应用于紫杉醇制剂的植物提取物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种应用于紫杉醇制剂的植物提取物及其制备方法，该应用于紫杉醇制剂的植物提取物以干燥粉碎后的红豆杉枝叶为原料，用丙酮和乙酸乙酯的混合溶剂进行浸提，减压浓缩后得到提取物浸膏，经三氯甲烷-水萃取浓缩后得到提取物粗品，经碱性氧化铝固定相柱层析，再经C18-硅胶柱反相层析，最后经乙醇重结晶制得。本发明的应用于紫杉醇制剂的植物提取物具有紫杉醇含量高、纯度高、杂质少等的特点。本发明的应用于紫杉醇制剂的植物提取物的制备方法具有紫杉醇回收率高、提取纯化操作简便、生产成本低、节能环保等特点。
【专利说明】应用于紫杉醇制剂的植物提取物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种应用于紫杉醇制剂的植物提取物及其制备方法，属于医药技术领 域。
【背景技术】
[0002] 紫杉醇，英文名称为Paclitaxel，化学名称为5 β，20_环氧_1，2 α，4,7 β , 10 β , 13 α -六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13 [ (2'R，3'S)-N_苯 甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]，分子量为853. 92,分子式为C47H51NO1415
[0003] 紫杉醇为白色结晶体粉末，无臭、无味，难溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂。 紫杉醇具有独特的抗肿瘤作用，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色 素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。目前的紫杉醇制剂主要为紫杉醇注射液等， 紫杉醇注射液为紫杉醇加适量助溶剂和稳定剂制成的灭菌溶液，含紫杉醇（C 47H51NO14)应为 标示量的 90. 0%-110. 0%。
[0004] 目前紫杉醇主要从红豆杉植物中提取，在红豆杉科植物红豆杉的干燥根、枝叶以 及树皮中均含有紫杉醇，但是含量较低，约为树皮干重的〇. 01%。红豆杉是世界上公认濒临 灭绝的天然珍稀抗癌植物，是经过了第四纪冰川遗留下来的古老孑遗树种，在地球上已有 250万年的历史。由于在自然条件下红豆杉生长速度缓慢，再生能力差，所以很长时间以来， 世界范围内还没有形成大规摸的红豆杉原料林基地。1994年红豆杉被我国定为一级珍稀濒 危保护植物，同时被全世界42个有红豆杉的国家称为"国宝"。 因此，提高红豆杉中紫杉醇的回收率显得非常必要。目前提取分离紫杉醇的方法有： 有机溶剂萃取法、超临界流体萃取法、膜分离法等。有机溶剂萃取法步骤多，回收率低，产物 损失大。超临界流体萃取法收率高、省时间，但该方法对设备的投入大，对设备要求高，操作 条件严格，生产成本高。膜分离法所需的半透膜和反渗透装置价格昂贵，操作技术也非常复 杂,生产成本也高。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种应用于紫杉醇制剂的植物提取物及其制备方法，提高 红豆杉中紫杉醇的回收率，采用简便可行的提取纯化紫杉醇的方法，降低成本，降低污染物 排放，有利于环境保护。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明的应用于紫杉醇制剂的植物提取物以干燥粉碎后的 红豆杉枝叶为原料，用丙酮和乙酸乙酯的混合溶剂进行浸提，减压浓缩后得到提取物浸膏， 经三氯甲烷-水萃取浓缩后得到提取物粗品，经碱性氧化铝固定相柱层析，再经C 18-硅胶柱 反相层析，最后经乙醇重结晶制得。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的应用于紫杉醇制剂的植物提取物的制备方法，该 方法包括如下步骤： 步骤1，将红豆杉枝叶洗净，低温干燥后用粉碎机粉碎成粉末，用丙酮和乙酸乙酯的混 合溶剂进行浸提，将浸提液进行减压浓缩，回收溶剂，得到提取物浸膏； 步骤2,将提取物浸膏用三氯甲烷溶解，再加入纯化水，搅拌后静置分层，回收有机相， 水层用三氯甲烷萃取，合并有机相，将有机相减压浓缩回收三氯甲烷，得到提取物粗品； 步骤3,将提取物粗品用三氯甲烷进行溶解，加入到已活化的碱性氧化铝固定相柱中， 抽干，先用三氯甲烷淋洗并抽干，然后用三氯甲烷和甲醇的混合淋洗剂淋洗并抽干，再用三 氯甲烷和甲醇的混合洗脱剂洗脱，将收集的洗脱液减压浓缩，得到提取物半成品； 步骤4,将提取物半成品溶于乙腈水溶液，加入到已平衡好的C18-硅胶柱中，再用乙腈 水溶液洗脱，将收集的洗脱液减压浓缩析晶，抽虑出的结晶再用乙醇溶解进行重结晶，最后 抽虑出结晶，真空干燥后得到高纯度的提取物。
[0008] 作为本发明的改进，该步骤1中低温干燥的温度为50?60°C，干燥后水份彡10%， 粉碎成100?120目的粉末。
[0009] 作为本发明的改进，该步骤1中丙酮和乙酸乙酯的混合溶剂的重量为红豆杉枝叶 粉末的4?5倍，混合溶剂中丙酮和乙酸乙酯的体积比为1 :0. 8?1，浸提在超声波辅助下 进行，浸提温度为35?45°C，浸提时间为1?2小时/次，浸提次数为3次。
[0010] 作为本发明的改进，该步骤1中减压浓缩温度为50?60°C，真空度为0.07? 0.09MPa。
[0011] 作为本发明的改进，该步骤2中用于溶解提取物浸膏的三氯甲烷的重量为提取物 浸膏的1?2倍，纯化水的重量为提取物浸膏的1?1. 5倍，静置分层时间为4?6小时。
[0012] 作为本发明的改进，该步骤2中用于水层萃取的三氯甲烷的重量为提取物浸膏的 1?2倍，萃取次数为2次。
[0013] 作为本发明的改进，该步骤3中用于溶解提取物粗品的三氯甲烷的重量为提取物 粗品的10?15倍，提取物粗品溶液在碱性氧化铝固定相柱中的停留时间为30?40分钟。
[0014] 作为本发明的改进，该步骤3中混合淋洗剂的三氯甲烷和甲醇的体积比为98 :2? 98. 5 :1. 5,混合洗脱剂的三氯甲烷和甲醇的体积比为95 :5?96 :4。
[0015] 作为本发明的改进，该步骤4中用于溶解提取物半成品的乙腈水溶液的重量为提 取物半成品的3?5倍，乙腈水溶液中乙腈和纯化水的体积比为40 :60,提取物半成品溶液 每次加入量为2?2. 5mg紫杉醇每克固定相，洗脱用的乙腈水溶液中乙腈和纯化水的体积 比为50 :50。
[0016] 将干燥的红豆杉枝叶粉碎成100?120目的粉末，有利于紫杉醇的较好提取，实现 最佳效益。用4?5倍丙酮和乙酸乙酯(体积比为1 :0. 8?1)的混合溶剂浸提红豆杉枝叶 中的紫杉醇，可以得到最好的提取效果，紫杉醇在提取物浸膏中的含量最高，而且提取物浸 膏的重量最小。用超声波辅助浸提，可以缩短浸提时间，提高提取效果。浸提次数为3次， 可以实现紫杉醇较完全的提取。用碱性氧化铝固定相柱层析提取物粗品，可以除去大量的 亲水性物质、脂质物质和7-表-紫杉醇，同时紫杉醇可以得到十几倍以上的提纯，紫杉醇的 回收率可以大于100%，获得紫杉醇最高的回收率和纯度。提取物粗品溶液在碱性氧化铝固 定相柱中的停留时间为30?40分钟，可以使7-表-紫杉醇不断转化为紫杉醇，也可以防 止紫杉醇降解。用三氯甲烷和甲醇的混合淋洗剂(体积比为98 :2?98. 5 :1. 5)可以取得最 好的淋洗效果。用三氯甲烷和甲醇的混合洗脱剂(体积比为95 :5?96 :4)可以取得对紫杉 醇的最好洗脱效果，实现紫杉醇最好的回收。将提取物半成品用C18-硅胶柱常压反相层析 精制，可以用简单的操作步骤，就可以得到高纯度的紫杉醇。在C18-硅胶柱反相层析中，采 用提取物半成品溶液每次加入量为2?2. 5mg紫杉醇每克固定相的量，可以得到最好的提 纯效果。高纯度的提取物可以应用于紫杉醇制剂中。与现有技术相比，本发明的应用于紫 杉醇制剂的植物提取物具有紫杉醇含量高、纯度高、杂质少等的特点。本发明的应用于紫杉 醇制剂的植物提取物的制备方法具有紫杉醇回收率高、提取纯化操作简便、生产成本低、节 能环保等特点。
[0017]
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对本发明的实施方案作详细的说明。应当理解，本发明的实 施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发 明的保护范围。
[0019] 实施例1 将红豆杉枝叶洗净去除其他杂物，经50°C低温干燥，控制水份在10%以下，用粉碎机粉 碎为100目的粉末。将10千克红豆杉枝叶粉末均匀地填充到浸提容器内，每次加入40千克 的丙酮和乙酸乙酯(丙酮和乙酸乙酯的体积比为1 :〇. 8)的混合溶剂在超声波辅助下提取， 浸提温度为35°C，浸提时间为2小时/次，浸提3次，合并浸提液。将合并的浸提液在温度 50度，在真空度0. 〇9MPa条件下进行浓缩，回收溶剂，得到红豆杉浓缩提取物浸膏1450克， 提取物浸膏中紫杉醇的含量为〇. 083%。
[0020] 将提取物浸膏用1倍提取物浸膏重量的三氯甲烷搅拌溶解，再加入1倍提取物浸 膏重量的纯化水，搅拌15-30分钟，静置分层4小时，回收有机相，水层再加入提取物浸膏重 量1倍的三氯甲烷萃取两次，合并有机相。有机相减压浓缩回收三氯甲烷，得到提取物粗品 70. 20克，提取物粗品中紫杉醇浓度为1. 68%。
[0021] 将提取物粗品分批用10倍提取物粗品重量的三氯甲烷进行溶解，溶解完全后备 用。先往碱性氧化铝（200-300目）固定相柱中依次加入甲醇、三氯甲烷并抽干，进行活化。 接着将溶有提取物粗品的三氯甲烷加到柱中，停留时间为30分钟，抽干。然后用三氯甲烷 淋洗并抽干，用三氯甲烷和甲醇的混合淋洗剂(体积比98 :2)淋洗并抽干。再在淋洗好的柱 子中加入三氯甲烷和甲醇的混合洗脱剂(体积比95:5)，收集洗脱液。重复以上步骤，合并 洗脱液，将合并的洗脱液减压浓缩，得到提取物半成品7. 76克，提取物半成品中紫杉醇浓 度为15. 2%。
[0022] 将提取物半成品分批用3倍提取物半成品重量的乙腈水溶液（乙腈和纯化水的体 积比40 :60)溶解，溶解完全后备用。先将C18-硅胶柱用乙腈充分洗出固定相中的杂质，再 用体积比40 :60的乙腈水溶液平衡。将提取物半成品溶液按2. 5mg紫杉醇每克固定相的量 加到C18-硅胶柱中，再用体积比50 :50的乙腈水溶液洗脱，收集洗脱液。重复以上步骤，合 并洗脱液，将合并的洗脱液在40°C下减压浓缩析出结晶，抽虑出结晶后再用乙醇溶解进行 重结晶，最后抽虑出结晶并于40°C真空干燥，得到高纯度的提取物1.06克，提取物中紫杉 醇浓度为99. 6%。
[0023] 实施例2 将红豆杉枝叶洗净去除其他杂物，经60°C低温干燥，控制水份在10%以下，用粉碎机粉 碎为120目的粉末。将10千克红豆杉枝叶粉末均匀地填充到浸提容器内，每次加入50千 克的丙酮和乙酸乙酯(丙酮和乙酸乙酯的体积比为1 :1)的混合溶剂在超声波辅助下提取， 浸提温度为40°C，浸提时间为1. 5小时/次，浸提3次，合并浸提液。将合并的浸提液在温 度55度，在真空度0. OSMPa条件下进行浓缩，回收溶剂，得到红豆杉浓缩提取物浸膏1433 克，提取物浸膏中紫杉醇的含量为〇. 084%。
[0024] 将提取物浸膏用2倍提取物浸膏重量的三氯甲烷搅拌溶解，再加入1. 5倍提取物 浸膏重量的纯化水，搅拌15-30分钟，静置分层6小时，回收有机相，水层再加入提取物浸膏 重量2倍的三氯甲烷萃取两次，合并有机相。有机相减压浓缩回收三氯甲烷，得到提取物粗 品67. 45克，提取物粗品中紫杉醇浓度为1. 75%。
[0025] 将提取物粗品分批用15倍提取物粗品重量的三氯甲烷进行溶解，溶解完全后备 用。先往碱性氧化铝（200-300目）固定相柱中依次加入甲醇、三氯甲烷并抽干，进行活化。 接着将溶有提取物粗品的三氯甲烷加到柱中，停留时间为35分钟，抽干。然后用三氯甲烷 淋洗并抽干，用三氯甲烷和甲醇的混合淋洗剂(体积比98. 5 :1. 5)淋洗并抽干。再在淋洗好 的柱子中加入三氯甲烷和甲醇的混合洗脱剂(体积比96 :4)，收集洗脱液。重复以上步骤， 合并洗脱液，将合并的洗脱液减压浓缩，得到提取物半成品6. 35克，提取物半成品中紫杉 醇浓度为18. 6%。
[0026] 将提取物半成品分批用5倍提取物半成品重量的乙腈水溶液（乙腈和纯化水的体 积比40 :60)溶解，溶解完全后备用。先将C18-硅胶柱用乙腈充分洗出固定相中的杂质，再 用体积比40 :60的乙腈水溶液平衡。将提取物半成品溶液按2mg紫杉醇每克固定相的量加 到C18-硅胶柱中，再用体积比50 :50的乙腈水溶液洗脱，收集洗脱液。重复以上步骤，合并 洗脱液，将合并的洗脱液在45°C下减压浓缩析出结晶，抽虑出结晶后再用乙醇溶解进行重 结晶，最后抽虑出结晶并于40°C真空干燥，得到高纯度的提取物1.06克，提取物中紫杉醇 浓度为99. 7%。
[0027] 实施例3 将红豆杉枝叶洗净去除其他杂物，经55°C低温干燥，控制水份在10%以下，用粉碎机粉 碎为110目的粉末。将10千克红豆杉枝叶粉末均匀地填充到浸提容器内，每次加入45千克 的丙酮和乙酸乙酯(丙酮和乙酸乙酯的体积比为1 :〇. 9)的混合溶剂在超声波辅助下提取， 浸提温度为45°C，浸提时间为1小时/次，浸提3次，合并浸提液。将合并的浸提液在温度 60度，在真空度0. 〇7MPa条件下进行浓缩，回收溶剂，得到红豆杉浓缩提取物浸膏1455克， 提取物浸膏中紫杉醇的含量为〇. 083%。
[0028] 将提取物浸膏用1. 5倍提取物浸膏重量的三氯甲烷搅拌溶解，再加入1. 3倍提取 物浸膏重量的纯化水，搅拌15-30分钟，静置分层5小时，回收有机相，水层再加入提取物浸 膏重量1. 5倍的三氯甲烷萃取两次，合并有机相。有机相减压浓缩回收三氯甲烷，得到提取 物粗品69. 04克，提取物粗品中紫杉醇浓度为1. 70%。
[0029] 将提取物粗品分批用12倍提取物粗品重量的三氯甲烷进行溶解，溶解完全后备 用。先往碱性氧化铝（200-300目）固定相柱中依次加入甲醇、三氯甲烷并抽干，进行活化。 接着将溶有提取物粗品的三氯甲烷加到柱中，停留时间为40分钟，抽干。然后用三氯甲烷 淋洗并抽干，用三氯甲烷和甲醇的混合淋洗剂(体积比98. 3 :1. 7)淋洗并抽干。再在淋洗好 的柱子中加入三氯甲烷和甲醇的混合洗脱剂(体积比95. 5 :4. 5)，收集洗脱液。重复以上步 骤，合并洗脱液，将合并的洗脱液减压浓缩，得到提取物半成品6. 99克，提取物半成品中紫 杉醇浓度为16. 8%。
[0030] 将提取物半成品分批用4倍提取物半成品重量的乙腈水溶液（乙腈和纯化水的体 积比40 :60)溶解，溶解完全后备用。先将C18-硅胶柱用乙腈充分洗出固定相中的杂质，再 用体积比40 :60的乙腈水溶液平衡。将提取物半成品溶液按2. 2mg紫杉醇每克固定相的量 加到C18-硅胶柱中，再用体积比50 :50的乙腈水溶液洗脱，收集洗脱液。重复以上步骤，合 并洗脱液，将合并的洗脱液在50°C下减压浓缩析出结晶，抽虑出结晶后再用乙醇溶解进行 重结晶，最后抽虑出结晶并于40°C真空干燥，得到高纯度的提取物1.06克，提取物中紫杉 醇浓度为99. 6%。
[0031] 将干燥的红豆杉枝叶粉碎成100?120目的粉末，有利于紫杉醇的较好提取，实现 最佳效益。用4?5倍丙酮和乙酸乙酯(体积比为1 :0. 8?1)的混合溶剂浸提红豆杉枝叶 中的紫杉醇，可以得到最好的提取效果，紫杉醇在提取物浸膏中的含量最高，而且提取物浸 膏的重量最小。用超声波辅助浸提，可以缩短浸提时间，提高提取效果。浸提次数为3次， 可以实现紫杉醇较完全的提取。用碱性氧化铝固定相柱层析提取物粗品，可以除去大量的 亲水性物质、脂质物质和7-表-紫杉醇，同时紫杉醇可以得到十几倍以上的提纯，紫杉醇的 回收率可以大于100%，获得紫杉醇最高的回收率和纯度。提取物粗品溶液在碱性氧化铝固 定相柱中的停留时间为30?40分钟，可以使7-表-紫杉醇不断转化为紫杉醇，也可以防 止紫杉醇降解。用三氯甲烷和甲醇的混合淋洗剂(体积比为98 :2?98. 5 :1. 5)可以取得最 好的淋洗效果。用三氯甲烷和甲醇的混合洗脱剂(体积比为95 :5?96 :4)可以取得对紫杉 醇的最好洗脱效果，实现紫杉醇最好的回收。将提取物半成品用C18-硅胶柱常压反相层析 精制，可以用简单的操作步骤，就可以得到高纯度的紫杉醇。在C 18-硅胶柱反相层析中，采 用提取物半成品溶液每次加入量为2?2. 5mg紫杉醇每克固定相的量，可以得到最好的提 纯效果。高纯度的提取物可以应用于紫杉醇制剂中。
[0032] 与现有技术相比，本发明的应用于紫杉醇制剂的植物提取物具有紫杉醇含量高、 纯度高、杂质少等的特点。本发明的应用于紫杉醇制剂的植物提取物的制备方法具有紫杉 醇回收率高、提取纯化操作简便、生产成本低、节能环保等特点。
【权利要求】
1. 一种应用于紫杉醇制剂的植物提取物，其特征在于：所述应用于紫杉醇制剂的植物 提取物以干燥粉碎后的红豆杉枝叶为原料，用丙酮和乙酸乙酯的混合溶剂进行浸提，减压 浓缩后得到提取物浸膏，经三氯甲烷-水萃取浓缩后得到提取物粗品，经碱性氧化铝固定 相柱层析，再经C 18-硅胶柱反相层析，最后经乙醇重结晶制得。
2. -种根据权利要求1所述的应用于紫杉醇制剂的植物提取物的制备方法，其特征在 于：该方法包括如下步骤： 步骤1，将红豆杉枝叶洗净，低温干燥后用粉碎机粉碎成粉末，用丙酮和乙酸乙酯的混 合溶剂进行浸提，将浸提液进行减压浓缩，回收溶剂，得到提取物浸膏； 步骤2,将提取物浸膏用三氯甲烷溶解，再加入纯化水，搅拌后静置分层，回收有机相， 水层用三氯甲烷萃取，合并有机相，将有机相减压浓缩回收三氯甲烷，得到提取物粗品； 步骤3,将提取物粗品用三氯甲烷进行溶解，加入到已活化的碱性氧化铝固定相柱中， 抽干，先用三氯甲烷淋洗并抽干，然后用三氯甲烷和甲醇的混合淋洗剂淋洗并抽干，再用三 氯甲烷和甲醇的混合洗脱剂洗脱，将收集的洗脱液减压浓缩，得到提取物半成品； 步骤4,将提取物半成品溶于乙腈水溶液，加入到已平衡好的C18-硅胶柱中，再用乙腈 水溶液洗脱，将收集的洗脱液减压浓缩析晶，抽虑出的结晶再用乙醇溶解进行重结晶，最后 抽虑出结晶，真空干燥后得到高纯度的提取物。
3. 根据权利要求2所述的应用于紫杉醇制剂的植物提取物的制备方法，其特征在于：所 述步骤1中低温干燥的温度为50?60°C，干燥后水份彡10%，粉碎成100?120目的粉末。
4. 根据权利要求2所述的应用于紫杉醇制剂的植物提取物的制备方法，其特征在于： 所述步骤1中丙酮和乙酸乙酯的混合溶剂的重量为红豆杉枝叶粉末的4?5倍，混合溶 剂中丙酮和乙酸乙酯的体积比为1 :〇. 8?1，浸提在超声波辅助下进行，浸提温度为35? 45°C，浸提时间为1?2小时/次，浸提次数为3次。
5. 根据权利要求2所述的应用于紫杉醇制剂的植物提取物的制备方法，其特征在于： 所述步骤1中减压浓缩温度为50?60°C，真空度为0. 07?0. 09MPa。
6. 根据权利要求2所述的应用于紫杉醇制剂的植物提取物的制备方法，其特征在于： 所述步骤2中用于溶解提取物浸膏的三氯甲烷的重量为提取物浸膏的1?2倍，纯化水的 重量为提取物浸膏的1?1. 5倍,静置分层时间为4?6小时。
7. 根据权利要求2所述的应用于紫杉醇制剂的植物提取物的制备方法，其特征在于： 所述步骤2中用于水层萃取的三氯甲烷的重量为提取物浸膏的1?2倍，萃取次数为2次。
8. 根据权利要求2所述的应用于紫杉醇制剂的植物提取物的制备方法，其特征在于： 所述步骤3中用于溶解提取物粗品的三氯甲烷的重量为提取物粗品的10?15倍，提取物 粗品溶液在碱性氧化铝固定相柱中的停留时间为30?40分钟。
9. 根据权利要求2所述的应用于紫杉醇制剂的植物提取物的制备方法，其特征在于： 所述步骤3中混合淋洗剂的三氯甲烷和甲醇的体积比为98 :2?98. 5 :1. 5,混合洗脱剂的 三氯甲烷和甲醇的体积比为95 :5?96 :4。
10. 根据权利要求2所述的应用于紫杉醇制剂的植物提取物的制备方法，其特征在于： 所述步骤4中用于溶解提取物半成品的乙腈水溶液的重量为提取物半成品的3?5倍，乙 腈水溶液中乙腈和纯化水的体积比为40 :60,提取物半成品溶液每次加入量为2?2. 5mg 紫杉醇每克固定相，洗脱用的乙腈水溶液中乙腈和纯化水的体积比为50 :50。
【文档编号】C07D305/14GK104211667SQ201410371839
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】傅苗青, 张倩 申请人:大生祥(武汉）中医投资管理有限公司