专利名称：Crisp3蛋白在前列腺癌诊断和治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及临床应用领域，具体地说，是CRISP3蛋白在前列腺癌诊断和治疗中的应用。
背景技术：
前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤，95%发生于60岁以上老年人。随着人口老龄化，我国每年有7-8万名前列腺癌新增病例，发病率以每年25%-30%的速度增长，成为发病率增加最快的恶性肿瘤。有关研究提示，如果没有办法控制，10年后前列腺癌患者有可能达到10万人里有60到70个。无疑，前列腺癌已日益成为危害老年男性健康的重大疾病。
前列腺癌早期多无任何症状，当肿瘤增大压迫尿道时，又往往与前列腺增生相混淆。故而，约80%的病人首先发现远处转移病灶，然后才发现前列腺癌。此时，病变已经属晚期，预后不良，生存期短。显然，前列腺癌疗效的保证高度依赖于肿瘤的早期准确诊断。自从1987年以来，血清前列腺特异性抗原(PSA)—直是前列腺癌临床诊断的肿瘤标志物，PSA联合病理诊断有助于前列腺癌临床分期和评估。但是，几十年来时临床诊断实践表明该技术的性能具有明显的局限性，尤其无法做到早期诊断。除了前列腺肿瘤外，前列腺炎和良性前列腺增生也可导致血清PSA升高。另一方面，大约有15% -20 %的前列腺癌患者可显示一个正常的血清PSA值。另一方面，目前临床上对前列腺癌采用的三种经典治疗方法(根治性前列腺切除术、抗雄性激素治疗和放疗)尽管在疾病初期非常有效，但是不能杀死肿瘤组织的所有肿瘤细胞。病人在接受这些经典疗法后，随着时间的推移，残留的、对经典疗法不敏感的肿瘤细胞日后成瘤、迁移、增殖，从而引起前列腺癌的复发、转移及恶化，最终导致病人死亡。目前国内对前列腺癌的研究较少，往往局限于某些特异基因的表达水平。国外的研究已经多年，但前列腺癌抗经典疗法及恶化转移的机制目前尚不清楚。临床上的药物治疗，除了抗雄性激素疗法外，尚无其它有效药物。大多基础研究注重于原癌基因的激活和抑癌基因的失活、生长因子及受体、及调控细胞凋亡的研究。但是到目前为止，尚未开发出特别有效的治疗前列腺癌的药物。前列腺癌个体化诊治也面临能否开发比PSA更可靠的早期检测方法和抗雄性激素疗法之外新的治疗药物等重大课题。CRISP3,富含半胱氨酸分泌蛋白 3 (Cysteine-rich secretory protein 3),属于富含半胱氨酸分泌蛋白CRISP家族。CRISPl和CRISP2与精子发育及精子和卵子融合相关。哺乳动物人类、小鼠、马中CRISP3基本上是唾液腺产物，但在人类中分布相比之下更广泛一些，CRISP3转录物也在其他外分泌腺体和器官中被发现，如胰腺、附睾、卵巢、结肠和骨髓。已经从外周血中性粒细胞中分离纯化CRISP3，其亚细胞定位也被确定，是位于分泌颗粒中。CRISP3也存在于精浆、唾液和血浆中。在精浆中CRISP3和beta微精蛋白(MSMB)结合，MSMB是alphalB糖蛋白(AlBG)的配体，AlBG属于免疫球蛋白超家族。CRISP3在外分泌途径中包括粘液膜和吞噬细胞分泌颗粒上的定位，以及CRISP3在唾液腺和胰腺慢性炎症中上调，提不其可能在免疫系统中起作用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供CRISP3蛋白在制备诊断前列腺癌的产品中的应用。本发明的第二个目的是，提供CRISP3蛋白在制备治疗前列腺癌的药品中的应用。
本发明的第三个目的是，提供CRISP3中和抗体在制备诊断前列腺癌的产品中的应用。本发明的第四个目的是，提供CRISP3中和抗体在制备治疗前列腺癌的药品中的应用
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是CRISP3蛋白在制备诊断前列腺癌的产品中的应用。所述的诊断前列腺癌的产品以CRISP3蛋白作为诊断标记物。所述的诊断前列腺癌的产品是诊断试纸或试剂盒。所述的诊断前列腺癌的产品的诊断样品是前列腺分泌液或前列腺组织。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是CRISP3蛋白在制备治疗前列腺癌的药品中的应用。所述的治疗如列腺癌的药品以CRISP3蛋白作为治疗革巴标。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是CRISP3中和抗体在制备诊断前列腺癌的产品中的应用，所述的诊断前列腺癌的产品以CRISP3蛋白作为诊断标记物。所述的诊断前列腺癌的产品是诊断试纸或试剂盒，所述的诊断前列腺癌的产品的诊断样品是前列腺分泌液或前列腺组织。为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是CRISP3中和抗体在制备治疗前列腺癌的药品中的应用。本发明优点在于
1、本发明发现了诊断前列腺癌的新的诊断标记物，CRISP3在前列腺癌细胞中特异表达，它可作为前列腺液的临床诊断生物标记物，将比目前应用的血液PSA更准确地诊断前列腺癌；
2、本发明发现了前列腺癌的新的治疗靶标，CRISP3直接参与了前列腺癌细胞的分裂、生长，可作为一个新的治疗前列腺癌的靶标。
图I.人前列腺癌样品中CRISP-3的表达水平。图2.人前列腺组织芯片免疫组化。图3.CRISP3分泌蛋白在临床患者前列腺液中的含量。图4.人CRISP3蛋白促进LNCaP细胞的生长。图5.hCRISP3抗体能抑制被CRISP3促进生长的1025细胞的扩增。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例实验一、TaqMan实时定量 RT-PCR 实验材料正常前列腺、前列腺癌样本；
CRISP3 探针 /CRISP3 引物序列Hs00195988_ml (Invitrogen 货号4331182)；
内参(GAPDH)探针序列5’ -TTCCTACCCCCAATGTGTCCGTCGT-3’ (SEQ ID NO. I)；
内参(GAPDH)引物序列5’ -ACTGGCATGGCCTTCCG -3’ (SEQ ID NO. 2),5’ -CAGGCGGCACGTCAGATC -3’ (SEQ ID NO. 3)。实验方法
1.采用RNeasy试剂盒(Qianen,Valencia，CA),从前列腺组织中提取总RNA。运用 TaqMan实时定量RT-PCR技术，检测CRISP3基因的表达水平。选用管家基因GAPDH作为内参。TaqMan实时定量RT-PCR在ABI 7900实时定量PCR仪上进行。另外，采用电泳凝胶方法确定扩增的的PCR产物的特异性(结果未显示)。2.用ACt方法以内参GAPDH的表达水平标准化CRISP3基因的表达水平。每个数据重复三次，计算标准误差。Normal Prostate为正常前列腺；T1-T9为前列腺癌样本。实验结果见图1，图I是CRISP3分泌蛋白在9个前列腺癌样本(Τ1-Τ9)的6个中高表达。与正常前列腺(Normal Prostate)相比，CRISP3表达在前列腺癌样本中可升高5至57倍。实验二、免疫组化
实验材料正常前列腺组织、前列腺癌组织；一抗为羊抗人CRISP3抗体(R&D货号AF2397)，二抗驴抗羊 Dylight594 抗体(Jackson lab 货号705-515_147)。实验方法
组织芯片就是将大量组织样品有序地组合在一个微小基片表面，借助免疫组织化学的方法进行检测。I、将组织用PFA固定液固定5分钟，PBS洗10分钟
2、抗原修复用0.OlM柠檬酸盐溶液暴露抗原决定族。微波炉高火3分钟加热修复液至沸腾(4分钟)，再连续低火微波I分钟、两次。冷却至室温，PBS洗10分钟。用0.5%的Triton破膜10分钟。3、封闭非特异性蛋白
1)PBS浸泡3分钟X3次
2)3% H2O2-甲醇(30% H2O2IOml+甲醇90ml)室温浸泡30分钟
3)自来水冲洗10分钟，PBS浸泡3分钟X3次，甩干或纸巾吸去多余液体(勿碰到组织)，用组化笔在组织周围画上圈(蒸馏水冲洗时间内配好10%封闭血清)
4)在圆圈内组织内迅速滴入5%BSA (用PBS配制)，封闭非特异性抗原(勿让组织干燥，应在纸巾吸掉水后立即加入)，室温30分钟(配好一抗)，扣掉封闭液，不洗。4、一抗孵育
甩去切片上的BSA，用滤纸擦干组织周围残留BSA，直接加入已稀释的羊抗人CRISP3抗体(约60μ 1)，放入湿盒中4°C过夜。第二天从冰箱中取出需37 °C复温30 min。5、二抗孵育I)将一抗洗掉，将玻片插入塑料玻片架，然后整个放入塑料盒中，加PBS浸泡放于微型振荡器上洗10分钟。2) 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入二抗驴抗羊Dylight594抗体，室温30分钟。3)加PBS浸泡放于微型振荡器上洗10分钟。6、封片
纸巾吸除多余液体，在玻片上滴管滴加DAPI封片液一滴,然后盖上盖玻片，用镊子轻轻挤压，并赶走气泡，(组织部位切勿残留小气泡)，室温放置I小时。观察。实验结果见图2，组织芯片免疫组化染色显示CRISP3分泌蛋白在49个前列腺癌组织的31个中呈明显阳性，而在正常组织中为阴性。实验三、酶联免疫吸附实验(Elisa)
实验材料CRISP3标准液(R&D货号2397-CR)、CRISP3羊抗体(R&D货号AF2397)、抗羊抗体(R&D货号HAF017)、底物(包括A和B) (R&D货号DY999)
实验方法
I. 制作标准曲线准备浓度为200ng/ml的CRISP3蛋白标准液，依次稀释成20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2. 5ng/ml>I. 25ng/ml、0. 625ng/ml、0. 312ng/ml 的溶液。2. 抗原包被取洁净的聚苯乙烯微量酶标板，于每孔内加标准品或待测样品抗原100 μ L，放置室温2小时。用PBST洗2次。3. 封闭加200μ L封闭液(1%BSA/PBS)于4°C封闭过夜。每孔，用200 μ LPBST洗2次。4. 一抗按1:200稀释加入一抗100 μ L，放置室温孵育2小时。用200 μ LPBST洗4次。5. 二抗按1:500稀释加入酶标二抗100 μ L，放置室温孵育I小时。用200μ LPBST 洗 4 次。6.加底物显色加现配的底物液(由A和B以I: I比例配制)100 μ L，置暗处在室温下15分钟。加2Ν硫酸50 μ L终止反应。观察结果在酶标仪450nm下测OD值,参照标准曲线计算,确定样品中CRISP3蛋
白的含量。实验结果见图3，图3是CRISP3分泌蛋白在临床患者前列腺液中的含量。与正常、前列腺炎、PSA升高但不是恶性肿瘤患者相比，前列腺癌病人前列腺液中的CRISP3含量成明显升高趋势。实验四、细胞增殖抑制实验
实验材料293细胞系(非前列腺癌细胞系)、LNCaP细胞系(前列腺癌细胞系)、CRISP3蛋白(R&D 货号2397-CR)。实验方法
I.使用96孔板，每个孔中4000个LNCaP细胞，同时加入不同浓度的CRISP3蛋白液；用293细胞做对照。2. 24小时后加入3H标记的胸腺嘧啶。继续培养21小时。用胰蛋白酶在37°C下消化f 3分钟，收获细胞。
3.采用TOPO Count微板液闪计数仪测量3H标记。每数据从5至24个培养孔测量值平均得到，计算标准误差，双尾T检验结果。实验结果见图4，不同浓度的CRISP3添加于LNCaP前列腺癌细胞系培养基中，均可促进前列腺癌细胞生长。前列腺癌细胞生长与3H胸腺嘧啶的参入量呈正比。293上皮细胞作为阴性对照，其生长不受CRISP3影响。实验五肿瘤细胞增殖实验 实验材料
1025前列腺癌细胞系；
Abl:鼠抗人CRISP3单克隆抗体(R&D货号=295203)；
Ab2:羊抗人CRISP3单克隆抗体(R&D货号AF2397)；
Ab3:鼠抗人CRISP3单克隆抗体(R&D货号295220)；
Ab4:鼠抗人CRISP3单克隆抗体(R&D货号295208)；
实验方法
1.使用96孔板，每个孔中4000个1025细胞，培养24小时
2.设计四组实验
1)空白对照组
2)仅添加不同来源的CRISP3抗体细胞增殖情况与对照组相比没有显著变化。3)加入人CRISP3蛋白液组细胞增殖明显，且与对照组有显著差异；
4)加入人CRISP3蛋白液和不同来源CRISP3抗体细胞的增殖与对照组相比明显抑制。3. 24小时后加入3H标记的胸腺嘧啶。继续培养21小时。用胰蛋白酶在37°C下消化f 3分钟，收获细胞。4.采用TOPO Count微板液闪计数仪测量3H标记。每数据从5至24个培养孔测量值平均得到，计算标准误差，双尾T检验结果。实验结果见图5，不同来源的CRISP3抗体添加于1025前列腺癌细胞系，阻断CRISP3，可不同程度地抑制由外源CRISP3引起的前列腺癌细胞生长。本发明的研究结果显示CRISP3在前列腺癌组织中比正常前列腺表达高出63倍(图I);组织芯片免疫组化分析表明CRISP3在多数前列腺癌中明显阳性(图2)，而在正常实体组织中，只在唾液腺和乳腺中表达；CRISP3在多数前列腺癌临床样本中高表达(图3)；CRISP3在多数LuCaP移植瘤中高表达。这些实验结果证明CRISP3可作为诊断和治疗新靶点的一个候选生物标记物。采用基因芯片及生物统计学，对前列腺癌组织与其相邻非癌正常组织分析比较，CRISP3基因在前列腺癌细胞中特异高表达(图1，3)。更重要的是，本发明进一步的实验显示CRISP3可促进前列腺癌细胞生长(图4)，阻断CRISP3可抑制前列腺癌细胞生长(图5);这是目前文献中尚无报道的。在本发明中CRISP3除了和前列腺癌之间具备相关性之外，与肿瘤的发展发生也是相关的。CRISP3不仅是诊断靶标，而且还可以作为治疗的靶点。本发明采用纯化的CRISP3蛋白和CRISP3过表达质粒，在前列腺癌细胞系上观察细胞分裂、细胞迁移和细胞侵润，并采用抗体，在CRISP3过表达的前列腺癌细胞系和已成功传代、高表达CRISP3的临床前列腺癌标本LuCAP35 (图5)上，体外观察细胞分裂、迁移和侵润；移植瘤后体内观察成瘤、迁移和侵润。CRISP3中和抗体除用于本研究项目外，该抗体对前列腺癌诊断及治疗的效果将可以造福广大患者，并且产生巨大的社会经济效益。总结本发明，CRISP3在前列腺癌细胞中特异表达，它可作为前列腺液的临床诊断生物标记物，将比目前应用的血液PSA更准确地诊断前列腺癌。同时，CRISP3直接参与了 前列腺癌细胞的分裂、生长，可作为一个新的治疗前列腺癌的靶标。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.CRISP3蛋白在制备诊断前列腺癌的产品中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的诊断前列腺癌的产品以CRISP3蛋白作为诊断标记物。
3.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的诊断前列腺癌的产品是诊断试纸或试剂盒。
4.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的诊断前列腺癌的产品的诊断样品是前列腺分泌液或前列腺组织。
5.CRISP3蛋白在制备治疗前列腺癌的药品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的治疗前列腺癌的药品以CRISP3蛋白作为治疗靶标。
7.CRISP3中和抗体在制备诊断如列腺癌的广品中的应用，所述的诊断如列腺癌的广品以CRISP3蛋白作为诊断标记物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的诊断前列腺癌的产品是诊断试纸或试剂盒，所述的诊断前列腺癌的产品的诊断样品是前列腺分泌液或前列腺组织。
9.CRISP3中和抗体在制备治疗前列腺癌的药品中的应用。
全文摘要
本发明涉及CRISP3蛋白在制备诊断和治疗前列腺癌的产品中的应用。本发明还提供CRISP3中和抗体在制备诊断和治疗前列腺癌的产品中的应用。本发明优点在于本发明发现了诊断前列腺癌的新的诊断标记物，CRISP3在前列腺癌细胞中特异表达，它可作为前列腺液的临床诊断生物标记物，将比目前应用的血液PSA更准确地诊断前列腺癌；本发明发现了前列腺癌的新的治疗靶标，CRISP3直接参与了前列腺癌细胞的分裂、生长，可作为一个新的治疗前列腺癌的靶标。
文档编号A61P35/00GK102914658SQ20121040958
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者高维强 申请人:高维强