专利名称：一种检测或诊断前列腺癌的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种检测或诊断前列腺癌的试剂盒。
背景技术：
前列腺癌(PCa)是常见癌症之一，在男性致死癌症中排位第二(Jemal，A. ,Siegel R, Xu J, Ward E.Cancer statistics,2010. CA Cancer J Clin 2010.60(5) :277-300 ;Lu Q，Zhang J and Chen YH. Prostate cancer cell growth and death complex roles of pro-and ant1-oncogenic protein signaling. 2009.1n !Handbook of Prostate Cancer Cell Research(Editor Alan T. Meridith). Nova Science Publishers，Inc. 431-447 ； Hessels D and Schalken JA. The use of PCA3 in the diagnosis of prostate cancer. 2009. Nature Reviews Urology. 6 :255-261)。由于前列腺癌表现的复杂性，早期诊断前列腺癌是困难的。目前临床广泛釆用的筛选方法是检测血清前列腺特异性抗原(PSA)， 数字直肠检查(DRE)和经肠的超声检测(TRUS)。但PSA的关键统计实验表明PSA对PCa 的阳性预测值仅34%，在灰区4-10 μ g/L的患者有25%有隐匿的PCa。PSA浓度< 4 μ g/ L的男性有15%有PCa。而良性前列腺增生(BPH)，其PSA也可以升高，可以导致不必要的病理活组织检查和其它昂贵且不舒服的侵袭性检查介入。作为现在临床釆用的唯一个前列腺癌血清标志物，PSA有明显的不足之处(Hessels D and Schalken JA. The use of PCA3 in the diagnosis of prostate cancer. 2009. Nature Reviews Urology. 6 :255-261)。因此寻找一个简单易行的，使PCa特异性、敏感性、检出率大大增加的标志物，将对PCa的早期发现、诊断和治疗产生深远的影响。尿液生物标记检测是非常有吸引力的，因为这可提供一个简单，非侵袭性的早期前列腺癌检查方法，可以使广泛的人群接受筛选。近年来，有关前列腺癌尿液标记物的发现有了很大的进展。用PCA3(前列 腺癌基因3)非编码mRNA和 TMPRRS2:ERG融合基因技术验证了一个尿液生物标记。可是它们需要前列腺按摩后取尿否则阳性值较低。其它一些尿液生物标记目前正在研究中，包括PCADM-1，肌氨酸，Engrailed 基因，微染色体5蛋白，前列腺特异膜抗原等。一个理想的尿液生物标记必须满足一些重要的标准，即除了能够区别正常组织和癌组织，对前列腺癌病理有科学的支持，并且其检测方法应该简单无痛，应该使临床医生容易对其进行解释。
δ -Catenin/NPRAP/Neuro jungin ( δ -环连蛋白 /NPRAP/ 神经连接蛋白)是 β-catenin 超家族中的一个粘附连接蛋白(Lu，Q，Paredes M，Medina M, Zhou J，Cavallo R，Peifer M，Orecchio L，Kosik KS. delta—catenin，an adhesive junction-associated protein which promotes cell scattering.J Cell Biol,1999. 144(3) :519-532)， 最初鉴定为脑组织中的特异蛋白。然而研究表明，与良性前列腺增生相比，前列腺癌的 δ -catenin mRNA 过度表达(Lu Q，Dobbs LJ, Christopher WG, Lanford GW, Revelo MP, ShappelI S and Chen YH.1ncreased expression of δ -catenin/ neural plakophiI in-related armadillo protein (NPRAP)is associated with the downregulation and redistribution of E—cadherin and pl20ctn in human prostatecancer. 2005. Human Pathology.36 1037-1048 ;Burger，MJ Tebay MA，Keith PA， Samaratunga HM，Clements J，Lavin MF et al. ,Expression analysis of delta—catenin and prostate-specific membrane antigen their potential as diagnostic markers for prostate cancer.1nt J Cancer, 2002. 100(2) :228-237)。组织微阵列研究表明， 前列腺上皮内瘤变中(PIN) δ-catenin表达开始升高，而且与Gleason评分增高相一致， 表明δ-catenin是前列腺癌进展的一个潜在的指标(Lu Q，Dobbs LJ, Christopher WG, Lanford GWiRevelo MP,Shappell S and Chen YH.1ncreased expression of δ -catenin/ neural plakophiI in-related armadillo protein(NPRAP) is associated with the downregulation and redistribution of E—cadherin and pl20ctn in human prostate cancer.2005. Human Pathology. 36 :1037-1048 LuQ and Chen YH. Method of detecting cancer using delta-catenin. United StatesPatent :7，445，906.2008)。
用组织微列阵TMA分析90例前列腺切除后的前列腺癌组织标本和90例正常前列腺组织标本，92%的Cap病人标本显示出强的(46/72)或中度(20/72) δ-catenin染色(免疫评分> 2，72例标本中只有6例(8% )免疫评分阴性或< 2。65例良性标本中有 49例(75% )免疫评分< 2，65例良性标本中有有6例(9% )免疫评分等于2，65例良性标本中有10例(15% )免疫评分高于2。这些资料表明临床上如果单独用δ-catenin作为评价，其敏感性为 91. 7%，特异性为 75. 4% (Lu Q, Dobbs LJ, Christopher WG, Lanford Gff, Revelo MP, Shappell S and Chen YH.1ncreased expression of δ-catenin/ neural plakophiI in-related armadillo protein(NPRAP) is associated with the downregulation and redistribution of E-cadherin and pl20ctn in human prostate cancer. 2005. Human PatholoRY. 36 :1037-1048)。最 近的一个关于人尿液沉淀物的研究显示在人的无细胞尿液前列腺小体中可检测到δ-catenin, PCa病人尿中δ-Catenin显著增加(P < 0. 0005) (8)。这些研究提出一个为PCa病人非侵袭检测的可能性(Lu Q，Zhang J， Allison R,Gay H,Yang WX,Bhowmick N,Frelix G,Shappell S,Chen YH.1dentification of extraceIlular-catenin accumulation for prostate cancer detection. 2009. The Prostate. 69(4) :411-418)。发明内容
本发明的目的在于提供一种简单易行的检测或诊断诊断前列腺癌的试剂盒，其主要包含δ -catenin吸附抗体、包被缓冲液、洗漆缓冲液、封闭缓冲液、δ -catenin检测抗体、酶标抗体。
本发明还提供一种简单易行的检测或诊断诊断前列腺的试剂盒，其主要包含 δ -catenin吸附抗体、包被缓冲液、洗漆缓冲液、封闭缓冲液、δ -catenin检测抗体、纳米量子点标记。
在本发明提供的上述试剂盒中还包含标准品和阴性对照。
其中所述标准品优选为人δ-catenin标准蛋白。所述δ-catenin吸附抗体可为兔抗人，鼠抗人，鸡抗人或其它δ-catenin抗体,使用时所述δ-catenin抗体稀释至蛋白质含量为I 100μ g/mL·
所述包被缓冲液可为碳酸盐或dPBS或其它缓冲剂。
所述洗涤缓冲液优选为含洗涤剂的dPBS或其它缓冲剂。
其中所述δ-catenin检测抗体可为兔抗人，鼠抗人,鸡抗人或其它δ-catenin抗体。优选δ-catenin识别抗体与δ-catenin检测抗体识别不同δ-catenin蛋白序列。
本发明还涉及δ-catenin蛋白在制备检测或诊断前列腺癌的制剂中的应用。
本发明提供的试剂盒，能够从病人尿液中用ELISA方法检测与前列腺癌成高度相关性的δ -catenin蛋白，而且ELISA方法成熟，敏感性和特异性较高，对病人是非侵袭性的，能够重复采取，病人乐于接受。进一步地，纳米量子点(QD)标记法取样量小，将ELISA 方法中所用的抗体与QD结合，能够更灵敏地检测尿液中δ -catenin蛋白的变化，从而用于诊断前列腺癌。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
图1A-1B是ELISA法检测尿液中的δ-catenin蛋白，其中图1A表示纯化标准蛋白 δ -catenin (ng/ml)，图1B 是尿液 δ -catenin 酶联反应。
图2是纳米量子点标记法检测尿液中δ-catenin蛋白。
具体实施方式
本发明提供一种简单易行的检测或诊断前列腺癌的试剂盒，其主要包含 δ -catenin吸附抗体、包被缓冲液、洗漆缓冲液、封闭缓冲液、δ -catenin检测抗体、酶标抗体。或者主要包含S-catenin吸附抗体、包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭缓冲液、 δ -catenin检测抗体、纳米量子点标记。
所述试剂盒还包含标准品和阴性对照。
下述详细说明采用本发明的试剂盒检测或诊断前列腺癌。
本发明所述的人δ-catenin标准蛋白是纯化的重组人δ-catenin蛋白、抗人 δ-catenin 抗体已公开于下述文献Paffenholz R, Franke ffff.1dentification and localization of a neurally expressed member of the plakoglobin/armadiIIo multigene family. Differentiation. 1997Aug ；61 (5) :293-304 ;Lu Q, Paredes M, Medina M, Zhou J, Cavallo R, Peifer M, Orecchio L, Kosik KS. delta-catenin, an adhesive junction-associated protein which promotes cell scattering. J Cell Biol. 1999 Feb 8 ；144(3) :519-32.
实施例1:ELISA法检测尿液中δ -catenin蛋白
步骤1:包被(Coat plate)
用碳酸盐或dPBS包被缓冲液将δ -catenin吸附抗体稀释至蛋白质含量为I ΙΟΟμ g/mL·在每个聚苯乙烯板的反应孔中加100微升，4°C过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗5次，洗板机洗涤。
I)包被缓冲液(碳酸盐缓冲液)
NaCO31. 59 克
NaHCO3 2. 93 克
加蒸馏水至IOOOml
或Dulbecco，s PBS (Invitrogen)
2)洗涤缓冲液
KH2PO4O. 2 克
Na2HPO4 · 12H20 2. 9 克
NaCl 8. O 克
KClO. 2 克
Tween-20 O. 05% 0.5ml
加蒸馏水至IOOOml
步骤2:封闭
每孔加封闭缓冲液200微升，室温下孵育I小时后。用洗板机洗涤。
封闭液(Blockingbuffer)
牛血清白蛋白(BSA) 2克
加洗涤缓冲液至100ml。
步骤3:加样
标准品人δ-catenin标准蛋白。
阴性对照正常健康成年男性尿液标本。
前列腺癌症尿液标本——37例年龄50 80的前列腺癌病人经泌尿科超声初诊和病理确诊Gleason分级7 10。他们的尿液收集后在_20度保存。
每个标本尿液各加100微升，37°C温育2小时后。洗板。
尿液标本也可低温高速(14，000)转离心15分钟，加样沉淀物3孔，尿上清三孔。
步骤4 :加δ -catenin检测抗体用Block液稀释,每孔50微升。洗板。
步骤5 :加酶标抗体(羊抗或其它抗-HRP)(美国Sigma公司)
于各反应孔中，加入新鲜稀释的抗-HRP酶标抗体(美国Sigma公司)。室温孵育 I小时后，洗板机洗涤。
步骤6:显色
于各反应孔中加TMB (Sigma T0440)，室温、避光保存。或上海科华公司显色液A和 B液。
步骤7:终止反应
每孔加H2SO4,终止反应。
步骤8:结果判定
读板机读板。
实验表明，尿液中可用双抗体夹心酶联免疫法测到至少2ng以下δ-catenin。 如图1A-1B所示，其中其中图1A表示纯化标准蛋白δ -catenin (ng/ml),图1B是尿液 δ-catenin酶联反应。从图1B中可以看到,前列腺癌病人尿液δ-catenin可达正常 人的 3倍。运用48例前列腺癌病人尿液与正常人试验鉴定敏感性可达65 85%，特异性可达 90%以上。
实施例2 :纳米量子点标记法检测尿液中δ-catenin蛋白
步骤I至步骤4同实施例1。
步骤5 :纳米量子点标记与步骤4的抗人δ -catenin抗体结合
采用Evident Technologies (Troy,美国纽约)的Evitags纳米量子点水溶。用E DC (l-ethyl-3-[3-dimethyIaminopropyI] carbodiimide)和 sulfo-NHS 在纳米量子点表面形成活性。在多余的EDC and sulfo-NHS用过滤器去除后,加入抗人δ-catenin抗体与纳米量子点形成共价结合。
步骤6:结果判定
如图2所示,纳米量子点标记实验显示,纳米量子点(QD)结合δ-catenin抗体也能测定溶液中的δ-catenin蛋白。
以上的这些试验都证明用δ -catenin抗体结合酶联或结合纳米量子点可检测与前列腺癌成高度相关性的S -catenin蛋白的变化，从而用于诊断前列腺癌。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明。任何人或动物的组织和各种体液中，只要存在可用δ-catenin抗体或δ-catenin抗体与纳米量子点结合体识别的δ-catenin蛋白，则δ-catenin抗体结合酶联或结合纳米量子点便可用于检测。 任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
权利要求
1.一种检测或诊断前列腺癌的试剂盒,其特征在于包含δ-Catenin吸附抗体、包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭缓冲液、S -catenin检测抗体、酶标抗体。
2.一种检测或诊断前列腺癌的试剂盒，其特征在于包含δ-catenin吸附抗体、包被缓冲液、洗漆缓冲液、封闭缓冲液、δ -catenin检测抗体、纳米量子点标记。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，还包含标准品和阴性对照。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品为人δ-catenin标准蛋白。
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述δ-catenin吸附抗体为 δ -catenin 抗体。
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液为碳酸盐或dPBS。
7.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤缓冲液为含洗涤剂的 dPBSo
8.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述δ-catenin检测抗体和 δ -catenin吸附抗体识别不同的δ -catenin蛋白序列。
9.δ -catenin蛋白在制备检测或诊断前列腺癌的制剂中的应用。
全文摘要
本发明提供一种检测或诊断前列腺癌的试剂盒，其包含δ-catenin吸附抗体、包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭缓冲液、δ-catenin检测抗体、酶标抗体。或包含δ-catenin吸附抗体、包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭缓冲液、δ-catenin检测抗体、纳米量子点标记。所述试剂盒能够从病人尿液中用ELISA方法检测与前列腺癌成高度相关性的δ-catenin蛋白，而且ELISA方法成熟，敏感性和特异性较高，对病人是非侵袭性的，能够重复采取，病人乐于接受。纳米量子点(QD)标记法取样量小，将ELISA方法中所用的抗体与QD结合，能更灵敏地检测尿液中δ-catenin蛋白的变化，从而用于诊断前列腺癌。
文档编号G01N33/68GK102998455SQ201210032258
公开日2013年3月27日 申请日期2012年2月14日 优先权日2012年2月14日
发明者曾燕, 钱泽 申请人:昂科生物医学技术(苏州)有限公司