专利名称：红豆杉全株无毒提取紫杉醇口服抗癌制剂及其制备方法
技术领域：
本发明是涉及中药技术领域中，利用人工栽培的东北红豆杉全株进行乙醇浸泡、 无毒提取紫杉醇及其口服抗癌制剂的制备方法。
背景技术：
红豆杉提取紫杉醇的生产工艺，据目前国内外有关报道和相关文献中介绍的有使用CO2萃取，和超声波萃取等多种多样的提取工艺方式。C02萃取，超声波萃取虽工艺先进， 得取率高，但紫杉醇以及经某些化学溶剂处理后的残留仍有等量存在，提取后的原料用作注射制剂，虽然患者对其毒性能够耐受，但必定又给患者造成二次伤害，如果针对晚后期或联合化疗失败的癌患来讲，就会加速其死亡的速率。研究实验表明，无毒提取的紫杉醇比有毒的紫杉醇更好，生理活性仍然较强，因无毒提取保留了诸多的抑癌活性物质，尤其是豆杉色素中小分子化合物的存留，这时缓解癌痛，抑制癌细胞生长极为重要。本发明是采用改进型的16步法超滤膜分离提取法提取粗品紫杉醇，不使用化学溶剂，无化学残留，其安全性、得取率都很高。目前这种16步法无毒提取工艺在国内还不多见。
发明内容
本发明的目地是向药企提供红豆杉全株无毒提取紫杉醇粗品原料，为制做和确保口服抗癌制剂紫杉醇药酒，紫杉醇口服液的安全性，提供科学的技术路线支撑。原料提取与口服制剂的制备方法1、紫杉醇原料的无毒提取工艺去杂，O3水清洗一切片一烘干一粉碎一纳米超微破壁一乙醇浸泡剥离一初滤一脱毒处理一低压大孔超滤一高压小孔超滤一层析一真空渗透浓缩一回收乙醇一二次脱毒一真空冷冻干燥一结晶体粉碎。2、工艺步骤说明(1)去杂、清洗将红豆杉全株干品表面附着的泥土及其他杂质清除掉，再放入O3 水清洗池中清洗，通过O3水的氧化作用，可有效的将红豆杉全株表面的病菌、霉毒以及化肥农药的残留清除掉；(2)将清洗后的红豆杉全株浙干水分后，切成薄片；(3)烘干将红豆杉薄片送入热风循环干燥机内烘干3小时；(4)烘干后的红豆杉碎片在经不锈钢粉碎机粉碎；(5)超微破壁纳米超微破壁的目地是，由于紫杉醇烷二萜类属小分子化合物，紧帖在胞核内和胞核外，加上细胞胶质和黏结附着力强原故，即是乙醇浸泡后膨胀开裂，但仍有部分烷二萜类化合物还无法游离出来，采用超微纳米级破壁机粉碎300目，甚至更小的微粒，可有效的获取二萜及其它化合物；(6)乙醇浸泡剥离由于紫杉醇烷二萜类不溶于水，易溶于乙醇的特性，采用95%医用乙醇与红豆杉按比例浸泡，间接加热浸泡M小时后，在将液温间接加热至二萜类化合物生理活性尚处稳定的界度内，快速搅拌20分钟，促使烷二萜类化合物在适宜温度下的流相冲击中剥离出来；(7)初滤将搅拌剥离后的溶液用500目细度的滤网进行过滤，滤渣再进行二次乙
醇浸泡；(8)脱毒处理将初滤后的溶液间接加热至适宜温度时液温逐渐升高，有毒的轻质挥发油会逐步上浮到乙醇溶液表面，并随温升高而向中心聚积，这时用吸油纸吸附出来， 也可用不锈钢汤勺取出，日后集中统一提取挥发油；(9)低压大孔超滤采用超滤膜分离机，设定粒度为0. Olum，而紫杉醇烷二萜类化合物的粒度为0. 01-0. 002um。所以，首先将脱毒的乙醇溶液加压通过低压大孔0. Olum超滤截留，截留物为粗纤维，微尘、胶质等无利用价值的大分子物质；(10)高压小孔超滤将低压大孔透过液再经高压小孔0. OOlum的截留，即获得紫杉醇烷二萜类和其它化合物的大小分子浓缩液；(11)层析将高压小孔超滤透过液，经硅胶层析柱真空态渗透吸附的洗脱液与高压小孔超滤截留的大小分子浓缩液合并；(12)真空渗透浓缩将合并的浓缩液进行3小时中温真空渗透浓缩，即获得大小分子合并后的膏体状。(13)回收乙醇将真空渗透的小分子乙醇液与层析透过的小分子乙醇液合并，用蒸馏器蒸馏回收再用；(14) 二次脱毒将真空渗透浓缩的膏状倒入一薄壁的不锈钢盘内，送入恒温干燥箱内密闭吸空干燥6小时，由于浓缩的膏体内还存有部分轻质豆杉精油和乙醇，待膏温逐渐上升时，豆杉精油会随乙醇一同升华蒸发掉，6小时后，可呈现无乙醇的结晶体；(15)低温真空干燥将基本干燥的无乙醇结晶体打碎，放入另一薄壁的的不锈钢盘内，送入真空冷冻干燥机内，低温38度以上真空状态下，冷冻干燥M小时，即成为无毒提取的紫杉醇结晶体；(16)结晶体粉碎将干燥后的结晶体通过不锈钢高速粉碎机快速粉碎为80目，可得紫杉醇粗品，颜色为浅红色不规则结晶粉末，经测定紫杉醇含量为30%。本发明利用其超滤提取、浓缩作用，大大提高了产品得率。也可利用不同分子量截留值的超滤膜来实现紫杉醇的进一步分级纯化，也可将紫杉醇分成几个相对单一的分子量级别，制备均一的精品紫杉醇。超滤法在加工前进行脱毒和加工后的二次脱毒处理，使得紫杉醇毒性降低98%以上，有效活性不破坏，且操作简单，只需控制操作压力，流速和滤液浓度即可，这对于分子量大且分布范围较宽，溶液黏度大且又不稳定的紫杉醇烷二萜类来说， 无疑是一种极具发展潜力的提取分离手段。3、粗品紫杉醇的物理状态与理化性质粗品紫杉醇中含有蛋白质、氨基酸、矿物质、生物素以及紫杉醇烷二萜类、紫杉碱、 紫杉素、紫杉多糖、紫杉红色素、紫杉单宁、紫杉多酚、紫杉腺苷类等化合物，其粗品的黏性较大，颜色为浅红色结晶粉末，味微苦，微涩，有股松杉香气味。紫杉醇粗品易吸湿，一般常温15度以上时黏性增大，逐步形成粘稠状的流体，温度下降至5度以下时，还原成结晶块， 经检测其生理活性不变，但微生物增多，采用零度以下的低温冷藏或冷冻时，其物理状态与理化指标较为稳定。4、毒理试验(1)急毒LD50试验分三个实验组，第1组试验原料由上海某药企提供的注射用99%含量的精品紫杉醇，颜色为白色不规则结晶粉末，用聚乙二醇400烯释后，调配成 100mg/ml的生药；第2组试验原料由黑龙江省某红豆杉基地提取的自制乙醇提取紫杉醇粗品，含量在1 %。颜色为褐红色结晶颗粒，用聚乙二醇400烯释后，调配成2g的生药；第3组试验原料属本发明无毒提取的紫杉醇粗品，含量为30%，颜色为浅红色结晶粉末，用聚乙二醇400烯释后，调配成2g/ml的生药。实验1组、2组、3组的受试鼠采用上海ICR种小鼠， 每组各10只，雌雄各半，全部停食10小时后，一次性灌喂给药，观察3天，给药后第1受试组在5小时内先后死亡2只，9小时内又死亡1只，剩余7只鼠缓慢复苏存活；给药后的第 2受试组在5小时内死亡1只，其它9只出现异常，但6小时后恢复常态，给药后的第3受试组无一只鼠出现异常，无一只死亡。测试结果表明第1组，利用国标提取工艺的精品紫杉醇，受试鼠死亡3只，毒性较大；第2组是黑龙江省某红豆杉基地的粗品紫杉醇，受试鼠死亡 1只，具有一定的毒性；第3组是本发明无毒提取的紫杉醇粗品，受试鼠无一只死亡。(2)最大耐受量测试用ICR种小鼠40只/kg，雌雄各半，停食10小时后一次性灌喂给药2g/ml，无毒提取的紫杉醇，含量30%，一天内给药2次，总剂量为160g/kg生药，此剂量相当于成人按 60kg体重计算，是口服剂量0. 034g的1200倍。小鼠给药后的3小时内仅有2只出现轻微异常，4小时后恢复常态，3天内无一只死亡。经常规饲养观察20天，除出现轻微异常的2 只小鼠在给药后的第9天内体重略轻于相应时间对照组P < 0. 03外，其余未发现异常。因此，小鼠的最大耐受量为成人临床拟口服剂量的1200倍，测试结果表明，毒性甚微。5、抗癌试验(1)将本发明无毒提取的紫杉醇粗品，烯释配比成2g/ml的生药，紫杉醇含量为 30%，注入培养活跃的46岁女性乳腺癌细胞株培养器内，恒温培养10小时后显微观察发现，乳腺癌细胞株大部分被抑制的一动不动。(2)将乳腺癌细胞32株用蒸馏水混溶后，分别给10只3龄的雌性鼠胸外皮内注射，使其感染，每只鼠分别注射约0. 3ml，但0. 3ml中乳腺癌细胞株数量不详。观察3天发现， 10只鼠全部出现异常，确定已全部感染，待第九天时有8只鼠乳腺隆起突出，活动次数和进食量相对减少，各别鼠有时出现尖叫声。第10天时每天灌胃2次，日剂量3. ^ig紫杉醇，连续给药2个月，给药后的第6天时，食欲，活动次数有所增加，尖叫声基本消失，第30天已基本恢复，肿块变小，大部分乙基本消失，2个月后，隆起的乳腺瘤块除有1只略有变小外，其余7只已全部消失。实验证明，无毒紫杉醇粗品针对乳腺癌具有极为显著的治疗效果，而且镇痛作用较好，无任何毒副作用表现。(3)通过多名患有皮肤癌、肺癌、淋巴癌、肝癌(都在放化疗之中)患者自愿服用紫杉醇口服液，每天服用2次，每次IOml/支，内含紫杉醇粗品Ig/支，连服3个月，辅助抑癌效果特别明显。尤其是一位肝癌患者，51岁，男性，初检瘤块0.98-1. 36，AFP为6902，服用口服液1个月，AFP降至1150，2个月降至80，服用3个月检验彩超造型残留病灶无活动迹象。实验表明，无毒提取的紫杉醇口服抗癌制剂作用极其显著，而且镇痛作用比较好。(4)通过几十位亚健康男女自愿服用紫杉醇口服液后，感觉体力充沛，精气神提高，有活力，睡眠好，不易感冒，这与无毒紫杉醇具有溶血抗栓，抗病毒、抗炎、抗癌和增强免疫力作用有关，这就为开发紫杉醇药用原料与口服制剂提供了一定的理论性依据。6、紫杉醇口服抗癌制剂的制备方法(1)紫杉醇药酒将38度的燕麦酒50kg，放入一大容量不锈钢容器内，间接加热 40度，在放入5kg紫杉醇粗品，充分搅拌20分钟，待其全部溶解后，用0. Ium的滤膜过滤，计量灌装，每瓶250ml，紫杉醇药酒用于治疗用，日服2次，每次10ml，内含紫杉醇粗品lg，预防用，每天1次，每次10ml。由于紫杉醇不溶于水而溶于乙醇，所以在优质的酒中加入紫杉醇溶解快，不沉淀， 酒的颜色呈粉红色，没有悬浮物，半透明状，口感好，无异味，药用物质活性强。燕麦酒与其它粮食酿制的酒不同点是燕麦中含有丰富的蛋白质、矿物质、脂肪、 碳水化合物，更主要的是含有对人体极为有益的亚油酸，对中老年人降脂，降糖，降低胆固醇有较好的益处，营养物质经酶解、蒸馏转化为小分子化合物，存在于酒中，再与紫杉醇组合，酒为药弓I，药借酒势，活性物质快速直达病灶而发挥作用。(2)紫杉醇口服液将7500ml蒸馏水放入一耐高温的玻璃容器内，间接加热40 度，放入冰糖500g，VC50片搅拌溶化后加入聚乙二醇45ml搅勻，再加入紫杉醇粗品^g，充分搅拌10分钟后，待其全部烯释成粉红色微乳状时，倒入盛有40kg蜂胶的容器内，搅拌20 分钟，将其全部混溶后，计量灌装，每支10ml，每支口服液内含紫杉醇粗品lg，每盒10支，然后用UST瞬间杀菌机杀菌处理，即成为紫杉醇口服液。治疗用，每天口服二次，每次1支，预防用，每天口服1次，每次1支。紫杉醇口服液利用蜂胶作为基质，微乳性能好，营养丰富，添加VC的作用是减少溶液过氧化，保存期长，而且口感好，易吸收，作用快。紫杉醇是近10年来发现具有极强抗癌活性的植物提取物，它不同于其它植物药物和化疗药物，抗癌作用极其独特，其主要作用机理为紫杉醇与细胞受体后，释放出的TNF-a抑制因子，通过肿瘤新生微毛细血管和胞膜进入细胞核内，促使肿瘤微管聚合，而且不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。抑制因子 TNF-a会在癌细胞内积累大量的微管，也叫蛋白基因抑制因子。这些微管的积累干扰和破坏了癌细胞基因免疫及修复应答功能，特别是使癌细胞分裂停止于有丝分裂期G2/m内，致使快速分裂的肿瘤细胞在有丝分裂期阶段被牢牢固定，阻止了癌细胞飞快生长与复制，并通过抵制微管蛋白与二聚体动态平衡来诱杀癌细胞，致使肿瘤细胞萎缩、凋亡。紫杉醇的功能性作用是任何植物抗癌药物和生物碱中抑癌活性最强。最有效的一种抑癌药物，尤其是无毒提取的紫杉醇，在确保了患者服用后安全性的同时，也增强了抑癌疗效。
具体实施例方式红豆杉全株无毒提取紫杉醇口服抗癌制剂及其制备方法，其主要工艺是1、提取工艺(1)去杂，O3水清洗，将IOOkg红豆杉全株干品表面附着的泥土及其它杂质清除掉，放入O3水清洗池中清洗。(2)切片，将清洗后的IOOkg红豆杉全株取出浙干水分后，切成2mm厚的薄片；
(3)烘干，将红豆杉薄片放入不锈钢盘中，送入50度的热风循环干燥机内烘干3小时，待含水分在5%以下时，取出；(4)粉碎，烘干后的红豆杉碎片再经不锈钢粉碎机粉碎，粒度为Imm以下；(5)超微破壁，将粉碎后的IOOkg红豆杉粉，在经纳米超微破壁机超微粉碎300 目；(6)乙醇浸泡剥离，采用95%的医用乙醇500kg，红豆杉全株超微粉IOOkg放入能够密封的不锈钢容器内，间接加热38度，恒温浸泡M小时后，在加温60度同时，连续搅拌剥离20分钟后，减温并停止搅拌。(7)初滤，将搅拌剥离后的溶液用500目细度的滤膜进行过滤，滤渣在二次乙醇浸泡，过滤，两次的滤液合并。(8)脱毒处理，将初滤的合并液放入一不锈钢容器内，间接加热50-60度，随着液温的逐渐升高，有毒的轻质豆杉挥发精油会逐步上浮到乙醇液表面，向中心聚积，这时用不锈钢汤勺将其取出；(9)低压大孔超滤，采用超滤膜分离机，设定超滤粒度为0. Olum，将脱毒后的乙醇溶液加压，通过低压大孔0. Olum超滤截留，截留物为粗纤维，微尘、胶质等无利用价值的大分子物质。(10)高压小孔超滤，将低压大孔透过液再经高压小孔0. OOlum的滤膜超滤截留， 截留液为烷二萜类等化合物大分子液，透过液为乙醇及小分子化合物。(11)层析，将高压小孔透过液，经硅胶柱层析真空态渗透吸附，然后将洗脱液与高压小孔的截留液合并。(12)真空渗透浓缩，将合并液通过浓缩机进行3小时的40度中温真空态渗透浓缩，得大分子合并后的膏体状。(13)回收乙醇，将真空渗透的小分子乙醇液与层析透过的小分子乙醇液合并，用蒸馏器蒸馏回收再利用。(14) 二次脱毒，将真空渗透浓缩的膏体倒入一薄壁的不锈钢盘内，送入60度的恒温干燥箱内密封，用真空泵间歇式吸空干燥6小时，将其膏体状内的部分乙醇和挥发油随温升高而挥发掉。(15)低温真空干燥，将基本干燥的无乙醇半结晶块弄碎，放入一薄壁的不锈钢盘内，送入真空冷冻干燥机内，在负38度以上的真空状态下，冷冻干燥8小时后，即成为无毒提取的紫杉醇结晶体。(16)结晶体粉碎，将干燥后的结晶体通过不锈钢高速粉碎机快速粉碎80目，可得紫杉醇粗品。2、紫杉醇药酒的制备方法将38度的燕麦酒50kg，放入一大容量不锈钢的容器内，间接加热40度，再放入 5kg紫杉醇粗品，充分搅拌20分钟，待其全部溶解后，用0. Ium的滤膜过滤，计量灌装，每瓶 250ml ο3、紫杉醇口服液的制备方法将7500ml蒸馏水放入一耐高温的玻璃容器内，间接加热40度，放入冰糖500g、维生素C50片，搅拌溶化后在加入聚乙二醇45ml，充分搅拌10分钟后，待其全部烯释成粉红色微乳状时，倒入盛有40kg蜂胶的容器内，搅拌20分钟，将其全部混溶后，计量灌装，每支 10ml，每支口服液含有紫杉醇粗品lg。
权利要求
1.将初滤的合并液放入一不锈钢容器内，间接加热50-60度，随着液温的逐渐升高，有毒的轻质豆杉挥发精油会逐步上浮到乙醇表面，并向中心聚积，这时用不锈钢汤勺将其取出ο
2.将真空渗透浓缩的膏体倒入一薄壁的不锈钢盘内，送入60度的恒温干燥箱内密封， 用真空泵间歇式吸空干燥6小时后，将其膏体内的部分乙醇和挥发精油随温升高而挥发掉。
全文摘要
本发明提供了红豆杉全株无毒提取紫杉醇口服抗癌制剂及其制备方法，是由东北红豆杉为主要提取原料，采用乙醇浸泡16步法无毒提取工艺，获得30％含量的紫杉醇粗品，作为紫杉醇药酒，紫杉醇口服液的主要原料。药效研究表明，本发明制备口服抗癌制剂针对二十多种不同特异性的晚期及联合化疗失败的晚后期癌患具有及其显著的治疗效果，而且镇痛作用比较好，无毒。
文档编号A61K36/13GK102552338SQ201210030328
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月13日 优先权日2012年2月13日
发明者林树芳 申请人:林树芳