诊断和治疗前列腺癌的方法
【专利说明】诊断和治疗前列腺癌的方法
[0001] 关于联邦政府资助的研究与开发的声明
[000引本发明是根据国家癌症研究所（NCI)授予的基金号NCIK08CA160657由政府资 助进行的。政府具有本发明的某些权利。
[0003] 由子摇香材料的参考并入
[0004] 全部并入本文作为参考的是同期提交的计算机可读的核巧酸/氨基酸序列表，所 述序列表确认如下；一份生成于2013年12月11日，命名为"715739_ST25.TXT"的4, 225 字节ASCII(文本）文件。
【背景技术】
[0005] 前列腺癌是最为常见的恶性疾病，是第二大导致美国男性死亡的疾病（Li 等，Biochim.Bio地ys.Acta, 1704:87-102(2004))。国家癌症研究所（NCI)估计，2013 年美 国诊断出超过230, 000例的新增前列腺癌病例，并且超过29, 000名男性将死于前列腺癌。 前列腺特异性抗原或PSA测试依然被广泛应用于前列腺癌早期检测。虽然PSA测试检测出 无症状男性中所患有的大部分前列腺癌（(Mettlin等，Cancer, 83巧）：1679-1684 (1998a); Mettlin等，Cancer, 82(2) :249-251 (1998b) ;Hump虹巧等，J.化ol.，155:816-820(1996); 和Grossfeld等，Epidemiol.Rev.，23 (1) : 173-180 (2001))，但是PSA检测的特异度 较差，当PSA截止值被设为2. 6ng/mL时，特异度将低至33 % (Thompson等，N.Engl. J.Med.，350:2239-2246 (2004))，虽然灵敏度可高达83 %。PSA检测特异度差的直接原因是 其他前列腺疾病如良性前列腺增生炬PH)和前列腺炎中PSA分泌的增加。因此，PSA水平 升高指示需要进行额外筛查，所述筛查通常W穿刺活检的形式进行。最终，穿刺活检的结果 决定前列腺癌的诊断。每年有超过一百万例前列腺的穿刺活检，每例活检成本约为1500美 元，并且还会引起患者的不适。然而其中只有不到二十万名被诊断为前列腺癌。因此，大部 分穿刺活检是不必要的。
[0006] 目前，临床上有许多诊断标志物被用于区分良性前列腺组织与恶性前列腺组 织，所述标志物包括例如a-甲基酷基-辅酶A消旋酶（AMACR，p504s)狂hou等，Amer. J.SurgicalPathology, 27 (6) : 772 - 778 (2003))和TMPRSS2-ERG融合基因（化等，Cancer Cell, 17(5) :443 - 54(2010))。但是该些标志物缺乏进行持续可靠诊断所需的特异度。相 似地，预后（pro即ostic)标志物（如TMPRSS2-ERG融合基因、PTEN缺失W及SPINK1过表 达）也在评估各种前列腺癌时缺乏特异度，导致相当数量的前列腺癌除了计算癌症格里森 评分外没有更进一步的预后信息。目前还没有已知的生物标记物可W指示已经侵袭进入前 列腺周围软组织的前列腺癌。
[0007] 因此，有必要采用非侵入式方法对前列腺癌进行诊断与预后，并改善前列腺癌的 治疗方法。本发明提供了该种方法。
[0008] 发巧概巧
[0009] 本发明提供了一种抑制前列腺癌细胞增殖的方法，所述方法包括使前列腺癌细胞 与抑制可溶性腺巧酸环化酶（sAC)蛋白活性的物质接触，从而使前列腺癌细胞的增殖受到 抑制。
[0010] 本发明还提供了一种诊断男性对象前列腺癌的方法，所述方法包括；(a)从男性 对象的前列腺获取细胞样品，化）分析所述样品中sAC基因的表达或sAC蛋白的生成，W及 (C)将样品中sAC基因表达水平或sAC蛋白生成水平与对照进行比较，其中与所述对照相 比，所述样品中sAC基因或sAC蛋白的过量表达指示所述男性对象患有前列腺癌。
[0011] 本发明提供了一种为前列腺癌对象选择治疗方案的方法，所述方法包括；(a)从 前列腺癌对象获取前列腺癌细胞样品，化）检测所述样品中sAC基因的表达或sAC蛋白的 生成，（C)将所述样品中sAC基因或蛋白表达的水平与对照进行比较，（d)根据（C)的比较 来预后所述对象的前列腺癌，（e)根据（d)中对所述对象的预后来选择对象的治疗方案，W 及（f)向所述对象提供所述治疗方案。
[00。]附图概巧
[001引图1A显示了使用如下未经处理细胞系的裂解液进行sAC表达的蛋白印迹分析的 数据；PNT2、PC3和LNCaP。图1B显示了在PC3与LNCaP细胞系中使用R40抗体（只识别 "睾丸型"sAC同种型）和R21抗体（识别sAC"睾丸型"和"躯体型"同种型）进行sAC同 种型特异性蛋白印迹分析获得的数据。
[0014]图2显示了sAC抑制剂KH7对前列腺癌细胞增殖的效果实验数据。KH7处理后24 小时对细胞cAMP含量和每皿的细胞数量（起始密度；150, 000个细胞/皿）进行统计分析。 值为平均值 ±SEM(N= 5-8)。* 相比 0ymol/LKH7,P<0. 05。
[00巧]图3A显示了使用sAC特异性或乱序（scrambled)的siRNA处理72小时后（左图） 或使用sAC特异性或乱序（scrambled)shRNA处理72小时后（右图），使用LNCaP细胞裂解 液进行蛋白印迹分析的数据。图3B-D显示了SiRNA或shRNA转染对细胞增殖的影响（图 3B)，细胞培养液中LDH活性（相对单位（r.U.))(图3C)与半脱天冬酶-3切割（图3D)的 实验数据。值为平均值+S.E.(N= 5-6)，* ;相比对照或乱序P<0. 05。蛋白印迹数据代表 了具有相似结果的五个独立实验。
[0016] 图4A-4F显示的实验数据说明了抑制或敲减sAC诱导细胞周期停滞在G2期。图 4A-4C显示了使用流式细胞仪对对照LNCaP细胞、使用sAC抑制剂KH7 (20mol/L)或非活性 类似物KH7. 15 (20mol/L)处理24小时的细胞或者转染sAC-特异性SiRNA或乱序SiRNA的 细胞进行细胞周期统计分析。图4D包括的图和图像分别显示了LNCaP细胞使用sAC抑制剂 KH7处理48小时后G2期细胞群和半脱天冬酶-3切割的时间进程。值为平均值+S.E.(n =8-10)，* ;相比对照或乱序SiRNAP<0. 05。图4E和4F显示了使用对照LNCaP细胞、或者 用KH7处理24小时的细胞或sAC敲减（SiRNA)的细胞的裂解液，对控制细胞周期进程通过 G2/M期和G1/S期检测点的蛋白进行的蛋白印迹分析。处理条件与图4A-4D中描述的条件 类似。所有的蛋白印迹数据代表=到五个具有相似结果的独立实验。
[0017] 图5A-5E显示的实验数据表明sACWPKA非依赖性和EPAC依赖性的方式来控制 增殖和细胞周期。图5A-5C的图显示了每皿细胞数量的统计分析（图5A)、细胞培养基中 的U)H活性（相对单位（r.U.))(图5B)W及G2期细胞群（图5C)。处理（全部均为24 小时）如下；20mol/LKH7,20mol/LKH7. 15，100mol/L8-pCPT-cAMP巧-pCPT)，100mol/LN 6-苯甲酯基-cAMP化-Bnz)，3mol/LH-89,或lOOmol/L(化）-cAMP-S(化cAMP)。值为平均值 ±S.E.(n= 8-11)，* ;相比对照P<0. 05 ;相比KH7P<0. 05。图抓和祀显示了使用LNCaP 细胞裂解液对Rapl(Rapl-GT巧的活性形式和B-Raf的磯酸化形式进行蛋白印迹分析。处 理条件与图5A-5C描述的条件类似。处理进行18小时。所有的蛋白印迹数据代表四到六 个具有类似结果的独立实验。
【具体实施方式】
[0018] 本发明提供了基于可溶性腺巧酸环化酶（sAC)蛋白的表达来抑制前列腺癌 细胞增殖、诊断前列腺癌、W及为前列腺癌患者选择治疗方案的方法。sAC是参与环 AMP(cAMP)生成的可溶性信号酶（见，例如国际专利申请公开版W02001/085753和美国专 利6, 544, 768)。sAC的表达已在角质形成细胞、黑素细胞、单核细胞、小汗腺管和人类皮肤 神经狂i卵in等，J.Invest.Dermatol.，130:1279-1287 (2010年））、W及身体的其他区域中 发现。cAMP介导细胞对营养条件和细胞外信号的应答，并且早已知道cAMP对细胞生长和 增殖会产生刺激效果和抑制效果值umont等，TrendsBiochem.Sci.，14:67-71 (1989);和 Rozengu;rt等，Science, 161-166 (1986))。
[0019]cAMP依赖性信号传导已经被显示在控制细胞增殖和调亡的数个信号传导途径 中发挥作用；然而，还没有很好地确定cAMP信号对增殖和调亡的特异性效果。例如，通过 刺激G蛋白响应的跨膜腺巧酸环化酶（tmAC)或使用cAMP类似物处理来增加细胞内cAMP 的含量已在不同细胞类型中显示能诱导或抑制增殖（参见，例如化chbaum等，J.Biol. Chem. ,283:4464-4468(2008);Misra和Pizzo'J.Cell.Biochem. ,108:998-1011(2009); Hewer等，J.Mol.Cell.Cardiol. ,50:87-98 (2011);和Lucchi等，PLoS 化e，6:e20785(2011))。类似地，已经报道了cAMP信号传导对调亡的多种影响（见，例如 Leone等，Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver化ysiol., 293:G673-681(2007);Rudolph 等，J.Biol.Chem.，279:14828-14834 (2004);Smith等，Blood, 105:308-316 (2005) ;W及 aiang和Insel,J.Biol.Chem.，279:20858-20865 (2004))。该些差异可能是由于细胞类型 或实验模型的差异，或者由于tmAC依赖性信号缺乏特异性。
[0020] sAC依赖的cAMP在调控细胞增殖中的作用尚不清楚。除了在胞质中有定位，sAC 也存在于细胞核中，在那里其通过蛋白激酶A(PKA)依赖性磯酸化来控制核cAMP反应元 件结合蛋白（CREB)转录因子的活性（见，例如Zippin等，FASEBJ.，17:82-84(2003))。 最近的研究还表明当角质形成细胞和黑素细胞从良性细胞转变为癌（如皮肤鱗状细 胞癌和黑色素瘤）时，sAC从细胞质向细胞核迁移（见，例如，Zippin等，J.Invest. Dermatol.，130:1279-1287 (2010);和Magro等，Arch.Dermatol.，148:335-：M4 (2012))。
[0021] 在一个实施方式中，本发明提供了抑制前列腺癌细胞增殖的方法，所述方法包括 使前列腺癌细胞与抑制可溶性腺巧酸环化酶（sAC)蛋白活性的物质接触。术语"前列腺癌" 与术语"前列腺肿瘤（carcinoma)"为同义词，指前列腺组织中形成的癌症。"前列腺癌细 胞"指从前列腺癌中获得