专利名称：一种用于检测弯曲菌的荧光定量pcr方法及其专用引物和探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测弯曲菌的荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该引物和探针进行弯曲菌荧光定量PCR检测方法。
背景技术：
弯曲菌是全球范围内引发胃肠炎的主要食源性病原菌，能引起散发性和地方流行性胃肠炎的爆发，是全球公共卫生关注的重点。特别是在缺陷性的个体，如癌症病人、艾滋病人、糖尿病人、小孩和老人等，5岁以下儿童的发病率最高，另外，特定血清型空肠弯曲菌感染后能诱发格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome, GBS)。近些年来,弯曲菌感染率在世界各地普遍呈上升趋势，据美国国家食品网的监测，弯曲菌是发病率最高的病原菌，其病例数已超过李斯特菌病、沙门菌病和志贺氏菌病。弯曲菌作为致病菌检测的一项重要指标，在公共卫生、食品安全、畜牧兽医和出入境检验检疫中均是检测的项目，有重要的社会、经济意义。长期以来人们对弯曲菌的检测主要是依靠分离培养法。弯曲菌是兼性微需氧菌，培养条件苛刻，对氧气比较敏感，只能在低氧环境中生长，培养周期较长等特点，采用不同的检验程序、方法，报告结果差异较大，确诊检验结果至少需10-20天，检验方法存在繁琐、费时费力、特异性低等缺陷。荧光定量PCR Taqman探针法具有快速、高度特异性、重复性好、灵敏度高等特点，能大大提高检测的灵敏度、特异度，同时根据标准曲线能够确诊弯曲菌的感染以及确定样品中污染数量。因此，基于分子生物学技术的荧光定量PCR方法，能够快速特异、敏感、高效的对样品进行检测，对快速检测样品中的弯曲菌具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供用于检测弯曲菌的特异性引物和探针；本发明的另一个目的在于提供检测弯曲菌的荧光定量PCR方法。为实现上述目的，本发明首先对NCBI已公布的弯曲菌，用BLAST对肠道病原菌的16srRNA基因的DNA序列进行比对，在其可变区设计了特异性序列的引物，以及与所述引物配合使用的荧光探针。其中探针的5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团Eclipse。在本发明的一个实施方式中，优先的引物序列为:上游引物:GATTATCAAGTCTCTTGTGA(SEQ ID N0.1),下游引物:ATGGGTATTCTTGGTGATA(SEQ ID N0.2)。探针序列为:
FAM-ACCACCAATTCCATCTGCCTCT-Eclipse。本发明提供一种弯曲菌的实时荧光定量PCR检测方法，包括以样品总DNA为模板，利用本发明提供的引物和探针进行荧光定量PCR，同时设立无模板对照和阳性对照，根据荧光信号到达设定域值时所经历的循环数(Ct值)判定结果。
本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为20μ I反应体系时，其扩增体系为:
权利要求
1.一种用于弯曲菌荧光定量PCR检验方法的特异性引物，其核苷酸序列为: 上游引物:GATTATCAAGTCTCTTGTGA， 下游引物:ATGGGTATTCTTGGTGATA。
2.一种用于弯曲菌的荧光定量PCR检验方法的荧光探针，其核苷酸序列为:FAM-ACCACCAATTCCATCTGCCTCT-Eclipse。
3.一种弯曲菌的荧光定量PCR检验方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求I所述的引物和权利要求2所述荧光探针进行荧光定量PCR，同时设立无模板对照和阳性对照，根据荧光信号到达设定域值时所经历的循环数Ct值判定结果。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR反应总体系为20μ1，体系组成为Ex Taq ,2XDRR039A 为 10 μ I ；ROX Reference Dye II, 50X 为 0.4 μ 1，上、下游浓度均为0.2 μ Μ，探针浓度为0.25 μ Μ，弯曲菌基因组DNA为2 μ I，剩余用灭菌ddH20补足；PCR反应程序为:95°C变性30s，以95°C 5s 60°C 34s扩增40个循环，并收集荧光信号。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，判定标准为: Ct值< 35.0时样品结果为阳性； Ct值≥40.0时样品结果为阴性； Ct值在35.0-40.0之间时，样品需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测弯曲菌的荧光定量PCR方法及其专用引物和探针，所述引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。探针序列为FAM-ACCACCAATTCCATCTGCCTCT-Eclipse。所述弯曲菌的荧光定量PCR检验方法，以样品总DNA为模板，利用上述的引物和探针进行荧光定量PCR，同时设立无模板对照和阳性对照，根据荧光信号到达设定域值时所经历的循环数Ct值判定结果。本发明具有灵敏度高、特异性强、重复性好的优点。
文档编号C12Q1/68GK103160610SQ20131012493
公开日2013年6月19日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者焦新安, 黄金林, 朱佳琪, 耿士忠, 孙林 申请人:扬州大学