专利名称：一种前列腺癌生物标志物miR-126-5P、诊断试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种前列腺癌生物标志物miR-126-5P、诊断试剂盒及应用，尤其涉及前列腺癌分子标志物miR-126-5P在前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的鉴定、前列腺癌治疗状况的监测、前列腺癌指导用药的监测、和前列腺癌预后监测等领域用试剂中的应用。
背景技术：
MicroRNA (miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链微小RNA分子，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。MicroRNA因其高度的保守性、时空特异性、稳定性以及组织特异性等特点使其优于蛋白质、DNA片段等其他生物标志物而在疾病发病机制研究、早期诊断、个体化治疗和预后等方面发挥越来越重要的作用。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50岁以后发病，95%发生于60岁以上的老年男性，发生率持续地随年龄增长而增加。在美国，前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害男性健康的肿瘤。中国等亚洲前列腺癌的发病率远远低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势。前列腺癌早期多无任何症状，即使有所不适，也不足以引起病人的重视。当肿瘤增大压迫尿道时，又往往与前列腺增生相混淆。在我国约80%的病人首先发现远处转移病灶，然后才发现前列腺癌。此时，病变已属晚期，预后不良。目前，前列腺癌的临床诊断方式主要有以下几种:直肠指检、血清前列腺特异性抗原(PSA)检测、直肠超声波检测、活组织病理检查等。直肠指检是最简单、最经济实用的方法，主要是通过医生的食指触摸 前列腺，用以发现很多无症状的前列腺癌患者，有可能获得早期诊断及根治的机会。但上述方法均存在一定的局限性。如直肠指检的局限性是:(1)当患者的前列腺肿块不大时，容易漏诊；(2)有的患者前列腺癌肿大不明显，但已属晚期，不易根治；(3)对患者有一定的不适和危害，当患者直肠有疾患时不能使用此检测；(4)当医生经验不足时有漏诊或误诊可能。正常情况下血液中的PSA不高(不高于4ng/ml)，当处于前列腺癌及其他前列腺疾病患病状态时PSA升高，成为目前筛查前列腺癌最敏感的瘤标，但其也存在一定局限性:(1)需要取血检测，对患者有一定的损伤；(2)PSA增高也常见于非前列腺癌疾病，如前列腺炎症、前列腺肥大等，因此不易确诊；(3) PSA增高确诊前列腺癌时，往往患者已属中、后期，达不到早期诊断的目的。前列腺超声波检测操作简便直观、无损伤，通过显示肿块的大小、数目、位置、密度、边缘、形态、有无钙化以及钙化的形态、大小、数目、分步以及周围的晕环、皮肤改变等提供定位及定性征象并判断病变的性质:其局限性是:(1)对致密性的小癌灶容易漏诊；(2)有时不能提供明确的定性诊断；(3)因其不能显示肿瘤的内部结构及周围组织所以诊断符合率很低；(4)对一些缺乏典型征象的实性良恶性肿块有较高的误诊率。活组织病理检查因其创伤性、复杂性不能作为初筛的手段，但它是前列腺癌确诊的金标准，一般与其他方法技术连用。近年来的研究表明，前列腺癌和miRNA密切相关，它们可能参与肿瘤的发生、发展和转移，所以对肿瘤的发病机制、早期诊断、个体化治疗、转移的检测和预后等可能有相应的作用。与前列腺癌相关的miRNA种类较多且作用不一，已有研究表明在前列腺癌患者中上调的 miRNA 包括 miR-375, miR_148a，miR_200c，miR_106a，mir-128,miR-126-5P8，miR-20a，和 miR_30b 等；下调的 miRNA 包括 miR-143，miR-145，miR-199a_5p，miR-223, miR-27a, miR-152和miR-424等。虽然已在该领域进行了一些研究，但现有的miRNA标志物的准确性、灵敏性方面均有不足，在临床和研究中仍然存在寻找更加准确和灵敏的前列腺癌miRNA标志物的需求。在研究过程中发现，miR-126_5P在前列腺癌患者血清中的含量比正常人血清中的含量高，而当前列腺癌患者在接收手术后，其血清中的miR-126-5P的含量就回落到与正常人血清中的含量一样的正常水平。由此可见，患者在患病期间增加的miR-126-5P与前列腺癌的肿瘤存在着密切的相关性。
发明内容
为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种准确性和灵敏性更高的前列腺癌生物标志物miR-126-5P、诊断试剂盒及该生物标志物在前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测中的应用。为了解决上述技术问题， 本发明所采用的技术方案是:一种前列腺癌生物标志物miR-126_5P,其特征在于，所述的miR-126_5P为一种miRNA，miR-126-5P 的核苷酸序列为:SEQ ID N0.15’ -CATTATTACTTTTGGTAC-3’。前述的前列腺癌生物标志物miR-126-5P在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用。前述的前列腺癌生物标志物miR-126-5P在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用，通过检测被试者血清中miR-126-5P的含量，并与正常水平miR-126-5P含量相比较以进行前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测。前述的前列腺癌生物标志物miR-126_5P在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用，所述被试者血清中miR-126-5P的含量通过总RNA提取、加polyA尾、RT-PCR、定量PCR进行检测。应用前列腺癌生物标志物miR-126_5P的诊断试剂盒，其特征在于，包括:血清总RNA提取试剂、RNA加polyA试剂、RT-PCR试剂、定量PCR试剂，所述的定量PCR试剂包括miR-126-5P的特异性正向引物。前述的应用前列腺癌生物标志物miR-126_5P的诊断试剂盒，所述的特异性正向引物的序列为:SEQ ID N0.75’ -UUGAGCAACGCGAACAAAUCA-3 ’。前述的应用前列腺癌生物标志物miR-126_5P的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒中血清总RNA提取试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID N0.2的外源对照-1，为5’ -CAACCTCCTAGAAA GA-3’。前述的应用前列腺癌生物标志物miR-126_5P的诊断试剂盒,所述诊断试剂盒中RNA加polyA试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID N0.3的外源对照-2，为5’_TGAGCAACGCGMCAA-3，。前述的应用前列腺癌生物标志物miR-126_5P的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒中RT-PCR 试剂中包括序列为 SEQ ID N0.4 的 RT-引物，为 5’ -CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN_3’，其中 V 为 A、C 和 G 中的任一种，N 为 A、T、C 和 G 中的任一种。前述的应用前列腺癌生物标志物miR-126_5P的诊断试剂盒,所述诊断试剂盒中定量PCR试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID N0.5 (5，-CTCACAC GACTCACGACAC-3’)的通用反向引物UPM-短片段，和核苷酸序列为SEQ ID N0.6 (5，-CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3’ )的通用反向引物UPM-长片段。本发明为前列腺癌的诊断提供了一种新的分子标志物miR-126_5P，并将该分子标志物应用于制备诊断前列腺癌的诊断试剂盒中，使用该分子标志物及含有该分子标志物的诊断试剂盒诊断前列腺癌，操作简单、取材方便、安全无创伤，且具有高特异性、高灵敏性和易于大量筛查的特点，该分子标志物特别适合应用于前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的鉴定、前列腺癌治疗状况的监测、前列腺癌指导用药的监测和前列腺癌预后监测等领域用试剂中。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。1.血清或血浆中总RNA的提取:
抽取3名前列腺患者手术前7天及手术后7天的血液各2毫升，同时抽取同期3名正常人血液各2毫升作为对照。将上述血液凝血后进行离心，最后取上层血清I毫升置于1.5毫升的无DNA和RNA污染的离心管中。使用北京康为世纪生物科技有限公司生产的RNA提取试剂盒自上述血清中提取总RNA，每250微升血清中加入I微升外源对照-1 (北京旷博生物技术有限公司提供)来监控上述血清中RNA的提取质量。提取的总RNA通过使用Therm NanoDrop2000c分光光度计，测定260/280nm紫外波长的比值进行的浓度测定。所述外源对照_1的序列为5’ -CAACCTCCTAGAAAGA-3’ (SEQ ID NO:2)。2.定量检测血清中的microRNA:I)加 poly (A)尾:在无RNA酶的PCR管(VWR公司生产，200微升)中配制加A尾的反应液，体系总量为20微升。每20微升体系反应液中加入I微升特异的外源对照_2(北京旷博生物技术有限公司提供)来监控miRNA的加尾及反转录质量,所述反应液体系如表I所示。将装有配制好反应液的PCR管放入PCR仪(Thermo)中，在37°C下孵育I小时，得到孵育反应液I。所述外源对照-2的序列为 5’ -TGAGCAACGCGAACAA-3’ (SEQ ID NO:3)。表I加polyA试剂组成
权利要求
1.一种前列腺癌生物标志物miR-126-5P，其特征在于，所述的miR-126_5P为一种miRNA, miR-126-5P 的核苷酸序列为:SEQ ID N0.1 5’ - CATTATTACTTTTGGTAC -3’。
2.权利要求1所述的前列腺癌生物标志物miR-126-5P在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的前列腺癌生物标志物miR-126-5P在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用，其特征在于:通过检测被试者血清中miR-126-5P的含量，并与正常水平miR-126_5P含量相比较以进行前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测。
4.根据权利要求3所述的前列腺癌生物标志物miR-126-5P在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用，其特征在于:所述被试者血清中miR-126-5P的含量通过总RNA提取、加polyA尾、RT-PCR、定量PCR进行检测。
5.应用前列腺 癌生物标志物miR-126-5P的诊断试剂盒，其特征在于，包括:血清总RNA提取试剂、RNA加polyA试剂、RT-PCR试剂、定量PCR试剂，所述的定量PCR试剂包括miR-126-5P的特异性正向引物。
6.根据权利要求5所述的应用前列腺癌生物标志物miR-126-5P的诊断试剂盒，其特征在于，所述的特异性正向引物的序列为:SEQ ID N0.7 5’ -UUGAGCAACGCGAACAAAUCA-3，。
7.根据权利要求5或6所述的应用前列腺癌生物标志物miR-126-5P的诊断试剂盒，其特征在于:所述诊断试剂盒中血清总RNA提取试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID N0.2的外源对照-1。
8.根据权利要求7所述的应用前列腺癌生物标志物miR-126-5P的诊断试剂盒，其特征在于:所述诊断试剂盒中RNA加polyA试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID N0.3的外源对照-2。
9.根据权利要求7所述的应用前列腺癌生物标志物miR-126-5P的诊断试剂盒，其特征在于:所述诊断试剂盒中RT-PCR试剂中包括序列为SEQ ID N0.4的RT-引物，其中V为A、C和G中的任一种，N为A、T、C和G中的任一种。
10.根据权利要求7所述的应用前列腺癌生物标志物miR-126-5P的诊断试剂盒，其特征在于:所述诊断试剂盒中定量PCR试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID N0.5的通用反向引物UPM-短片段，和核苷酸序列为SEQ ID N0.6的通用反向引物UPM-长片段。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种前列腺癌生物标志物miR-126-5P、诊断试剂盒及应用，所述的miR-126-5P为一种miRNA，前列腺癌诊断试剂盒通过检测被试者血清中miR-126-5P的含量，并与正常水平miR-126-5P含量相比较以诊断前列腺癌。本发明为前列腺癌的诊断提供了一种新的分子标志物miR-126-5P，并将该分子标志物应用于制备诊断前列腺癌的诊断试剂盒中，使用该分子标志物及含有该分子标志物的诊断试剂盒诊断前列腺癌，操作简单、取材方便、安全无创伤，且具有高特异性、高灵敏性和易于大量筛查的特点，该分子标志物特别适合应用于前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的鉴定、前列腺癌治疗状况的监测、前列腺癌指导用药的监测和前列腺癌预后监测等领域用试剂中。
文档编号C12N15/11GK103205423SQ201310124988
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者范盘生, 夏东元, 浦金贤 申请人:百瑞德(南京)生物科技有限公司