专利名称：一种缺失e1a编码序列的重组腺病毒构建体的获得及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种在人类5型腺病毒(Human adenovirus type 5)的基因组中定点缺失(delete)E1A编码序列的构建方案，以及通过该方案得到的具有肿瘤治疗、诊断作用的腺病毒构建体，属于医学基因工程技术领域。
近年肿瘤细胞生物学、基因工程技术的快速发展，已经为满足这一社会需求提供了现实的可能性，其中基因治疗方法在肿瘤治疗的临床试用中，已经显示出良好的应用前景。从1989年至2000年底，美国生物制品评价和研究中心(Center for Biologics Evaluationsand Research，CBER)批准的临床基因治疗试验项目已超过350项，其中约有70％的项目为肿瘤基因治疗，部分已经进入III期临床试验，取得了较好的疗效，如以单纯疱疹病毒胸苷酸激酶(HSV-TK)基因及胞苷脱氧酶(CD)基因为代表的“自杀”基因治疗，部分临床试验结果令人振奋。
目前肿瘤临床试用的绝大部分载体为缺失了E1及E3区的复制缺陷性腺病毒，进入肿瘤病灶后，对肿瘤的杀灭效应依赖于体外高浓度治疗腺病毒的输入，距离注射点较远的病灶的杀灭效应较弱。为此，近年来，出现了从复制缺陷性腺病毒载体向条件复制性腺病毒载体(conditionally replicative adenovirus)转化的新的发展趋势，所谓条件性复制腺病毒载体是指载体能选择性地在肿瘤细胞内复制增殖，将肿瘤细胞作为生产腺病毒的场所，最终达到裂解杀灭肿瘤细胞的治疗目的，肿瘤细胞裂解释放出高浓度的腺病毒后，可进一步感染距离注射点较远的病灶肿瘤细胞，形成新一轮的感染波，周而复始形成一种正反馈，达到最大的治疗效应。此类载体另一个非常理想的优势是它们不能在正常细胞内完成复制，因此对正常细胞无任何杀伤效应，某些权威医学杂志通俗地将之比喻为杀灭肿瘤的“聪明炸弹”(smart bomb)。在实际应用中，已经取得了较好的预期效果，在第21届美国肿瘤研究年会上，来自休斯顿Anderson肿瘤中心的一份研究报告表明局部注射后，复制缺陷性腺病毒在人体恶性胶质瘤病灶中的分布较局限，在一定程度上影响了疗效的发挥，与此形成鲜明的对比，能在肿瘤细胞内特异性复制的腺病毒ONYX-015，通过在肿瘤局部的增殖，其分布遍及全瘤灶，取得显著疗效。ONYX-015是美国ONYX药物生物技术公司近年研制出的能在肿瘤细胞内选择性复制的腺病毒，其构建特点是在野生型人类5型腺病毒(wild-type)的基因组上，部分缺失(delete)E1B55kDa的编码序列，并加入翻译终止信号，但保留19kDa E1B的编码序列。在正常情况下，野生型腺病毒在细胞内的复制增殖依赖于E1B 55 kDa蛋白对p53蛋白功能的灭活。在携带正常p53基因的正常细胞，ONYX-015由于缺乏E1B 55 kDa，不能在细胞内复制增殖。相反，由于恶性肿瘤患者p53基因的失活率高达50-70％，ONYX-015因而能在肿瘤细胞中增殖复制最终裂解细胞，因而ONYX-015具有杀灭肿瘤细胞的高度选择性，而对正常细胞无杀伤效应。
作为条件复制性腺病毒载体代表产品的ONYX-015在1996年进入临床试验以来，已经取得了非常令人鼓舞的临床疗效，国际著名的医学期刊《The Lancet》在以“基因治疗的新希望”为题的述评中，高度评价ONYX-015的临床应用前景，国际最著名的医学期刊如《Science》《Nature Medicine》发表了临床试验结果及评论性文章。目前，美国辉瑞(pfzer)药物公司已从ONYX生物技术公司购买了专利，并已对多种肿瘤进行临床期试验，其中，对复发性、难治性头颈部肿瘤的治疗正进行临床III期试验，已取得非常满意的疗效，对其他肿瘤如转移性结肠癌、肺癌、胰腺癌、口腔粘膜白斑病(oral leukoplakia)和恶性胶质瘤的临床I-II期试验正在进行中，同时，ONYX已经获得以ONYX-015为载体的一些相关的基因治疗重组腺病毒载体(如插入治疗基因TK，CD)的专利，正从临床前期试验向临床期试验过渡。可以预见，ONYX-015及其相关的基因治疗产品在不久的将来，在美国将正式进入临床应用，在癌症基因治疗的临床开发产品中显示出非常良好的临床应用前景。国内已有两例与ONYX-015类似原理的专利申请，其中专利申请99124030.8(一种缺陷型病毒及其构建方法)通过缺失E1B 55 kDa位于2809-3329bp编码序列，并在缺失部位插入终止码的方法得到E1B 55 kDa部分缺失的构建体。专利申请98113494.7(缺失凋亡抑制基因病毒的构建及在肿瘤基因治疗中的应用)部分缺失E1B 55 kDa编码序列，并在该缺失部位插入标志基因LacZ，得到E1B 55 kDa部分缺失同时携带标志基因的病毒构建体，该构建体的另一特点是有E3区的缺失。
现有的国内外发明均有一个共同的特点，即用不同方法缺失(delete)E1B 55 kDa的编码序列，该重组腺病毒构建体只能在携带异常p53基因的肿瘤细胞中增殖复制，而对具有正常p53基因表型的肿瘤细胞治疗效应较弱，在某些大病种肿瘤，如急性白血病p53基因的突变率很低，成为ONYX-015及其相关产品临床应用的不足之处。
为实现以上目的，采用的技术方案是用定点突变、PCR扩增、酶切、连接等技术，缺失pCX1质粒(该载体包含腺病毒-21nt至-5790nt序列)中E1A的编码区(382-1630nt)，组成新的载体pCX1-E1A，该载体包含病毒包装信号(packaging signal)(-194至-358nt)，与除缺失病毒包装信号外，包含腺病毒全部基因组的载体pBHGE3共转染293细胞，筛选出不能表达E1A功能蛋白的重组腺病毒构建体。
与现有的重组腺病毒构建体相比，采用本发明达到了以下效果(1)该重组腺病毒构建体缺失了E1A蛋白的全部编码区(382-1630nt)，E1A蛋白编码功能完全丧失，除此之外，包含ADV5的全部基因组序列。(2)对携带异常Rb基因表型的肿瘤细胞系及正常对照细胞体外实验结果表明，该重组腺病毒构建体对正常细胞无杀伤效应，而对携带异常Rb基因表型肿瘤细胞具有非常显著的杀灭作用，当与顺铂等一线化疗药物联用时，增效作用极其显著。初步结果表明，该重组腺病毒构建体是一种可用于制备肿瘤临床治疗药物的工具。(3)对正常细胞、肿瘤细胞系体外实验结果表明该重组腺病毒构建体对正常细胞系活性无明显影响，而肿瘤细胞系转染腺病毒后96小时内出现部分细胞裂解死亡，因此该重组腺病毒构建体有较可靠的诊断肿瘤细胞的价值。(4)本发明所用的技术方法和流程获得的重组腺病毒构建体，是一种新型的可选择性在肿瘤细胞内增殖复制的基因治疗重组腺病毒载体。
四
附图1为质粒pCX1的结构示意图。该载体全长9905bp，包含腺病毒-21nt至-5790nt序列。
附图2为用定点突变技术在质粒pCX1的378nt-381nt中引入酶切位点。
附图3为构建缺失382-1630 nt E1A蛋白编码序列的质粒pCX1-E1A。
附图4为pBHGE3的结构示意图，该质粒包含人类5型腺病毒除包装信号(194-358nt)外的全部基因组序列，全长37436bp。
附图5为缺失382-1630 nt E1A蛋白编码序列的重组腺病毒载体ADV/dE1A的构建。
五具体实施例方式
实施例(除特别注明外，本技术流程中所用的酶和PCR引物均购自美国Gibco公司)。
例1用定点突变技术在pCX1质粒的376-381nt中引入Xba I酶切位点。
pCX1购于Microbix Biosystem Inc.(Toronato，Ontario，Canada，目录号PD-01-03)，该质粒包含人类5型腺病毒21-5790 nt序列，其质粒结构图见附图1。用定点突变试剂盒QuikChangeTMSite-DirectedMutagenesis Kit(Strategene，U.S.A.)在pCX1质粒的376-38 1 nt中引入Xba I酶切位点，即将TGG AGA突变为TCTAGA，具体操作参照Strategene提供的说明书进行(附图2)。
用于突变的PCR引物为引物1＝5′-GGG ACT TTG ACC GTT TAC GTC TAG ACTCGC CCA GGT GTT TT-3′(-358nt至-398nt)；引物2＝5′-C ACC TGG GCG AGT CTA GAC GTA AAC GGTCAA AGT CCC CGC GGC-3′(-394nt至-352nt)(下标横线为突变位点)。
PCR反应的条件为95℃ 30秒；95℃ 30秒、55℃ 1分钟、68℃ 20分钟共15次循环；68℃延伸20分钟。
用Xba I酶切鉴定、筛选阳性克隆，即得到在376-381nt中引入XbaI酶切位的pCX1新质粒，将该载体用XbaI酶切，得到的6.6kb的片段，常规电泳分离纯化后用于连接反应(附图3)。
例2构建缺失382-1630 nt E1A蛋白编码序列的质粒pCX1-E1A。
PCR反应引物为引物3＝5′-CCG CTC TAG ATA ACT TGC ATG GCG TGTTAA-3′(-382nt至-401nt，下标横线为引入的酶切位点XbaI)；引物4＝5′-CCG CTC TAG ATC ATG GTC ATG TCA AACACC-3′(-1630nt至-1610nt，下标横线为引入的酶切位点XbaI)；以pCX1为模板，用引物3及引物4进行PCR反应。
反应体系总体为50μl，包括5×PCR缓冲液10μl；50mMMgCl22μl；10mMdNTP 1μl；10μM引物3 1μl；10μM引物4 1μl；pCX1 10ng；Taq 2.5 u；加水至50μl。
反应条件为95℃ 30秒；94℃ 30秒、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟共25次循环；72℃延伸7分钟。
PCR产物为1.7 Kb片段，用Xba I酶切，常规电泳分离纯化后用于连接反应。
用DNA T4连接酶连接6.6kb的pCX1、1.7Kb片段，转入DH5a感受态细菌，用DNA测序鉴定筛选阳性克隆，得到包含缺失E1A的全部编码区(382-1630nt)的质粒pCX1-E1A(附图3)。
例3缺失E1A的全部编码序列(382-1630nt)重组腺病毒构建体的构建。
pBHGE3购于Microbix Biosystem Inc.(Toronato，Ontario，Canada，目录号PD-01-12)，该质粒包含人类5型腺病毒除包装信号(194-358nt)外的全部基因组序列，其结构见附图4。293细胞系是经剪切的人类5型腺病毒(Ad5)DNA转化人胚胎肾细胞，获取的永久传代细胞系，购自ATCC(American typical culturecollection，ATCC，U.S.A.，目录号ATCC CRL-1573，1972年公开)。获取时，细胞的传代次数为32代。293细胞为贴壁细胞，低三倍体，其中30％细胞有64条染色体，4.2％细胞有更高倍体。将pBHGE3和pCX1-E1A共转染293细胞，在细胞内发生同源重组，当包含人类5型腺病毒包装信号的pCX1-E1A(20nt-381nt及1631nt-5790nt)置换整合入pBHGE3时，即产生在293细胞内有增殖能力的重组腺病毒构建体，该构建体缺失E1A的全部编码序列(382-1630nt)，命名为AD5/dE1A，其结构见附图5。腺病毒经过复制，包装产生腺病毒颗粒。通过挑取噬菌斑(plaques)，获取多个单克隆的重组腺病毒构建体，经过DNA测序，得到重组腺病毒构建体阳性克隆，经过常规的腺病毒扩增、纯化，得到高浓度的重组腺病毒构建体AD5/dE1A。
例4重组腺病毒构建体选择性杀灭肿瘤细胞的体内外实验。
选取以下细胞系作为实验对象U-2OS(ATCC，HTB96)P53+，RB-人成骨细胞瘤细胞系；HS700T(ATCC，HTB147)P53-，RB-，人转移性腺瘤细胞系；DLD-1(ATCC，CCL221)P53-，RB-，人结肠癌细胞系；IMR90(ATCC，CCL186)P53+，RB+，人肺成纤维细胞系；293(ATCC，CRL1573)P53+，RB+，人胚肾细胞系，为腺病毒的转代细胞。
细胞在10％ FBS DMEM、37℃、5％ CO2条件下培养于6孔板，每孔5×105细胞。
用于实验的腺病毒野生型人类腺病毒5；重组腺病毒构建体AD5/dE1A；重组E1、E3缺失重组腺病毒作为对照。
用于腺病毒转染的腺病毒感染指数(MOI)为10，将腺病毒悬浮于1mlPBS中，在10％ FBS DMEM，37℃，CO2条件下转染1小时，转染后，将细胞置于标准培养条件下培养。分别在4、8、12天用0.5％的龙胆紫/20％甲醇溶液染色，死细胞悬浮被冲出培养皿，活细胞染色保留在培养皿中。
实验结果表明，阳性对照腺病毒野生型人腺病毒5无选择性地裂解肿瘤细胞；复制缺陷型腺病毒(重组E1、E3缺失重组腺病毒)只裂解病毒生产293细胞系。重组腺病毒构建体AD5/dE1A选择性地裂解细胞系U-2OS、HS700T和DLD-1，对正常对照细胞系IMR90无明显影响。因此，重组腺病毒构建体AD5/dE1A能选择性杀灭肿瘤细胞，其作用见下表
进一步用化疗药物顺铂联用以上腺病毒的实验结果表明，重组ADV/dE1A腺病毒载体选择性地显著增强肿瘤细胞系U-2OS、HS700T和DLD-1对顺铂的敏感性，而对正常对照细胞系IMR90无明显的增效作用。因此，重组ADV/dE1A腺病毒载体具有选择性增强顺铂杀灭肿瘤细胞的作用，其效应见下表
权利要求
1.一种重组腺病毒构建体，其特征在于该重组腺病毒构建体缺失了ADV5 E1A蛋白的全部编码区(382-1630nt)，E1A蛋白编码功能丧失，除此之外，包含ADV5的全部基因组序列。
2.构建权利要求1的重组腺病毒构建体的方法，其特征方法在于用定点突变、PCR扩增、酶切、连接等技术，缺失(包含腺病毒-21nt至-5790nt序列)的pCX1质粒中E1A的编码382nt-1630nt组成新的载体pCX1-E1A，该载体包含病毒包装信号-194至-358nt，与除缺失病毒包装信号外，包含腺病毒全部基因组的载体pBHGE3共转染293细胞，筛选出不能表达E1A功能蛋白的重组腺病毒构建体ADV/dE1A，及扩增、纯化重组腺病毒构建体ADV/dE1A。
3.权利要求1所述的重组腺病毒构建体在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
4.权利要求1所述的重组腺病毒构建体在制备肿瘤诊断的试剂中的应用。
5.权利要求1所述的重组腺病毒构建体在制备基因治疗载体中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种在人类5型腺病毒(Humanadenovirus type5)的基因组中定点缺失(delete)E1A编码序列的构建方案，以及获得的重组腺病毒构建体在肿瘤治疗、诊断中的具体用途。用定点突变、PCR扩增、酶切、连接、亚克隆、转染、重组腺病毒单克隆纯化等技术，缺失E1A(382－1630nt)序列，筛选出不能表达E1A功能蛋白的重组腺病毒构建体。该构建体能选择性地在肿瘤细胞内复制增殖，从而特异性裂解杀灭肿瘤细胞，并对顺铂等一线化疗药物对肿瘤细胞的杀灭有显著的增效效应，另一方面该重组腺病毒构建体在正常细胞内不能复制增殖，因而对正常细胞无毒性效应。该重组腺病毒构建体在用于肿瘤治疗药物、诊断试剂的制备中具有良好的实用价值，同时也是一种良好的基因治疗载体。
文档编号C12N15/86GK1427075SQ01144628
公开日2003年7月2日 申请日期2001年12月21日 优先权日2001年12月21日
发明者周剑锋, 马丁, 卢运萍, 王世宣, 徐钢, 王世安, 李震中 申请人:周剑锋