专利名称：一对近江牡蛎体内类立克次体 pcr检测用的特异引物的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物的检验技术，具体涉及类立克次体微生物PCR检测用的特异引物。
背景技术：
近江牡蛎体内寄生的类立克次体被证明是引起近江牡蛎大规模死亡的重要病原微生物，目前还没有有效的治疗措施。为此，迫切需要建立针对近江牡蛎体内寄生的类立克次体的快速、简便、灵敏的检测方法。以便在疾病发生前发现苗头时，能及时在大规模死亡爆发前采取适当的措施，有助于降低由于大规模死亡而造成的损失。PCR技术是一种简便快捷准确的检测方法，它可以很灵敏的检测到只有几个拷贝的基因的存在。套式PCR技术就是采取套嵌的引物组进行多次的PCR使得低丰度的基因在模版中的比例提高，从而更加灵敏的检测出低丰度的基因。但PCR检测技术的关键是要获得特异的序列片断，将这个片断用作PCR扩增的特异引物。
发明内容
本发明的目的就是要提供对近江牡蛎体内寄生的类立克次体微生物进行PCR检测用的特异引物。
细菌的16SrRNA目前在国际上被作为细菌分类的分子生物学依据，同时也作为PCR技术检测微生物的主要目的片断。由于16SrRNA本身不含有内含子，因此可以通过直接扩增对应的DNA模版获得。在这里，这种模板被称为16SrDNA。本发明人通过一系列的实验获得并验证了近江牡蛎类立克次体16SrDNA的核酸序列。
近江牡蛎类立克次体16SrDNA核酸序列如下1 gcttaacaca tgcaagtcga gcggtaacag gaagagcttg ctctttgctg acgagcggcg61 gacgggtgag taacgcgtag gaatctgact gtaagagggg gatagcccgg agaaatccgg121 attaataccg cataacacct aagggtaaaa agaggcactt gtgctactgc ttacagagga181 gcctgcgttg gattagctag ttggtggggt aaaggcttac caaggcgacg atccatagct241 gctctgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg301 cagcagtggg gaatattgca caatggggga aaccctgatg cagccatgcc gcgtgtgtga361 agaaggcttt cgggttgtaa agcactttca gtggtgagga aaggtagtct gtgaataatg
421 ggctactgtg acgttagcca cagaagaagg accggcaaac tccgtgccag cagccgcggt481 aatacggagg gtccgagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagggtgcg taggcggata541 tgtaagtggg tagtgaaaga cctgggctca acctgggagg tgctatccaa actgcataac601 tagagtacag aagaggagtg tggaatttcc tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatagga661 aggaacaccg gtggcgaagg cggcactctg gtctgatact gacgctgagg tacgaaagcg721 tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgct gtaaacgctg tctactagtc781 gttgggaact taaaagtttt tagtggcgaa gcaaacgcgc taagtagacc gcctggggag841 tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat901 gtggtttaat tcgacgcaac gcgaagaacc ttacctggtt ttgacatcct cggaatggcg961 aagagatttg ccagtgcctt cgggagccga gtgacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct1021 cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatcc ttatttgcca1081 gcatgtaaag atgggaactc taaggagact gccggtgaca agccggagga aggtggggac1141 gacgtcaagt catcatggcc cttacgacca gggctacaca cgtgctacaa tggggcgtac1201 aaagggaagc gaagcggtga cgtggagcca aacctatcaa agcgcctcgt agtccggatc1261 gcagtctgca actcgactgc gtgaagtcgg aatcggtagt aatc结合生物信息学手段，从上述核酸序列中筛选出一对针对近江牡蛎体内寄生的类立克次体的特异性引物。本套式PCR检测近江牡蛎类立克次体的技术就是采用细菌通用引物进行第一次扩增，扩大细菌16SrDNA在模版中的丰度，然后采用近江牡蛎类立克次体特异引物进行检测扩增。目的片断的长度约为191bp。
具体实施例方式
取近江牡蛎的鳃组织0.1克，在液氮中研磨成粉状。也可用其他方法粉碎组织。但据我们的实验表明液氮研磨粉碎的效果最好。然后采用爱思进公司的细菌基因组提取试剂盒提取DNA。所取完整的方法步骤阐述如下(以下如非特殊说明，所用试剂均包括在爱思进细菌基因组提取试剂盒中)1、液氮研磨粉碎后的近江牡蛎鳃组织加入300μl已加入RNaseA1的Buffer S中。然后加入10μl的蛋白酶K，浓度为20mg/ml。购买自Takara公司。37℃下保温25分钟。然后加入溶菌酶10μl在37℃继续消化5分钟；2、加入60μl的0.25M的EDTA(pH8.0)混合均匀，然后在冰上放置五分钟，终止酶的作用；3、加入900μl的buffer G-A，剧烈震荡15秒，使溶液混合均匀。然后在65℃水浴中保温10分钟。时间长短可以根据实际情况具体调整，调整的依据就是溶液变得清澈透明，没有悬浮的和沉淀的碎片；4、然后加入800μl的Buffer G-B和2ml的Buffer DV，顺序一定不要弄错，否则无法有效的分相。然后颠倒混匀。然后在离心机上12000×g离心2分钟；5、弃掉上层的蓝色液体，再加入2ml Buffer DV重复上述过程一次，然后将下层的液体转移到滤器中，这个过程避免带入上层的蓝色液体。然后在12000×g离心30秒。过滤的作用是去除变性的蛋白；6、过滤后得到的清澈滤液约有1.2ml，然后加入800μl的Buffer BV轻轻震荡混合均匀。然后加入DNA-prep管子中，12000×g离心30秒。DNA在这个过程中结合到了管子中的膜上；7、然后加入500μl的Buffer W1，12000×g离心30秒，洗一遍，700μl和500μl的BufferW2，12000×g离心30秒各洗一次。然后再12000×g离心一分钟。彻底去除柱子中silica膜上的残余液体。然后加入100μl纯水，放置于55℃5分钟，溶解结合在膜上的DNA，然后离心收集。这样就获得所需的模板DNA。即被称为16SrDNA。
8、两轮套式PCR所用的反应体系均相同。同为25μl。具体成分和试剂来源如下10×Buffer(mg2+) 2.5μldNTP 1μlTaq酶(5U/μl) 0.4μl引物(10umol/L)各0.5μl模板 2μlH2O 18.6μl注Taq酶购买自Takara公司的rTaqTM，引物由上海生工公司合成。
9、第一轮PCR，采用细菌16SrDNA的通用引物。具体序列为正向5’-GCTTAACACATGCAAGTCGA-3’反向5’-GATTACTACCGATTCCGACT-3’
反应条件94℃预变性1分钟，然后94℃变性30秒，56℃退火30秒，然后72℃延伸1分三十秒。扩增的目的产物条带为1300bp左右。
10、第二轮PCR扩增种的模板由第一次扩增的产物稀释十倍后，从中吸取2μl。获得本发明所需要的近江牡蛎类立克次体16SrDNA特异引物，即用于检测近江牡蛎体内病原微生物的寡核苷酸。其序列为(1)正向5’-AGTCTGTGAATAATGGGCTA-3’反向5’-TTATGCAGTTTGGATAGCAC-3’反应条件为94℃预变性1分钟，然后94℃变性30秒，56℃退火30秒，然后72℃延伸30秒。扩增的目的产物条带为200bp左右。
(2)、上述(1)引物，可以被添加或删除一个或几个单核苷酸，但不影响应用于检测病原微生物Oceanrickettsia ariakensis的PCR反应；(3)也可取上述(1)引物的相似度在80％以上的引物，可用于检测病原微生物Oceanrickettsia ariakensis.
11、由上述所得的反应产物在1.8％琼脂糖凝胶中电泳。然后溴化乙锭染色。选取发病海区的牡蛎作为阳性样品，选取健康的，来自于非发病地区的野生近江牡蛎作为对照。拍照结果。如出现特意条带，则说明牡蛎感染有这种病原微生物。
由此，人们必须采取适当措施，以防止或降低受到这种病原微生物感染的近江牡蛎的大规模死亡。
权利要求
1.一对近江牡蛎体内类立克次体PCR检测用的特异引物，其特征是该对序列为AGTCTGTGAATAATGGGCTA；TTATGCAGTTTGGATAGCAC。
2.根据权利要求1所述的特异引物，其特征是添加或删除一个或几个单核苷酸。
3.根据权利要求1所述的特异引物，其特征是相似度在80％以上的引物。
全文摘要
用于PCR检测近江牡蛎病原微生物的特异引物。它是用于应用PCR技术检测寄生于近江牡蛎体内的类立克次体这种病原微生物。本发明从近江牡蛎类立克次体16SrDNA的核酸序列中筛选出一对特异性引物，其序列为AGTCTGTGAATAATGGGCTA；TTATGCAGTTTGG ATAGC AC；上述引物，可以被添加或删除一个或几个单核苷酸，但不影响应用于检测病原微生物Oceanrickettsia ariakensis的PCR反应；或与上述特异性引物相似度在80％以上的引物，且用于检测病原微生物Oceanrickettsia ariakensis。
文档编号C12Q1/68GK1814798SQ20051006185
公开日2006年8月9日 申请日期2005年12月6日 优先权日2005年12月6日
发明者吴信忠, 张扬 申请人:浙江大学