其特征在于文库是一个组合化学文库。
全文摘要
编码的微载体,更明确而言,在上面写有代码的微载体。在微载体上写代码的方法,读代码的方法,以及应用编码微载体的方法。一种优选的编码微载体的方法,包含将含有可漂白物质的微载体暴露于高空间分辨率光源下使微载体上的代码漂白。编码微载体可用作,例如,化学和生物学测定和合成中的支持物质。
文档编号G01N33/554GK1355883SQ00809015
公开日2002年6月26日 申请日期2000年4月12日 优先权日1999年4月16日
发明者S·C·德斯梅德特, J·德梅斯特, C·H·S·雷兰特, R·W·J·保维尔斯 申请人:泰博特克有限公司, 根特大学