^1)0.5 4 1、5\厶1^1311打6『2 4 1、用0￡?(：水补足至10y 1 ；
[0050] 按照上述体系，进行 42°C下 60min、95°C下 4min、4°C下 5min。
[0051] S23,将步骤S22反转录完成后的产物，进行PCR扩增；扩增体系按照：步骤S30的 反转录cDNA模板3 y l、20pmol/ y 1的引物P1、竞争性引物P3各1 y 1，dNTP 2 y 1、Taq酶 0? 5 y 1 (5U/ y 1)、DD-H20 12. 5 y 1 ;
[0052] 将上述体系于95°C下60s、66°C下次40s、72°C下45s，以上步骤重复循环28次后 于72°C下5min即可。
[0053] S24,在步骤S23扩增完成之后，得到的扩增的条带是否具有靶序列的cDNA，且得 到的该cDNA的量是多少，需要进行验证和计算，在该步骤S24中进行，具体可以按照：
[0054] 将步骤S23得到的扩增产物经3%琼脂糖电泳，于紫外分析仪下切割目的条带，按 试剂盒说明操作回收竞争模板，测定含量，同时分别以引物P1和引物P2为引物对回收的竞 争模板进行PCR，用以确定经竞争模板的合适用量，分装后作为竞争模板_80°C冻存，备用；
[0055] S30,获取一待测患者的外周血单个核细胞（大致也按照与步骤S11中相同的细胞 浓度约为2X 106/ml)，然后直接用RNA试剂盒提取总RNA(A260nm/A280nm>l. 7)，并参照步 骤S22相同的体系进行反转录，获取待测cDNA模板；
[0056] S40,将步骤S30获得的待测cDNA模板3 y 1、以及同样量步骤S24制备的竞争模板 混合，混合后用引物P1和引物P2进行PCR扩增；其中PCR的体系和具体过程参见步骤S23 的实施细节进行。
[0057]S50，为了步骤S40进行对照，将步骤S30获得的待测cDNA模板3 y 1用引物P4和 引物P5进行PCR扩增，该步骤中PCR扩增体系也参考步骤S23的PCR体系进行；
[0058] 该步骤S50的PCR是为了检测待测cDNA模板中0 -actin的mRNA量的情况，用来 作为步骤S40中IL-4的对照。
[0059] S60,按上述步骤S40和步骤S50进行竞争性RT-PCR的产物，经3%琼脂糖电泳，在 SX-100image system上摄像、以已知浓度的竞争模板定标作密度定量，推知相应mRNA的相 对含量。
[0060] 经过计算和比对，上述步骤S11中健康人经过2. 0 ymol/L的|丐离子载体和80ng/ ml PMA诱导7h后，其细胞中IL-4的mRNA为8. 10±0. 61ng作为对比参照（选用诱导之后 的健康细胞作为参照是因为不经过诱导而直接测的细胞中IL-4的mRNA为0. 18±0. 13ng， 其表明健康人单个核细胞的IL-4基本上是不表达的，而且这个检测结果名显方差过大，因 此不太能用作定量参考），而待测细胞中IL-4的mRNA为6. 73±0. 58ng。
[0061] 同样再检测IL-4的ELISA免疫试剂盒检测上述步骤S30获取的待测的细胞中 IL-4的mRNA为4. 18 ±0. 43ng，这个结果比上述检测的方法得到的结果明显低了约38 %，所 以本发明的上述检测上可能更能体现真实的表达水平。
[0062] 其中本发明的上述实施例1中进行检测的过程是用于检测组织细胞的相关肿瘤 化或者癌变的情况，而进一步本发明的上述方法过程用于检测IL-4的大量生产制备的发 酵培养的细胞和种子细胞的IL-4表达水平时，也可以用上述同等的方法构建对照和待测， 从而得到所要检测的发酵培养的细胞和种子细胞的IL-4表达水平。具体的实施过程参见 上述过程替换实施即可，这一部分不再赘述。
[0063] 采用上述方法的过程通过引物平P1和引物P2扩增的IL_4cDNA靶片段长474bp， 而用引物P1和引物P3扩增的管家基因长454bp，比靶片段短22bp ;竞争模板与靶片段序列 差异小，在作竞争PCR时可将影响因素降至低水平，从而使检测结果更能反映样本的真实 情况；且所用的竞争模板与靶序列电泳位置接近，为判断RT-PCR产物电泳条带提供了较理 想的参照物，可避免对非特异性条带的误判通过测定电泳带的密度，即可对靶序列的扩增 产物进行定量，从而推知所测样本中相应mRNA的含量，更加接近真实的表达水平。
[0064] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种IL-4检测引物，其特征在于，包括具有序列表SEQ. ID. No. 1碱基序列的引物 Pl、具有序列表SEQ. ID. No. 2碱基序列的引物P2。2. 如权利要求1所述的IL-4检测引物，其特征在于，还包括具有序列表SEQ. ID. No. 3 碱基序列的竞争性引物P3。3. -种IL-4检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的IL-4检测引物。4. 如权利要求3所述的IL-4检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括具有序列表 SEQ. ID. No. 4碱基序列的引物P4、具有序列表SEQ. ID. No. 5碱基序列的引物P5。5. 如权利要求3或4所述的IL-4检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RNase 抑制剂，且该RNase抑制剂为焦碳酸二乙酯。6. 如权利要求3或4所述的IL-4检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PMA和 /或钙离子载体。7. -种IL-4半定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 获取IL-4对照组细胞和IL-4待测组细胞； 提取所述IL-4对照组细胞的总RNA，并用具有序列表SEQ. ID. No. 1碱基序列的引物Pl 和具有序列表SEQ. ID. No. 3碱基序列的竞争性引物P3进行RT-PCR，得到竞争模板； 提取所述IL-4待测组细胞的总RNA，并进行反转录获得待测cDNA模板； 将所述待测cDNA模板和竞争模板混合后，用具有序列表SEQ. ID. No. 1碱基序列的引物 Pl和具有序列表SEQ. ID. No. 2碱基序列的引物P2进行PCR，得到靶序列扩增产物。8. 如权利要求8所述的IL-4半定量检测方法，其特征在于，将所述待测cDNA模板和竞 争模板混合后，用具有序列表SEQ. ID. No. 1碱基序列的引物Pl和具有序列表SEQ. ID. No. 2 碱基序列的引物P2进行PCR步骤之后，还包括： 将所述待测cDNA模板用具有序列表SEQ. ID. No. 4碱基序列的引物P4和具有序列表 SEQ. ID. No. 5碱基序列的引物P5进行RCR，得到对照扩增产物。9. 如权利要求8所述的IL-4半定量检测方法，其特征在于，将所述待测cDNA模板用具 有序列表SEQ. ID. No. 4碱基序列的引物P4和具有序列表SEQ. ID. No. 5碱基序列的引物P5 进行RCR步骤之后，还包括： 根据靶序列扩增产物和对照扩增产物计算所述IL-4待测组细胞中IL-4的mRNA量。
【专利摘要】本发明提供了一种IL-4检测引物，包括具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的引物P1、具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的引物P2。本发明的上述引物基于基因表达过程中编码IL-4的mRNA合成远先于分泌的IL-4蛋白产物，且蛋白质的表达量的多少与对应编码的mRNA的量成线性正比的关系；通过RT-PCR方式扩增对应编码的mRNA，再通过mRNA的量即可得到对应IL-4蛋白产物的量；其检测的不是IL-4分泌、吸附、消耗和降解后的净含量，而是IL-4产生过程中基因转录、翻译及翻译后调控机制的实时定点水平；其能更真实和准确反应细胞或组织内实时的IL-4表达水平。在上述引物的基础上，本发明还进一步提出包括上述IL-4检测引物检测试剂盒、以及利用上述引物进行半定量检测的方法。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105039548
【申请号】CN201510448282
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月28日