半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质的数量和质量是影响小麦面粉品质的重要因素。小麦种子储藏蛋白主要由麦醇溶蛋白(Gliadin)和麦谷蛋白(Glutenin)组成，麦谷蛋白又分为高分子量麦谷蛋白亚基(HMff-GS)和低分子量麦谷蛋白亚(LMff-GS)，亚基间通过二硫键结合形成谷蛋白大聚合体，赋予面团独特的粘弹性和延展性[Payne P I，Law C N，Mudd E E.Controlbyhomo1gous group lchromosomes of the high—molecular—weight subunits ofglutenin，a majorprotein of wheat endosperm.Theor Appl Genet，1980，58:113-120 ;Wrigley C ff.Giant proteinswith flour power.Nature，1996，381:738-739 ；GianibelliM C7 Larroque 0 R，MacRitchie F.B1chemical，genetic，molecular characterizat1nof wheat glutenin and its component subunits.Cereal Chem，2001，78:635-646]，可以加工成面包、面条和糕点等多种食品。遗传和生化研究表明，高分子量谷蛋白的组成和数量与小麦面包加工品质密切相关[Payne P I，Law C N，Mudd E E.Control by homologousgroup lchromosomes of the high—molecular—weight subunitsof glutenin， a majorprotein of wheat endosperm.Theor Appl Genet，1980，58:113-120 ；Payne PI?Geneticsof wheat storage proteins and the effect of allelic variat1n on bread makingquality.Ann Rev Plant Phys1l，1987，38:141-153 ;Radovanovic N，Cloutier S，BrownD，et al.Geneticvariance for gluten strength contributed by high molecularweight glutenin proteins.CerealChem.2002，79:843-849] 0 高分子麦谷蛋白基因位点Glu-1位于第I同源群染色体长臂，在A、B、D组染色体上含有相应的Glu-Al、Glu-Bl和Glu-Dl同源基因复合位点，每个Glu-1位点又包含分别编码X-和y_型高分子麦谷蛋白亚基的 2 个紧密连锁基因[Payne P I，Lawrence G J.Catalogue of alleles forthe complex loci， Glu-Al? Glu-Bland Glu-Dl? hichcode for high—molecular—weightsubunits of glutenin in hexaploid wheat.Cereal Res Comm，1983，11:29-35 ;ShewryPR， Halford NG and Tatham A S.The high-molecular-weightsubunits of wheatglutenin.Journal of Cereal Science，1992，15 (2):105-120]。Payne 首先建立了小麦高分子量谷蛋白亚基(对)对面筋品质贡献的评分系统，如Axl/Ax2*和Dx5是目前公认的面包小麦优质亚基[Payne P I，Genetics of wheat storage proteins and the effectof allelicvariat1n on bread making quality.Ann Rev Plant Phys1l，1987，38:141-153] o研究表明，等位基因Glu-Blal编码的超表达Bx7亚基(Bx70E)能显著提高面筋强度[Butow BJ，Ma W，GaleKR? et al.Molecular discriminat1n of Bx7allelesdemonstrates that a highly expressedhigh-molecular-weight glutenin allelehas a major impact on wheat flour dough strength.TheorAppl Genet，2003，107:31524-1532]，含有Bx70E的小麦育成品种或地方品种通常都具有更好的面筋强度[VawserM J，Cornish G B.0verexpress1n of HMW glutenin subunit Glu_B17x inhexaploidwheat varieties(Triticum aestivum).Austral J Agric Res，2004，55:577-588 ;Lukow0M，Forsyth S A，Payne P 1.0ver-product1n of HMW glutenin subunits coded onchromosomeIB in common wheat，Triticum aestivum.J Genet Breed，1992，46:187-192 ;Radovanovic N，Cloutier S，Brown D，Humphreys D G，Lukow 0 M.Genetic variance forgluten strengthcontributed by high molecular weight glutenin proteins.CerealChem，2002，79:843-849]。发掘和利用Bx70E已成为进一步改良小麦品质的重要途径，目前发达国家优质小麦育种计划正加强利用这一基因。
[0003]普通小麦中的Bx70E亚基来自南美的一个地方品种，中国小麦品种几乎不含有这一亚基。通过杂交聚合育种引入Bx70E、Dx5等优质亚基，是快速改良我国小麦品质的有效途径。SDS-PAGE是分离和鉴定HMW-GS的传统方法，但不能有效鉴别分子量大小和迁移率十分接近的亚基[Shewry P R，Halford N G and Tatham A S.Thehigh-molecular-weightsubunits of wheat glutenin.Journal of Cereal Science，1992，15 (2):105-120]，且费工费时。近年来，随着大量的HMW-GS基因被克隆，主要等位基因的 DNA 分子标记也相应被建立[Ahmad M.Molecular marker-assisted select1nof HMff glutenin alleles related to wheat breadquality by PCR-generatedDNA markers.Theor Appl Genet，2000，101:892-896 ;De Bustos A, Rub1 P，JouveN.Molecular characterisat1n of the inactive allele of the gene Glu-Alandthedevelopment of a set of AS-PCR markers for HMff glutenins of wheat.TheorAppl Genet，2000，100:1085-1094]，利用连锁分子标记鉴定亚基组成更加方便、准确、可靠。然而在我国现有育种条件下，相对表型鉴定而言，分子标记辅助选择技术因成本较高未能真正用于育种实践。与单个基因分子标记的PCR鉴定方法相比，多重PCR(multiplexPCR)技术体系含有多个基因标记引物，通过一次反应能够对多个性状基因进行鉴定，实验成本明显降低，工作效率显著提高[Moczulski M, Salmanowicz BP(2003)Multiplex PCRidentificat1n of wheatHMff glutenin subunit genes by allele-specific markers.Theor.App1.Genet.44(4):459-471]。
[0004]目前，小麦高分子量谷蛋白亚基的鉴定方法有多种。其中，SDS-PAGE电泳是经常采用的方法，该方法简单易学，并可以对每一样品所有亚基及其表达量进行鉴定。但该方法比较耗时，而且容易对分子量不同而迀移率相近的亚基造成误判。用于小麦研究的多重PCR技术主要涉及与品质相关的高(低)分子谷蛋白亚基基因、籽粒硬度基因和淀粉酶基因等，分子标记法是根据不同高分子量谷蛋白亚基序列的差异设计特定的引物，对小麦基因组DNA进行PCR扩增，该方法高效快捷，克服了 SDS-PAGE电泳的一些缺点。然而，该方法有时不能区分杂交后代的某一基因位点是否纯合，而且如果操作不当，还会出现假阳性或假阴性。另外，由于分子标记一次只能鉴定1-2个高分子量谷蛋白亚基等位基因，虽然有的学者采用多重PCR—次鉴定多个亚基，但不是所有高分子量谷蛋白亚基都可用多重PCR进行鉴定。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术中的缺陷，解决现有的小麦高分子量谷蛋白亚基的鉴定方法的鉴定速度慢，检测准确率低的问题，本发明提供了一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，本方法利用远离胚部的1/3?1/2粒种子先提取DNA进行分子标记，再提取蛋白进行SDS-PAGE电泳，使样品得到充分利用，能快速筛选到既含5+10亚基，又含1，17+18亚基的小麦植株。同时，分子标记和SDS-PAGE电泳结果相互验证，所得结果准确可靠。
[0006]为解决上述技术问题，本发明技术方案如下:
[0007]一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，包含如下步骤:
[0008]步骤一:小麦籽粒DNA的提取
[0009]a.切取1/3?1/2粒小麦种子，研磨，加入DNA提取缓冲液，水浴，每隔5分钟上下颠倒I次；冷却至室温，离心；
[0010]b.取上清液加入醋酸铵和乙醇，上下充分颠倒，离心；
[0011]C.弃上清液，加入乙醇，上下缓慢颠倒7?8次，离心；
[0012]d.弃上清液，于室温下充分干燥；
[0013]e.加双蒸水溶解DNA;
[0014]步骤二:高分子量谷蛋白亚基的PCR反应
[0015]Pf -GCCTAGCAACCTTCACAATC-3'，P25' -GAAACCTGCTGCGGACAAG-3'；
[0016]10亚基的引物序列为:
[0017]P35, -GTTGGCCGGTCGGCTGCCATG-3' ，P45, -TGGAGAAGTTGGATAGTACC-3'；
[0018]PCR反应体系为 25yL，含 IyL 提取的 DNA，lXBuffer，2mmol/L MgCl2，每种 dNTP各为 0.8mmol/L，每种引物各为 0.2 μ mol/L, Taq 酶 1.5U ；
[0019]PCR反应条件为:95°C预变性3min，94°C变性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸45s?Imin, 35个循环，最后72°C再延伸5min ；
[0020]步骤三:高分子量谷蛋白亚基的SDS - PAGE电泳及检测
[0021]选经PCR检测5+10亚基纯合籽粒的沉淀物，1000rpm离心2min，弃上清液，加入300 μ L蛋白质提取液，于高通量组织研磨仪上震荡30s，再沸水浴lOmin，取出冷却至室温，1000rpm离心lOmin，取上清液；
[0022]高分子量谷蛋白亚基的检测:采用不连续SDS-PAGE电泳，浓缩胶浓度为3%，分离胶浓度为8 %，交联度为3.33%。
[0023]进一步的，所述步骤一具体为:
[0024]a.用干净刀片切取1/3?1/2粒小麦种子，放入1.5mL离心管中，同时放入I粒直径为4.0mm的钢珠，于高通量组织研磨仪上1500rpm研磨3min，加入700 μ L DNA提取缓冲液，65°C水浴约30min，其间每隔5分钟上下颠倒I次；冷却至室温，13000rpm离心15min ；
[0025]b.取500 μ L上清液于一新的1.5mL离心管中，加入50 μ L 10mol/L醋酸钱和ImL95%乙醇，上下充分颠倒，13000rpm离心1min ；
[0026]c.弃上清液，加入ImL 70%乙醇，上下缓慢颠倒7?8次，13000rpm离心2min ；
[0027]d.弃上清液，于室温下充分干燥；
[0028]e.加30 μ L双蒸水溶解DNA。
[0029]进一步的，所述DNA提取缓冲液为