专利名称：20个x-snp位点多色荧光复合检测的分型方法
技术领域：
本发明涉及医学亲缘关系鉴定技术领域。
背景技术：
X染色体具有伴性遗传和交叉遗传的独特的遗传学特征，对于解决法医实践中的父女鉴定、母子鉴定、姐妹鉴定、同父异母姐妹鉴定、隔代鉴定等复杂亲缘关系鉴定，具有十分重要的意义。目前法医DNA检测主要针对短串联重复序列(short tandem repeats,STR)以及单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)分型。复合扩增体系中，STR的扩增片段一般较大，不利于降解检材的分析，同时一些常用的STR基因座突变率较高，使亲子鉴定面临错判的风险。而SNP具有分布广泛，易于开展高通量自动化分型等优点，可以在短至45-55bp (变异位点两侧引物序列长度)的扩增片段内分型，更适于降解检材的分析，同时SNP的突变率低，对法医亲缘关系鉴定更有价值，因此SNP在法医学领域具有广阔前景。亲缘关系鉴定是司法实践中的重要内容之一。目前应用常染色体遗传标记作为进行检测，基本能够解决大部分亲缘关系鉴定案例。但对于一些特殊案例，如祖母与孙女的亲祖关系鉴定、同父异母姐妹的半同胞关系鉴定、同胞鉴定、以及涉及父女及母子的单亲关系鉴定，就需要借助于X染色体遗传标记的分型技术。X染色体的遗传特征表现为伴性遗传和交叉遗传。男性个体X染色体每个基因座显现一条等位基因片段，来自母亲并传递给女儿，女性个体X染色体每个 基因座显示两条等位基因片段，一条来自父亲，一条来自母亲。因此，在判定上述这些较复杂的亲缘关系中，X染色体遗传标记可以提供一些特殊的信息，作为常染色体遗传标记的重要补充。
发明内容
本发明提供一种20个X-SNP位点多色荧光复合检测的分型方法，使待测靶DNA的片段范围缩短至61 99bp，提高对高度降解DNA分型的成功率，能够解决亲祖关系、半同胞关系、同胞关系等复杂未缘关系鉴定的难题。对复杂未缘关系鉴定以及闻度降解检材DNA的法医学分型方面具有很大的优势和潜力。本发明所采取的技术方案是:
20个X-SNP位点多色荧光复合检测的分型方法，包括下述步骤:
(1)DNA溶液的制备:提取DNA，制备DNA溶液；
(2)扩增:在扩增体系中加入步骤(I)所得的DNA溶液，然后在扩增仪中进行扩增，扩增条件为:95°C、5min预变性；然后依次在95°C、30s，58°C、30s，65°C、30s，进行30个循环；再在65°C保持7min ;最终在4°C保存，获得扩增产物；所述扩增体系包括:PCR缓冲溶液、MgCl2、dNTPs、PCR 引物、Taq DNA 聚合酶、模板 DNA ；
(3)纯化扩增产物:应用核酸外切酶I和虾碱性磷酸酶纯化扩增产物，纯化反应条件:37°C、lh，然后80°C、15min，最终在4°C保存，得纯化后的扩增产物；(4)延伸反应:将纯化后的扩增产物加入至延伸反应试剂中进行延伸反应；延伸反应的条件:依次在96°C、10s，50°C、5s，6(rC、30s进行25个循环，最终保存在4°C，得延伸产物；所述的延伸反应试剂为延伸引物和SNaPshot反应混合液；
(5)纯化延伸产物:将延伸产物加入至虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液的混合液中，在下列条件下进行纯化反应:37°C、lh，80°C、15min，最终保存在4°C，得纯化后的延伸产物；
(6)检测、确定延伸产物
将步骤(5)中得到的纯化后的延伸产物中加入至测试试剂中，混匀；检测条件:15000V电压，36cm毛细管，P0P4凝胶，电泳20min ;最后根据延伸产物峰的位置和颜色确定20个X-SNP位点的基因型；所述的测试试剂为H1-Di甲酰胺和GeneScan Size Standards-120LIZ ；
其中，步骤(2 )中同时复合扩增包含20个X-SNPs位点的DNA片段。所述的PCR引物和延伸引物由20个X-SNP位点的引物组成，所述20个X-SNP位点在 NCBI 中 SNP 数据库的 rs 号分别为 rs5916197, rs757018, rs2071182, rs5951622,rs4898214, rs5963947, rs5906341, rs4826645, rs3860291, rs5912774, rsl988916,rs5941046, rs4463614, rs5916844, rs6568051, rs2522169, rs5930646, rs5929739,rs5908051，rs6627351 ；
20个X-SNP位点的PCR弓丨物和延伸弓丨物的序列见表I。根据NCBI的SNP数据库(dbSNP )提供的DNA序列，设计20个X-SNP位点的PCR引物，PCR引物长度18 28个碱基，扩增产物长度61 99bp，各位点单独扩增退火温度59°C，GC含量:35.7_55%。又设计了延伸引物，延伸引物的3’末端位于多态性位点的上游I个碱基处，延伸引物与模板DNA互补部分的特异性引物长度18 26个碱基。同一反应管中，检测相同突变的延伸引物长度相差3 12个碱基，为了改变引物的长度，区分不同的位点，在特异性引物的5’端加“加尾”序列为“poly-CT” 序列和 “5' -AACTGACTAAACTAGGTGCCACGTCGTGAAAGTCTGACAA-3' ” 序列。表I 20个X-SNP位点的PCR引物和延伸引物的序列表
权利要求
1.一种20个X-SNP位点多色荧光复合检测的分型方法，其特征在于包括下述步骤: (1)DNA溶液的制备:提取DNA，制备DNA溶液； (2)扩增:在扩增体系中加入步骤(I)所得的DNA溶液，然后在扩增仪中进行扩增，扩增条件为:95°C、5min预变性；然后依次在95°C、30s，58°C、30s，65°C、30s，进行35个循环；再在65°C保持7min ;最终在4°C保存，获得扩增产物；所述扩增体系包括:PCR缓冲溶液、MgCl2、dNTPs、PCR 引物、Taq DNA 聚合酶、模板 DNA ； (3)纯化扩增产物:应用核酸外切酶I和虾碱性磷酸酶纯化扩增产物，纯化反应条件:37°C、lh，然后80°C、15min，最终在4°C保存，得纯化后的扩增产物； (4)延伸反应:将纯化后的扩增产物加入至延伸反应试剂中进行延伸反应；延伸反应的条件:依次在96°C、10s，50°C、5s，6(rC、30s进行25个循环，最终保存在4°C，得延伸产物；所述的延伸反应试剂为延伸引物和SNaPshot反应混合液； (5)纯化延伸产物:将延伸产物加入至虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液的混合液中，在下列条件下进行纯化反应:37°C、lh，80°C、15min，最终保存在4°C，得纯化后的延伸产物； (6)检测、确定延伸产物 将步骤(5)中得到的纯化后的延伸产物中加入至测试试剂中，混匀；检测条件:15000V电压，36cm毛细管，P0P4凝胶，电泳20min ;最后根据延伸产物峰的位置和颜色确定20个X-SNP位点的基因型；所述的测试试剂为H1-Di甲酰胺和GeneScan Size Standards-120LIZ ； 所述的PCR引物和延伸引物由20个X-SNP位点的引物组成，所述20个X-SNP位点在 NCBI 中 SNP 数据库的 rs 号分别为 rs5916197，rs757018, rs2071182, rs5951622,rs4898214, rs5963947, rs5906341, rs4826645, rs3860291, rs5912774, rsl988916,rs5941046, rs4463614, rs5916844, rs6568051, rs2522169, rs5930646, rs5929739,rs5908051, rs6627351 ;所述20个X-SNP位点的PCR引物及延伸引物序列为:
2.根据权利要求1所述的20个X-SNP位点多色荧光复合检测的分型方法，其特征在于所述步骤(2)中同时复合扩增包含20个X-SNP位点的DNA片段。
全文摘要
本发明公开了一种20个X-SNP位点多色荧光复合检测的分型方法，属于医学亲缘关系鉴定技术领域。其包括下述步骤(1)DNA溶液的制备；(2)扩增；(3)纯化扩增产物；(4)延伸反应；(5)纯化延伸产物；(6)检测、确定延伸产物。本发明使待测靶DNA的片段范围缩短至61～99bp，提高对高度降解DNA分型的成功率，能够解决亲祖关系、半同胞关系、同胞关系等复杂亲缘关系鉴定的难题。对复杂亲缘关系鉴定以及高度降解检材DNA的法医学分型方面具有很大的优势和潜力。
文档编号C12Q1/68GK103215360SQ20131012517
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月12日 优先权日2013年4月12日
发明者丛斌, 李淑瑾, 王茜 申请人:河北医科大学